基于數(shù)據(jù)挖掘和分子對接技術探討中藥干預 AD的用藥規(guī)律

楊婭妮,湯家明,李潤芝,蔚洪恩,,3*

(1山西中醫(yī)藥大學第三臨床學院腦病教研室,太原 030024;2山西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3腦疾病防治山西省重點實驗室;*通訊作者,E-mail:hongen.wei@sxmu.edu.cn)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種老年期最常見的慢性疾病,臨床表現(xiàn)主要有漸進性認知功能障礙、語言與記憶障礙、人格改變等[1]。中醫(yī)將 AD納入“呆病”“健忘”的范疇,認為腎精虧虛,腦髓消減,神機失用是 AD的基本病機[2]。有研究報告顯示,截至2019年底我國現(xiàn)存 AD患者已經(jīng)超過1 000萬,而2050年,全球?qū)?.52億人患有癡呆,其中2/3為 AD患者[3,4]。據(jù)估計,2030年全球用于癡呆的治療與護理費用將增至2萬億美元[5]。因此, AD的預防與治療問題必須得到重視。然而 AD的發(fā)病機制尚不完全清楚,目前認為是多途徑參與的復雜機制共同導致。目前 AD可能的發(fā)病機制有β淀粉樣蛋白毒性學說、tau蛋白過度磷酸化學說、炎癥學說、氧化應激學說等[6]。在藥物治療方面,膽堿酯酶抑制劑治療輕、中度 AD,如多奈哌齊、利斯的明等,美金剛作為重度 AD治療藥物[7]。但是目前臨床用藥選擇有限,品種較為單一,并且多具有惡心、胸悶、心慌等副作用,對于 AD只是癥狀上的暫時緩解,并不能根治疾病。因此我們迫切需要找到能夠治療 AD且副作用小的新藥物,而作為傳統(tǒng)文化瑰寶的中醫(yī)藥可為其提供新思路。

中藥因其多成分、多靶點、多途徑的治療特點,在疾病治療中能有效降低毒副作用,在臨床應用中具有良好的效果。近年來,中藥對于 AD的治療取得很大進展,但是因中藥有效成分復雜,對于疾病藥效的作用基礎以及用量的把控難以進行系統(tǒng)性的深入研究。2007年,來自英國的Hopkins[8]首次提出“網(wǎng)絡藥理學”一詞,并于2008年發(fā)表相關文章表示網(wǎng)絡藥理學是“下一代藥物研發(fā)模式”[9]。目前網(wǎng)絡藥理學被廣泛應用于藥物和中藥活性化合物發(fā)現(xiàn)、藥物組合和方劑配伍規(guī)律解析等方面,為中藥體系研究指明了新道路,同時也為臨床合理用藥、新藥研發(fā)等提供了新的理論與技術支撐[10]。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法,以 AD相關疾病靶點作為切入點,檢索匹配出相對應的化合物和中藥,構(gòu)建并分析了核心靶點、化合物、中藥三者之間的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)關系,而后通過分子對接進行驗證,初步探尋中藥治療 AD的一般規(guī)律,為中醫(yī)藥干預 AD的基礎理論提供了現(xiàn)代醫(yī)學證據(jù),同時也為后續(xù)治療時中藥的選擇、中醫(yī)復方加減配伍的選擇、后續(xù)新藥開發(fā)及中西醫(yī)結(jié)合臨床治療提供了思路。

1 材料與方法

1.1 AD相關疾病靶點獲取

通過檢索文本挖掘DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/),以“Alzheimer’s disease”為檢索詞,獲取阿爾茨海默病相關靶點,通過微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)獲取交集靶點,作為潛在靶點。將潛在靶點輸入Unipot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢各潛在靶點全稱。

1.2 候選化合物篩選及靶點-化合物網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖的構(gòu)建

在中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為條件篩選出可作用于 AD相關疾病靶點的化合物作為候選化合物,并保存為MOL2格式文件,再將其導入OpenBabel-2.4.1軟件轉(zhuǎn)化為pdb格式文件,為后期分子對接做準備。同時將候選化合物、靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡,并對網(wǎng)絡節(jié)點進行整理分析。本次研究涉及的TCMSP平臺是一個全新的以系統(tǒng)藥理學為基礎的中藥研究平臺及數(shù)據(jù)庫,囊括了《中國藥典》(2010)注冊的所有499種中草藥,和其所含的共29 384個成分化合物,13 144個分子,給出了所有收錄的中草藥的組分和分子結(jié)構(gòu)、關鍵 ADME參數(shù)、成分作用靶點以及相關疾病等關鍵信息[11]。

1.3 核心靶點與候選化合物的分子對接驗證

為了進一步驗證篩選出的靶點及其配體關系的可信度,將靶點-化合物網(wǎng)絡中度值前四的核心靶點與所有的候選化合物進行分子對接。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)查詢出4種核心靶點的3D結(jié)構(gòu),并與候選化合物的pdb格式文件一起導入AutoDockTools-1.5.7進行分子對接,得到靶點與化合物的3D對接圖。若結(jié)合力<0 kcal/mol,表明配體分子能與受體蛋白進行自發(fā)的結(jié)合,但是目前對于高結(jié)合性分子的篩選標準尚無統(tǒng)一規(guī)定[12,13]。再將已經(jīng)對接好的靶點-化合物文件轉(zhuǎn)化為pdb格式,導入LigPlus生成2D結(jié)構(gòu)進行對比觀察。

1.4 中藥篩選及靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

為了進一步整合中藥和化合物及疾病靶點之間的關系,通過Cytoscape 3.9.1中的merge插件將靶點-化合物網(wǎng)絡、化合物-中藥網(wǎng)絡進行合并,構(gòu)建出“靶點-化合物-中藥”網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖。

1.5 中藥數(shù)據(jù)整理以及頻數(shù)分析

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中匹配出潛在靶點的對應中藥材,參照“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》[14]以及中國藥典2020年版[15]中對中藥的性味歸經(jīng)進行頻數(shù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 疾病靶點篩選結(jié)果

通過檢索DisGeNET數(shù)據(jù)庫以及OMIM數(shù)據(jù)庫收集 AD相關疾病靶點,在微生信網(wǎng)站進行交集獲得 AD靶點69個(見圖1)。其中在TCMSP數(shù)據(jù)庫中能匹配到化合物,且DL≥0.18,OB≥30%的靶點共有11個,將這11個靶點定義為潛在靶點,其基本信息見表1。

表1 Uiport數(shù)據(jù)庫阿爾茨海默病潛在靶點的基本信息

DisGeNET OMIM

2.2 靶點-化合物網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖的構(gòu)建

以“可關聯(lián)至相關靶點”“DL≥0.18”以及“OB≥30%”為條件在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出26個候選化合物。在Cytoscape 3.9.1中導入潛在靶點和候選化合物繪制靶點-化合物網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖(見圖2),將度值前四的靶點定義為核心靶點。分別是白介素6(interleukin-6,IL-6)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白介素10(interleukin-10,IL-10)、尿激酶型纖溶酶激活劑(urokinase-type plasminogen activator,PLAU)。候選化合物信息見表2,度值前六的化合物分別為槲皮素(quercetin,度值7)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,度值5]、木犀草素(luteolin,度值3)、漆黃素(fisetin,度值3)、芝麻素(sesamin,度值2)、青藤堿(sinomenine,度值2)。這些化合物可作用于多個 AD相關蛋白,活躍性更強,可作進一步研究。

表2 阿爾茨海默病的候選化合物信息

圖中綠色為潛在靶點,黃色為候選化合物,節(jié)點大小以該節(jié)點度值為標準,度值越大,節(jié)點越大

2.3 中藥的獲取結(jié)果及靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡的構(gòu)建

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫將26個候選化合物進行匹配,共獲得380味中藥,其中有47味藥物未被“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》及中國藥典2020年版收錄,除此之外廣棗、天山雪蓮、冬葵果3味中藥僅記錄性味而無歸經(jīng),對此50味中藥進行排除,故最終收集到330味中藥,其中篩選出的中藥度值不小于4的有35個(見圖3)。通過候選化合物的橋接作用收集各個中藥的靶點,結(jié)果顯示銀杏葉、菟絲子、夏枯草、香附、白果、半枝蓮、浮萍、苦參、連翹、木蝴蝶、山豆根包含的靶點較多,因此推測11種中藥對 AD發(fā)病機制具有一定的調(diào)控作用。本研究通過選取中藥(度值≥4)及相關化合物、靶點來構(gòu)建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖(見圖4)。其中,銀杏葉、菟絲子等中藥度值較高,與 AD的靶點以及化合物關聯(lián)更為密切。

中藥度值

圖中橢圓形節(jié)點表示靶點,長方形節(jié)點表示化合物,菱形節(jié)點表示中藥,中藥的度值越大,節(jié)點越大

2.4 核心靶點與候選化合物的分子對接驗證結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得26個候選化合物的成分結(jié)構(gòu),導入AutoDockTools-1.5.7進行分子對接驗證。對接結(jié)果的結(jié)合熱力圖顯示4個核心靶點與其已知的配體對接得分最高分別是EGFR-MOL003187(6.76分)、IL10-MOL003187(5.46分)、PLAU-MOL003187(5.78分)、IL6-MOL005944(5.97分)(見圖5)。為了更好地展現(xiàn)其靶點分子結(jié)構(gòu),在4個靶點中選擇各自結(jié)合力最強的進行2D和3D結(jié)構(gòu)展示,結(jié)果見圖6。

EGFR:表皮生長因子受體;IL-10:白介素10;PLAU:尿激酶型纖溶酶激活劑;IL-6:白介素6;圖中顏色越紅代表結(jié)合力越強

右側(cè)鏈接的綠色虛線表示氫鍵作用,紅色虛線表示疏水作用,字母表示結(jié)合位點氨基酸

2.5 中藥性味歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計

共收集到中藥380味,其中能在“十三五”規(guī)劃教材《中藥學》以及中國藥典2020年版中查詢到的中藥共330味,查詢這些中藥的性味、歸經(jīng)等信息并進行頻數(shù)統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示可能對 AD進行調(diào)節(jié)的中藥以苦味藥最多,其次為辛味、寒味和甘味,出現(xiàn)頻率共計67.99%;藥性方面則以寒性中藥數(shù)目最多(見圖7)。從歸經(jīng)來看,歸肝經(jīng)的中藥最多,占22.80%,其次是歸肺經(jīng),占17.10%,歸肝、肺經(jīng)的藥物共計39.90%(見圖8)。

圖7 可能對阿爾茨海默病進行調(diào)節(jié)的中藥歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計

圖8 可能對阿爾茨海默病進行調(diào)節(jié)的中藥性味頻次統(tǒng)計散點圖

3 討論

阿爾茨海默病是一種慢性神經(jīng)退行性疾病[16],其致病因素較多、病理機制復雜。目前對于 AD的發(fā)病機制,相關中藥新藥研究也在逐步推進。但是新藥的研發(fā)往往是一個需要消耗大量的人力與財力的長期過程,而現(xiàn)有的醫(yī)療模式是針對所有患者的單一疾病、單一靶點、單一藥物和單一療法,成本高昂[17],因此中藥因“多成分”“多靶點”“多途徑”的優(yōu)勢在 AD的臨床治療中發(fā)揮著重要作用。本研究基于DisGeNET、OMIM、Uniport等多個數(shù)據(jù)庫,以 AD疾病靶點為核心,匹配出對應的化合物和中藥,擬通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術,構(gòu)建并分析靶點-化合物-中藥的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖,總結(jié)出中藥治療 AD的一般規(guī)律。

以DL≥0.18和OB≥30%為條件篩選出的候選化合物中槲皮素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、木犀草素、漆黃素、芝麻素、青藤堿,這6種化合物均包含抗氧化及抗炎的作用,對于 AD的發(fā)病機制中的氧化應激學說和炎癥學說較為吻合。其中槲皮素已經(jīng)被證明可作為一種新的治療氧化應激神經(jīng)退行性疾病的藥物,它能夠抑制炎癥因子和MDA、Keap1的水平,抑制氧化應激反應,從而改善含有3個突變等位基因(PS1、APP、Tau)的純合子(3×Tg-AD)小鼠的認知功能障礙[18]。在腦卒中的治療中,槲皮素清除多余的活性氧,維持線粒體的功能,保護神經(jīng)元[19]。同時,構(gòu)建的網(wǎng)絡中,另一種化合物青藤堿目前研究多應用于類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病,而來自重慶醫(yī)科大學的張毅及其研究團隊[20]發(fā)現(xiàn),青藤堿保護海馬神經(jīng)元免受腦出血處理的小膠質(zhì)細胞介導的間接毒性,其抗炎和腦保護作用機制也為腦出血的潛在治療提供了新的線索。由此可見,中藥防治 AD具備很大的潛能,并且所篩選的候選化合物中有許多可從常見的植物及食物中獲取,成本相對較低。因此本研究也對 AD的食療具有一定的指導意義。

分子對接結(jié)果顯示:4個核心靶點與26種成分均能夠進行對接,這說明靶點與配體有較強的結(jié)合力,證明靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡關系結(jié)果是可靠的。而分子對接結(jié)合能熱力圖顯示,對接結(jié)果良好,達到了一定的結(jié)合活性標準。其中表皮生長因子受體(EGFR)與26種成分整體對接活性較高,提示其可作為潛在有效的治療靶點。目前有研究證實了EGFR過度的激活與許多的神經(jīng)退行性疾病有關,而EGFR抑制劑能夠減輕Aβ的毒性以及改善神經(jīng)炎癥,但因其血腦屏障滲透性較差,仍需進一步研究[21]。對于這一劣勢,中醫(yī)有著獨特的見解。據(jù)《素問玄機原病式》記載:“玄府者,無物不有,人之臟腑、皮毛、肌肉、筋膜、骨髓、爪牙,至于世之萬物,盡皆有之,乃氣出入升降之道路門戶也?！睂⑿x為通行氣機、調(diào)節(jié)氣血津液運行的通道。腦作為元神之府,總領五臟之神,腦玄府開闔功能正常是大腦發(fā)揮正常生理功能的結(jié)構(gòu)基礎,其功能類似于血腦屏障[22]。中藥引經(jīng)及方劑配伍,能夠做到因人制宜,引藥入腦,開通腦玄府,使得藥物通過血腦屏障作用于腦疾病靶點,因而EGFR靶點可作為潛在的中藥治療阿爾茨海默病的作用靶點,值得更進一步的研究。

根據(jù)中藥的性味、歸經(jīng)等信息的頻數(shù)統(tǒng)計分析可知, AD機制與肝經(jīng)、肺經(jīng)關系緊密。在治療方面則可多考慮苦、寒味藥的應用。所篩選的中藥中,銀杏葉、菟絲子、夏枯草、香附、白果、半枝蓮、浮萍、苦參、連翹、木蝴蝶、山豆根這11味中藥調(diào)控多個阿爾茨海默病的核心靶點?，F(xiàn)代藥理學對于銀杏葉基礎研究較多,研究證明銀杏葉具有擴張血管、拮抗血小板活化因子、保護缺血損傷及抗炎等多種藥理作用,在腦功能障礙、腦外傷后遺癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和清除氧自由基等方面具有確切的療效[23]?？鄥⒅卸喑煞?、多部位均具有抗氧化作用[24,25],韓亞非等[26]發(fā)現(xiàn)苦參素能夠通過抑制海馬神經(jīng)元凋亡改善及降低氧化應激損傷來改善慢性腦缺血大鼠學習記憶能力。

綜上所述,本研究以 AD的疾病靶點為出發(fā)點,通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術的方法,初步探討了中藥干預 AD的一般用藥規(guī)律,為后期繼續(xù)深入研究EGFR等相關靶點以及作用機制提供了一定的理論基礎。然而本研究主要是通過挖掘數(shù)據(jù)庫以及計算機軟件計算獲得的數(shù)據(jù)來構(gòu)建網(wǎng)絡,無法顧及實際應用時中藥的劑量、一些毒性作用以及中藥復方加減配伍的計量搭配等因素,具有一定局限性,因此具體結(jié)果仍需進一步驗證。