HS-SPME-GC-MS 條件優(yōu)化及北京鴨揮發(fā)性風味物質分析*

張麗燕，劉萬軍，朱紹輝，王洪玲，肖發(fā)沂**

[1.青島菲優(yōu)特檢測有限公司，山東 青島 266100；2.巴迪泰（青島）生物科技有限公司，山東 青島 266100；3.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東 濰坊 261061；4.孟村縣畜牧局，河北 滄州 061000]

我國是鴨肉生產(chǎn)和消費的大國，肉鴨的年出欄量占全球總出欄量80%以上[1]。北京鴨作為肉鴨品種的杰出代表，是我國優(yōu)良的快大型肉鴨品種，肉質鮮嫩，皮脂豐厚，是北京烤鴨的主要原料[2]，市場占有率很高。目前，鴨肉揮發(fā)性風味的研究報道主要集中在板鴨[3]、鹽水鴨[4]、醬鴨[5]等加工后熟食制品，對生鮮鴨肉中揮發(fā)性物質的研究較少。揮發(fā)性風味物質是影響生鮮鴨肉風味的重要因素之一，由于香氣物質具有痕量、易揮發(fā)且組成復雜的特點，通常采用固相微萃—氣相色譜—質譜聯(lián)用法進行分析[6-8]。

固相微萃取 ( Solid phase micro-extraction，SPME) 是20 世紀90 年代興起的一種樣品前處理與富集技術，是一種集萃取、濃縮、進樣于一體的分析方法[9]，該方法具有操作簡便快捷、樣品用量少、無溶劑殘留、對待測物選擇性高、靈敏度高、變異系數(shù)小等優(yōu)點[10]。SPME 通過使用一根細的熔融石英纖維絲或在細的熔融石英纖維絲上涂上一層具有選擇性的聚合物薄膜，從分析基質中萃取待測物，待萃取結束以后，直接將萃取頭插入進樣口進行檢測，可明顯提高檢測效率。

固相微萃取法有三種基本的萃取模式，即直接萃取、頂空萃取、膜保護萃取。頂空萃取的原理：被測組分受熱從固相或液相擴散至氣相，之后被萃取頭的石英纖維固定相萃取、富集。頂空固相微萃取模式（HS-SPME）可以有效避免固定相被樣品基質中的高分子物質和不揮發(fā)性物質污染[11]，減輕雜質干擾，提高萃取效率，適合所有基質的試樣中揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質的測定[12]。

影響HS-SPME 結果的因素有很多，如萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間、樣品取樣量等均會對結果產(chǎn)生不同程度的影響。本研究采用頂空固相微萃取技術結合氣相質譜分析法，以北京鴨胸肉為研究材料，以萃取頭類型、樣品取樣量、萃取溫度和萃取時間為試驗變量，對HS-SPME 模式進行優(yōu)化，并用優(yōu)化后的方法探究北京鴨胸肉的揮發(fā)性風味物質組成。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

北京鴨購于某農貿市場，現(xiàn)殺處理后，取鴨胸肉為試驗材料，-20 ℃冷凍保存。

1.2 儀器設備

手動固相微萃?。⊿PME）進樣器和萃取纖維頭：美國Supelco 公司；TQ8040 三重四極桿氣相色譜質譜聯(lián)用儀：日本島津公司；DB-5MS 彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗 以單因素變量為原則，分別測試不同類型萃取頭（75 μm CAR/PDMS、85 μm Polyacrylate、100 μm PDMS）、不同取樣量（2、4、6 g）、不同萃取溫度（40、50、60、70℃)、不同萃取時間（3、35、40、45 min）下的質譜檢測結果，通過比較峰面積和物質峰數(shù)量，選擇最合適的HS-SPME 條件。

1.3.2 樣品處理 將樣品室溫解凍，勻質后準確稱取適量樣品于潔凈的20 mL 頂空萃取瓶中，封蓋，置于恒溫水浴鍋中。將老化處理后的固相微萃取進樣器萃取頭插入瓶中，推出纖維頭并保證纖維頭不直接接觸樣品及瓶壁，用頂空吸附萃取的方式對揮發(fā)性物質進行吸附。吸附結束后縮回纖維頭，迅速將萃取頭插入氣相色譜質譜聯(lián)用儀進樣口端，再次推出纖維頭，250℃解析8 min 并啟動氣相色譜質譜聯(lián)用儀進行色譜分離和質譜數(shù)據(jù)采集。

1.3.3 色譜、質譜條件 色譜柱：DB-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫箱溫度35 ℃；汽化室250 ℃；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度35 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升溫至180℃，保持2 min，以10 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min。載氣：高純氦氣（He），純度99.999%；載氣流量1 mL/min；流量控制方式：恒線速度模式；進樣方式：不分流進樣。

離子源：EI 源；電子能量70 ev；離子源溫度200℃；接口溫度250 ℃；檢測器電壓：1.00 KV；質量分析器：單四極桿；采集方式：scan；質量掃描范圍：35~500 amu。

2 數(shù)據(jù)分析方法

將GC-MS 采集到的物質峰逐一進行人工解析，將物質峰質譜圖與NIST17 標準譜庫中的標準質譜圖進行相似度比對以定性，并用面積歸一化法計算出樣品中各組分的相對含量以定量。

單因素試驗中，試驗所得數(shù)據(jù)用Microsoft office Excel 2016 進行統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)匯總。

3 結果分析

3.1 不同類型萃取頭的比較

固相微萃取進樣器的核心部分是萃取頭，不同類型萃取頭內的纖維材料及涂層特性存在巨大差異，對不同組分的萃取吸附能力不同，是影響HS-SPME 萃取效果的關鍵因素[13]。本試驗中，我們選取三種不同類型的萃取頭，其他變量條件不變，采集的GC-MS 色譜圖見圖1，總峰面積及物質峰數(shù)量見表1。由表1 可知，75 μm CAR/PDMS萃取頭的可定性揮發(fā)性物質峰的總峰面積是85 μm Polyacrylate 萃取頭的1.9 倍，是100 μm PDMS 萃取頭的3.1 倍，而且 75 μm CAR/PDMS 萃取頭物質峰數(shù)量最多。由此可見，與其他兩種萃取頭相比，75μm CAR/PDMS 萃取頭更適用于北京鴨胸肉揮發(fā)性風味物質分析。

表1 不同萃取頭的萃取結果比較

圖1 3種萃取頭的GC-MS總離子流圖（詳見附錄彩圖）

3.2 不同取樣量的比較

頂空樣品瓶上方氣相體積的大小對萃取效果有重大影響。研究表明，當氣相體積小于樣品瓶總體積的1/3 時，隨著氣相體積的減小，試驗結果的精密度降低，重復性變差[14]，而氣相體積過大也會使萃取效率降低。本試驗中，我們設置了3 種不同的取樣量，其他變量條件不變，采集的GC-MS 色譜圖見圖2，總峰面積及物質峰數(shù)量見表2。由表2 可知，3 種取樣量的物質峰數(shù)量均為30 個左右，4 g 時略有優(yōu)勢。而從總峰面積來看，取樣量為4 g 時的總峰面積明顯高于其他兩者，說明2 g 時香味成分濃度不夠，而6 g 時樣品過于緊實，不利于香味物質擴散入氣相。因此，4 g 為20 mL 頂空萃取瓶的最適取樣量。

表2 不同萃取頭的萃取結果比較

3.3 不同萃取溫度的比較

萃取溫度對萃取效果的影響是雙方面的，較低的萃取溫度不利于揮發(fā)性物質擴散至氣相，而過高的溫度又會降低萃取纖維頭的吸附能力，使萃取效果變差。本試驗中，我們設置了4 種不同的萃取溫度，其他變量條件不變，采集的GC-MS色譜圖見圖3，總峰面積及物質峰數(shù)量見表3。由表3 可知，萃取溫度為 40 ℃時，總峰面積最小，物質峰數(shù)量也較少，推測原因可能是低溫不利于揮發(fā)性成分揮出。隨著溫度的升高，總峰面積明顯增加，物質峰數(shù)量也逐漸增多，60 ℃時的總峰面積達到最大，物質峰數(shù)量最多。當萃取溫度升至70 ℃時，總峰面積和物質峰數(shù)量均陡然下降，說明此溫度下萃取頭的吸附能力已下降。由此可見，60 ℃為最佳萃取溫度。

表3 不同萃取溫度的萃取結果比較

圖3 4種萃取溫度的GC-MS總離子流圖（詳見附錄彩圖）

3.4 不同萃取時間的比較

隨著萃取時間的延長，萃取纖維頭的吸附量呈上升趨勢，直至達到萃取平衡狀態(tài)，此時繼續(xù)延長萃取時間，反而會引起個別不穩(wěn)定物質變性出逃。本試驗中，我們設置了4 種不同的萃取時間，其他變量條件不變，采集的GC-MS 色譜圖見圖4，總峰面積及物質峰數(shù)量見表4。由表4 可知，萃取時間為 30 min 時，總峰面積和物質峰數(shù)量最少，隨著萃取時間的延長，總峰面積和物質峰數(shù)量逐漸增加，40 min 時達到最大量，之后繼續(xù)延長萃取時間，總峰面積和物質峰數(shù)量反而略有下降。由此可見，40 min 為最佳萃取時間。由上述單因素試驗結果可知，使用75μm CAR/PDMS 萃取頭，稱取4 g 樣品，60℃萃取40 min，是北京鴨胸肉揮發(fā)性風味物質分析的最佳HSSPME 條件。

表4 4 種萃取時間的GC-MS 總離子流圖（詳見附錄彩圖）

3.5 HS-SPME-GC-MS 分析北京鴨胸肉的揮發(fā)性物質成分

采用優(yōu)化后的HS-SPME 條件，經(jīng)DB-5MS色譜柱分離，GC-MS 共采集到37 種可定性的揮發(fā)性物質組分，經(jīng)NIST17 標準譜庫檢索和相似度比對，結合人工譜圖解析，鑒定出的化合物及含量信息見表5、表6。

表5 北京鴨胸肉的揮發(fā)性物質組分信息

表6 北京鴨胸肉的揮發(fā)性物質組分信息

胡強等從水煮甜皮鴨的鴨胸肉中鑒定出31 種揮發(fā)性成分，且以醛類為主，其次為酮類、醇類[7]。張琳等從三黃雞肉中鑒定出59 種揮發(fā)性化合物，醛類最多，其次為酮類、烴類[15]。采用優(yōu)化后的HS-SPME-GC-MG 分析法，本試驗鑒定出的北京鴨胸肉的主要風味物質以醛類和醇類為主，其中1-壬醇、（Z）-癸-2-烯醛、2－十一烯醛、月桂醇、十四醛、正十五碳醛、正辛醛等含量較高，占總含量的一半以上，而烴類化合物和雜環(huán)芳烴類化合物含量較低。肉類中的醛類化合物大多數(shù)來源于脂質氧化，是脂肪降解的主要產(chǎn)物之一。因具有脂肪香味，且閾值較低，是肉類揮發(fā)性香氣的主要來源[16]。醇類化合物一般是由脂質氧化和蛋白質水解產(chǎn)生的，而肉食品中的醇類化合物主要來自脂質氧化[17]。本研究鑒定出來的醇類包括飽和醇與不飽和醇，飽和醇因風味閾值較高，對香味的貢獻較少，而不飽和醇的風味閾值一般較低，故對風味的貢獻較大。烴類化合物，特別是直鏈烴類因閾值較高，一般認為對食品香氣無明顯貢獻，但有些可能是形成雜環(huán)化合物的重要中間體，有助于提高整體風味[18]。雜環(huán)化合物來源復雜，含量低，對鴨肉整體揮發(fā)性風味只起到輔助和修飾作用。

4 結論

本研究通過對萃取頭類型、取樣量、萃取溫度、萃取時間進行比較，優(yōu)化了頂空固相微萃取條件，確定了HS-SPME-GC-MS 法測定北京鴨胸肉揮發(fā)性風味物質的最優(yōu)條件為：采用75μm CAR/PDMS萃取頭，稱取4 g 樣品，60℃恒溫萃取40 min。采用優(yōu)化后的頂空微萃取條件對北京鴨胸肉中的揮發(fā)性物質組分進行萃取，借助氣相色譜-質譜聯(lián)用技術進行分離和分析，本研究共檢測出37 種揮發(fā)性風味物質，分別為醛類、醇類、烴類和雜環(huán)芳烴類，其中醛類化合物含量居首，其次為醇類，此兩類化合物是北京鴨胸肉香味的主要貢獻者。