黃粉蟲不同酶解液及其抗氧化作用的比較研究

張 玲，宋艷軍， 韓基明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西太原 030031；2.中陽縣仁味仁農(nóng)產(chǎn)品加工有限公司，山西呂梁 033400）

黃粉蟲是一種人工養(yǎng)殖的昆蟲，繁殖速度快，俗稱面包蟲，營養(yǎng)豐富，尤其是蛋白含量高達(dá)50%左右，且研究表明黃粉蟲具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂等多種功效作用[1-2]，目前主要作為飼料在飼養(yǎng)上應(yīng)用較多，附加值相對較低[3]。黃粉蟲蛋白酶解的研究較多，主要通過酶解蛋白的方式制備抗氧化肽、抗菌肽、降血壓肽和抗腫瘤肽等生物活性肽[4-6]。以黃粉蟲為原料，選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶水解黃粉蟲蛋白，比較各種酶水解液中多肽得率及其總抗氧化能力的強(qiáng)弱，為黃粉蟲蛋白肽制備過程中酶的選擇及功能作用的研究提供基礎(chǔ)的理論參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

黃粉蟲，中陽縣仁味仁農(nóng)產(chǎn)品加工有限公司提供；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，中國醫(yī)藥上海化學(xué)有限公司提供；四肽標(biāo)準(zhǔn)品（Gly-Gly-Tyr-Arg），DPPH，Sigma 公司提供；總超氧化物歧化酶（T-SOD），南京建成公司提供；總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒，南京建成公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP224C 型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；HPG-9075 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；JB-3 型磁力攪拌器，上海智光儀器儀表有限公司產(chǎn)品；PHBJ-260 型便攜式pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；LD5-10 型低速離心機(jī)，北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；SSW 型電熱恒溫水槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；JDG-0.2 型真空冷凍干燥機(jī)，蘭州科技真空冷凍干燥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黃粉蟲蛋白的制備

堿提酸沉法：黃粉蟲烘干粉碎，乙醚脫脂后溶于20 倍的蒸餾水中，用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)pH值至8.5，不斷攪拌30 min 并保持其pH 值不變，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心20 min，取上清液，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為4，室溫下以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心20 min，沉淀出的蛋白用蒸餾水洗滌，重復(fù)2 次。之后將蛋白的水溶液調(diào)節(jié)pH 值至7（提高蛋白質(zhì)的溶解性），冷凍干燥得黃粉蟲蛋白粉。

2.2 黃粉蟲蛋白含量及成分的測定

水分的測定[7]：常壓直接干燥法（GB/T 5009.3—2003）；脂肪的測定[8]：索氏抽提法（GB/T 5009.6—2003）；蛋白質(zhì)的測定[9]：微量凱氏定（GB/T 5009.5—2003）；灰分的測定[10]：高溫灼燒法（GB/T 5009.4—2003）。

2.3 黃粉蟲酶解液中多肽含量的測定

（1）四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[11]。取10 個10 mL 的容量瓶，用5%的TCA 依次配制0，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00 mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取6.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入4.0 mL 雙縮脲試劑，混合均勻，靜置10 min，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min，取上清液于波長540 nm處測定OD 值（以第一管做空白對照）。以肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），OD 值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）酶解液多肽含量的測定。取2.5 mL 樣品溶液，加入2.5 mL 10%（W/V）的三氯乙酸（TCA）水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，然后以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中，并用5%的TCA 定容至刻度，搖勻。然后取6.0 mL 上述溶液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0 mL（樣液∶雙縮脲試劑=3∶2，V/V），于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min，取上清液于波長540 nm處測定OD 值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中的多肽質(zhì)量濃度（mg/mL），進(jìn)而可求得樣品中多肽含量。

2.4 黃粉蟲蛋白水解酶的酶解條件

根據(jù)公司提供的各種酶的作用范圍，選擇各種蛋白酶的較佳酶解條件，分別測定酶解過程中多肽含量的變化，從而篩選出適合黃粉蟲蛋白水解的酶類。分別稱取黃粉蟲蛋白1 g，加水50 mL，按以下各酶的酶解條件進(jìn)行酶解。

胰蛋白酶酶解條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，酶添加量2%，pH 值8.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h。

木瓜蛋白酶酶解條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，酶添加量2%，pH 值7.0，酶解溫度60 ℃，酶解時間2 h。

中性蛋白酶酶解條件：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，酶添加量2%，pH 值7.0，酶解溫度60 ℃，酶解時間2 h。

酶解結(jié)束后，沸水浴10 min 滅酶，冷卻離心，取上清液得黃粉蟲酶解液待測。

2.5 黃粉蟲酶解液中SOD 酶活的測定

按照試劑盒說明書測定。測定原理是通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-），O2-可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在560nm 處有吸收，SOD 可清除O2-，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深，說明SOD 活性越低，反之活性越高。

2.6 黃粉蟲酶解液總抗氧化活性的測定

目前，總抗氧化能力測定試劑盒有2 種方法，F(xiàn)RAP 法和ABTS 法，F(xiàn)RAP 法的測定原理：酸性條件下抗氧化物質(zhì)可以還原Fe3+-TPTZ 產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，于波長593 nm 處測定吸光度可以計(jì)算出樣品中總抗氧化能力，其總抗氧化能力用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示。ABTS 法測定原理：ABTS 在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS·+，在抗氧化物存在時，ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，在波長405 nm 或734 nm 處測定ABTS·+的吸光度即可測定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。Trolox 作為參考標(biāo)準(zhǔn)，其是一種VE 的類似物，具有和VE 相近的抗氧化能力。按照試劑盒說明書測定，試驗(yàn)選取2 種方法對黃粉蟲酶解液的總抗氧化能力進(jìn)行測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃粉蟲蛋白粉基本成分分析

黃粉蟲蛋白粉的基本成分見表1。

表1 黃粉蟲蛋白粉的基本成分 /W/W，%

由表1 可知，經(jīng)堿提酸沉法制備的黃粉蟲蛋白粉的蛋白質(zhì)含量達(dá)到了88%以上，脂肪含量1.08%，其水分含量為6.04%，灰分含量2.85%。

3.2 黃粉蟲酶解液中多肽得率分析

Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

由四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為Y=0.317 7X+0.023 4，R2=0.995 2。由回歸方程可計(jì)算出黃粉蟲不同酶解液中多肽的質(zhì)量濃度。

黃粉蟲不同酶解液中多肽質(zhì)量濃度見圖2。

圖2 黃粉蟲不同酶解液中多肽的質(zhì)量濃度

由圖2 可知，經(jīng)胰蛋白酶水解后的黃粉蟲酶解液中多肽的含量最高，其質(zhì)量濃度可達(dá)0.8 mg/mL 左右。計(jì)算得出黃粉蟲分別經(jīng)胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后其多肽得率分別為79.6%，60.4%，64.8%，胰蛋白酶酶解黃粉蟲蛋白的多肽得率最高。

3.3 黃粉蟲酶解液中SOD 酶活的分析

黃粉蟲酶解液中SOD 酶活的分析見圖3。

圖3 黃粉蟲酶解液中SOD 酶活的分析

圖3 為黃粉蟲蛋白經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解后其酶解液中SOD 酶活分別為82.03，82.31，82.73 U/mL，差異不明顯。SOD 廣泛存在于動物、植物和微生物細(xì)胞中，不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。目前，SOD 可作為抗氧劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑在食品添加劑中應(yīng)用。

3.4 黃粉蟲酶解液抗氧化活性的分析

總抗氧化能力（T-AOC）標(biāo)準(zhǔn)曲線（FRAP 法）見圖4，總抗氧化能力（T-AOC）標(biāo)準(zhǔn)曲線（ABTS法）見圖5。

圖4 總抗氧化能力（T-AOC）標(biāo)準(zhǔn)曲線（FRAP 法）

圖5 總抗氧化能力（T-AOC）標(biāo)準(zhǔn)曲線（ABTS 法）

由圖4 和圖5 可知，其回歸方程分別為Y=0.283 8X+0.073 4，R2=0.993 6 和Y=-0.156 9X+1.111 4，R2=0.990 2。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出黃粉蟲蛋白各酶解液中總抗氧化能力，分別用相當(dāng)于FeSO4和Trolox 的濃度來表示。

不同酶解液總抗氧化能力（FRAP）見圖6，不同酶解液總抗氧化能力（ABTS）見圖7。

圖7 不同酶解液總抗氧化能力（ABTS）

黃粉蟲胰蛋白酶酶解液的總抗氧化能力為：相當(dāng)于1.575 3 mmol/L 的FeSO4，0.917 3 mmol/L的Trolox；木瓜蛋白酶酶解液的總抗氧化能力為：相當(dāng)于0.939 4 mmol/L的FeSO4，0.746 6 mmol/L的Trolox；堿性蛋白酶酶解液的總抗氧化能力為：相當(dāng)于1.038 3 mmol/L的FeSO4，0.881 0 mmol/L的Trolox。

4 結(jié)論

黃粉蟲蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后其酶解液中的多肽得率及總抗氧化能力均高于其他酶解液，這可能是因?yàn)橐鹊鞍酌妇哂袠O強(qiáng)的專一性和特異性，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷[12]，而Katsuhiro Kudo 等人[13]研究發(fā)現(xiàn)土豆蛋白酶解物中分離出的3 個抗氧化肽片段，其羧基端都為Arg。張玲等人[14]分離出的2 個歐李仁抗氧化肽片段，其羧基端也都為Arg。末端為Arg 的肽片段可能有較好的抗氧化功能。但這3 種不同酶解液中SOD 酶活均為82.0 U/mL 左右，差異不明顯。這可能是因?yàn)辄S粉蟲酶解后高溫滅酶，SOD 酶活隨溫度升高酶的活力下降，但SOD 酶的熱穩(wěn)定性較好，仍有部分活性殘留[15]。