基于微生物菌群調(diào)控的枯草芽孢桿菌改善低鹽發(fā)酵魚露品質(zhì)作用機(jī)制

李 琰，李文靜，李春生*，楊大俏，王悅齊，王 迪，陳勝軍，吳燕燕，李來好*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；3.三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南省深遠(yuǎn)海漁業(yè)資源高效利用與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572018）

魚露是一種以低值海捕魚類為主要原料，經(jīng)長時(shí)間自然發(fā)酵制得的水產(chǎn)調(diào)味品[1]。魚露風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，是東南亞地區(qū)和我國南方沿海一帶最受歡迎的調(diào)味品之一。為抑制腐敗微生物的生長和代謝，傳統(tǒng)的魚露發(fā)酵工藝通常采用高鹽鹽漬（加鹽量為25%～30%）的發(fā)酵方式[2]。在傳統(tǒng)發(fā)酵魚露發(fā)酵過程中，耐鹽微生物（主要是耐鹽細(xì)菌）通過其復(fù)雜的生化代謝途徑產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，進(jìn)而產(chǎn)生魚露獨(dú)特的風(fēng)味。然而，由于高鹽對微生物代謝的抑制作用，依靠自然發(fā)酵過程促使魚露形成獨(dú)特風(fēng)味所需要的時(shí)間過長，通常需要1～3 a，而且品質(zhì)易受發(fā)酵環(huán)境影響而不穩(wěn)定，極大地限制了魚露產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。因此，如何縮短魚露發(fā)酵周期是目前我國魚露產(chǎn)業(yè)亟待解決的難題。

低鹽發(fā)酵是目前快速發(fā)酵魚露常用的方式，而且低鹽魚露產(chǎn)品符合現(xiàn)代低鹽健康飲食的理念。然而，由于加鹽量較低，無法有效抑制腐敗微生物的生長，魚露容易腐敗變質(zhì)，因此需要添加合適的微生物發(fā)酵劑。目前魚露微生物發(fā)酵劑多選用高產(chǎn)蛋白酶的菌株，主要包括枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）[4-5]、動(dòng)性球菌屬（Planococcus）[6]、青霉菌屬（Penicillium）[7]、嗜鹽桿菌屬（Halobacterium）[8]等。但是多數(shù)菌株產(chǎn)蛋白酶能力低，特別是在高鹽環(huán)境下存在蛋白酶易失活等問題，限制了其在魚露產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。此外，發(fā)酵菌株的添加能夠改變發(fā)酵微環(huán)境，影響微生物菌群結(jié)構(gòu)，但是目前大多研究集中在加菌發(fā)酵對魚露品質(zhì)的影響，而忽略了對發(fā)酵過程發(fā)酵菌株的監(jiān)測以及加菌后對微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響[9-10]，難以確定魚露品質(zhì)的改善機(jī)制。

課題組前期從傳統(tǒng)發(fā)酵魚露中篩選得到1 株高產(chǎn)蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B-2，該菌具有很強(qiáng)的耐鹽性并在高鹽條件下具有較穩(wěn)定的產(chǎn)蛋白酶能力[11]，具有改善低鹽魚露品質(zhì)的應(yīng)用潛力。因此，本研究以B.subtilisB-2為魚露發(fā)酵劑，研究加菌發(fā)酵對低鹽魚露發(fā)酵過程中微生物菌群、生物胺和氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）的影響，通過構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步闡述B.subtilisB-2加菌發(fā)酵對低鹽發(fā)酵魚露品質(zhì)的影響機(jī)制，以期為我國傳統(tǒng)發(fā)酵魚露的提質(zhì)增效提供重要理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B.subtilisB-2為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，分離自汕頭魚露廠有限公司的傳統(tǒng)魚露發(fā)酵液[11]；冰鮮藍(lán)圓鲹 廣州市華潤萬家（客村店）；FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設(shè)備

809 Titrando型自動(dòng)點(diǎn)位滴定儀 瑞士萬通公司；L C-2 0 A D 高效液相色譜儀 日本島津公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) 美國NanoDrop公司；3 K 3 0 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國S i g m a 公司；Mastercycler nexus型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)圓鲹魚露的制備

將冰鮮藍(lán)圓鲹用絞肉機(jī)絞碎，按照18%（m/m）的比例加入食用鹽，混勻后均分成兩組備用。將菌株B.subtilisB-2培養(yǎng)3 d，于4 ℃、12 000×g離心10 min，用0.85%無菌生理鹽水重懸，將菌體按106CFU/g的終濃度加入到其中一組原料中，攪拌均勻，作為低鹽加菌發(fā)酵組（B）。向另一組原料中加入相同體積的無菌生理鹽水用于魚露的自然發(fā)酵，作為低鹽自然發(fā)酵組（C）。將混勻的兩組原料放入玻璃發(fā)酵罐中，用8 層紗布覆蓋，每5 d攪拌一次，在35 ℃自然發(fā)酵45 d。發(fā)酵前取魚糜（B0和C0）用于微生物菌群分析。在發(fā)酵5（B5和C5）、10（B10和C10）、15（B15和C15）、30（B30和C30）、45 d（B45和C45）后分別取魚露發(fā)酵液，于4 ℃、12 000×g離心15 min，上清液用于AAN和生物胺的測定，下層菌體沉淀用于微生物菌群分析。

1.3.2 生物胺含量的測定

取1.0 g魚露發(fā)酵上清液，加入3.0 mL的HCl溶液（0.1 mol/L）混勻，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液定容到5.0 mL，制成生物胺提取液。取1.0 mL生物胺提取液，加入1.5 mL碳酸鹽緩沖液（pH 11.0），加入1.0 mL DNS-Cl的丙酮溶液（10 g/L），在40 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)1 h。加入0.20 mL脯氨酸溶液（100 g/L）混勻，室溫反應(yīng)1 h后，加入3.0 mL正庚烷混勻。待液體分層后取1.0 mL上層液，氮?dú)獯蹈桑?.0 mL色譜級甲醇溶解，微濾（0.22 μm）后備用。利用LC-20AD高效液相色譜儀檢測樣品中生物胺含量，色譜柱為反相色譜柱ChromCoreTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，將55%甲醇溶液作為流動(dòng)相平衡色譜柱，設(shè)置進(jìn)樣體積為20.0 μL。紫外檢測波長254 nm，隨后以0.8 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序參考Zhao Yue等[12]的方法。根據(jù)8 種生物胺的保留時(shí)間和峰面積，對魚露中的生物胺進(jìn)行定量分析。

1.3.3 AAN的測定

參照文獻(xiàn)[13]的電位滴定法并稍作修改。取1.0 mL魚露發(fā)酵上清液，用超純水定容至100 mL，混勻備用。使用809 Titrando型自動(dòng)點(diǎn)位滴定儀測定AAN含量。設(shè)置電位滴定儀自動(dòng)加甲醛5 mL，固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性后，用NaOH滴定，根據(jù)堿液消耗量計(jì)算樣品中AAN含量。

1.3.4 微生物群落分析

采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒，提取樣品中微生物群落的DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測D N A 的純度。使用引物3 3 8 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min；最后在4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行純化，純化的PCR擴(kuò)增子在Illumina MiSeq PE300平臺(tái)（Illumina，USA）上進(jìn)行成對末端測序[14]。數(shù)據(jù)在Majorbio Cloud（Majorbio，China）在線平臺(tái)上進(jìn)行分析。通過Fastp v0.19.6對原始測序讀數(shù)進(jìn)行分解復(fù)用和質(zhì)量過濾，然后用Flash v1.2.11進(jìn)行合并。采用Mothur v1.30.2對微生物菌群的α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，基于主成分分析（principal component analysis，PCA）對微生物菌群的β多樣性進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 加菌發(fā)酵對低鹽魚露發(fā)酵過程微生物菌群α多樣性的影響

α多樣性指數(shù)是分析微生物菌群豐富度和均勻度的重要指標(biāo)，主要包括覆蓋率、Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。覆蓋率代表高通量測序結(jié)果的覆蓋程度，該值越接近1，說明測得的微生物菌群結(jié)果越真實(shí)[16]。由圖1可知，每個(gè)魚露樣品的覆蓋率均在0.99以上，說明樣品中絕大多數(shù)微生物都被檢測到，測序準(zhǔn)確性較好。Sobs指數(shù)表示觀察到的OTU數(shù)[16]，該指數(shù)可以直觀表現(xiàn)樣品中微生物菌群的豐富度。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，低鹽自然發(fā)酵組的Sobs指數(shù)均呈逐漸降低的趨勢，表明微生物菌群的豐富度逐漸降低。加菌發(fā)酵后，微生物菌群在每個(gè)發(fā)酵時(shí)間的Sobs指數(shù)均顯著降低。ACE指數(shù)和Chao指數(shù)同樣用于評價(jià)魚露樣品中物種的豐富度[17]。與Sobs指數(shù)的變化趨勢相似，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，Chao指數(shù)和ACE指數(shù)在低鹽自然發(fā)酵組中逐漸降低，且加菌發(fā)酵后顯著降低，結(jié)果表明B.subtilisB-2加菌發(fā)酵可以顯著降低微生物菌群的豐富度。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映微生物群落的均勻度[18]。結(jié)果顯示，低鹽自然發(fā)酵組微生物菌群的Shannon指數(shù)明顯高于低鹽加菌發(fā)酵組，而Simpson指數(shù)則明顯高于低鹽加菌發(fā)酵組，表明B.subtilisB-2加菌發(fā)酵可以顯著降低魚露中微生物菌群的均勻度。綜合上述α多樣性指數(shù)，加菌發(fā)酵后魚露中微生物群落的豐富度和均勻度都呈降低趨勢，表明B.subtilisB-2加菌發(fā)酵后能夠顯著抑制魚露發(fā)酵過程中大多數(shù)微生物菌群的生長。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間下低鹽自然發(fā)酵魚露和低鹽加菌發(fā)酵魚露中微生物菌群的α多樣性指數(shù)變化Fig.1 Changes in α diversity indexes of microbial community in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times

2.2 加菌發(fā)酵對低鹽魚露發(fā)酵過程微生物菌群β多樣性的影響

微生物菌群β多樣性分析可以用于評價(jià)不同樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)的相似性[18]。基于PCA解析加菌發(fā)酵對低鹽魚露發(fā)酵過程微生物菌群β多樣性的影響，結(jié)果如圖2所示。可以看出，低鹽加菌發(fā)酵組與低鹽自然發(fā)酵組微生物菌群差異明顯；低鹽自然發(fā)酵組的微生物菌群在發(fā)酵前期（C0、C5、C10、C15）與后期（C30、C45）也顯示出較明顯的差異，而加菌發(fā)酵組的微生物菌群在整個(gè)發(fā)酵期間差異不明顯。結(jié)果表明，低鹽自然發(fā)酵魚露樣品中微生物群落組成不穩(wěn)定，在發(fā)酵前期的優(yōu)勢微生物，在發(fā)酵后期逐漸被其他微生物菌屬替代，導(dǎo)致微生物群落組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；而對于加菌發(fā)酵組，添加B.subtilisB-2后魚露微生物群落組成更加穩(wěn)定，在整個(gè)發(fā)酵過程中變化較小。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間下低鹽自然發(fā)酵魚露和低鹽加菌發(fā)酵魚露中微生物菌群的β多樣性分析Fig.2 β-Diversity analysis of microbial community in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times

2.3 加菌發(fā)酵對低鹽魚露發(fā)酵過程微生物群落組成的影響

微生物種類和比例對魚露的品質(zhì)和風(fēng)味均有較大影響[19]。因此，本研究對魚露發(fā)酵過程中的微生物種類進(jìn)行監(jiān)控，對魚露品質(zhì)的改善有重要作用。

由圖3 A 可知，在低鹽自然發(fā)酵組的魚露樣品中Proteobacteria和Cyanobacteria是主要的門類，且Proteobacteria的豐度隨著發(fā)酵時(shí)間延長逐漸增加，在發(fā)酵后期相對豐度達(dá)到64.89%。由圖3B可知，在屬水平上，共監(jiān)測到31 個(gè)主要的微生物屬（相對豐度＞0.1%），其中原料魚中（C 0）豐度最高的為C y a n o b i u m、Pseudomonas、Synechococcus、Delftia。Cyanobium的豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長先上升后下降，發(fā)酵5 d相對豐度為44.90%，在發(fā)酵45 d下降至12.46%。Pseudomonas在發(fā)酵前期占比很小，在發(fā)酵至45 d代替Cyanobium，成為最主要的菌屬，說明Pseudomonas可能更適合在低鹽發(fā)酵魚露環(huán)境中生長。在以鳀魚為原料的韓國傳統(tǒng)魚露（Myeolchi-Aekjeot）中占絕對優(yōu)勢的是Halanaerobium和Lactobacillus[20]，在以鳀魚為原料的我國傳統(tǒng)發(fā)酵魚露中占絕對優(yōu)勢的是Halococcus、Halanaerobium、Halomonas和Tetragenococcus[21]，而本研究以藍(lán)圓鲹為原料的低鹽發(fā)酵魚露中上述菌屬均不是核心菌屬，這說明原料魚體攜帶的和發(fā)酵環(huán)境中的微生物以及鹽度對后續(xù)發(fā)酵過程中微生物種類的影響較大。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間下低鹽自然發(fā)酵魚露和低鹽加菌發(fā)酵魚露中微生物菌群在門（A）和屬（B）上相對豐度變化Fig.3 Change in relative abundance of microbial community in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times at the phylum (A) and genus (B) levels

由圖3A可知，F(xiàn)irmicutes在加菌發(fā)酵魚露整個(gè)發(fā)酵過程的相對豐度均超過75%，是發(fā)酵過程中的主要微生物門類。由圖3B可知，在屬水平上，僅檢測到12 個(gè)主要的微生物屬（相對豐度＞0.1%），其中Bacillus始終占主導(dǎo)地位，發(fā)酵起始（B0）的相對豐度達(dá)到96.16%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長先下降后上升，在發(fā)酵末期達(dá)到93.69%；其次是Pseudomonas和Stenotrophomonas。與低鹽自然發(fā)酵組相比，加菌發(fā)酵后微生物多樣性顯著降低，表明B.subtilisB-2具有很強(qiáng)的生存能力，可以抑制低鹽發(fā)酵環(huán)境中Cyanobium、Synechococcus、Achromobacter等腐敗微生物的生長。

2.4 加菌發(fā)酵對低鹽魚露發(fā)酵過程生物胺含量的影響

生物胺廣泛存在于發(fā)酵食品中，主要是由游離氨基酸在微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶催化下脫羧基形成的[22]。生物胺也是我國魚露中重要的質(zhì)量安全評價(jià)指標(biāo)，控制生物胺對于提升魚露的品質(zhì)具有重要意義[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)自然發(fā)酵魚露中含有較高的組胺、酪胺、腐胺和尸胺[24]。在本研究發(fā)現(xiàn)相似的研究結(jié)果，組胺、腐胺、尸胺和酪胺是低鹽自然發(fā)酵魚露中的關(guān)鍵生物胺（圖4）。在發(fā)酵5 d，魚露樣品中各生物胺含量都很低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，8 種生物胺含量均有所增加。在低鹽自然發(fā)酵魚露中，組胺、酪胺、苯乙胺、色胺、亞精胺和精胺的含量呈先增長后下降的趨勢，而腐胺和尸胺的含量均在發(fā)酵末期達(dá)到最大。組胺和酪胺作為毒性最強(qiáng)的生物胺，過量攝入會(huì)導(dǎo)致血壓異常、消化系統(tǒng)紊亂、頭痛和神經(jīng)中毒[25]。食品法典委員會(huì)規(guī)定，魚露中的組胺不得超過400 mg/kg[22]。本研究中，低鹽自然發(fā)酵魚露中組胺和酪胺的含量均在發(fā)酵30 d達(dá)到最大，分別為289.2 mg/kg和271.56 mg/kg，在發(fā)酵末期組胺下降至275.16 mg/kg，酪胺下降至260.05 mg/kg，表明低鹽自然發(fā)酵魚露的安全性符合食品法典委員會(huì)的規(guī)定。雖然尸胺和腐胺本身沒有毒性，但它們可以增加組胺的毒性[26]。高濃度的尸胺和腐胺可能會(huì)增加生物胺中毒的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，高鹽發(fā)酵魚露在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（發(fā)酵12 個(gè)月）組胺、酪胺、腐胺、苯乙胺、色胺、亞精胺和尸胺含量分別為121.97、93.49、81.22、2.90、10.52、13.29 mg/kg和133.75 mg/kg[24]。結(jié)果表明，除了尸胺，發(fā)酵末期（45 d）低鹽魚露中其他生物胺的濃度明顯高于高鹽魚露，特別是組胺、酪胺和腐胺。因此，未來對低鹽魚露的研究應(yīng)著重于控制這些生物胺，以減少其潛在的毒性。在低鹽加菌發(fā)酵魚露中，多數(shù)生物胺含量的變化趨勢與低鹽自然發(fā)酵魚露相似，但是大多數(shù)生物胺的含量顯著下降，特別是組胺、腐胺、尸胺和酪胺等關(guān)鍵生物胺，其含量在發(fā)酵末期分別下降了25.9%、35.6%、23.6%和9.3%。結(jié)果表明，B.subtilisB-2加菌發(fā)酵的低鹽魚露具有更高的安全性。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間下低鹽自然發(fā)酵魚露和低鹽加菌發(fā)酵魚露中生物胺和AAN含量變化Fig.4 Changes in concentrations of biogenic amines and amino acid nitrogen in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at different fermentation times

2.5 加菌發(fā)酵對低鹽魚露發(fā)酵過程AAN含量的影響

AAN含量是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，是魚露最主要的品質(zhì)指標(biāo)之一，氨基酸含量越高，表明魚露的品質(zhì)越高、鮮味越好[27]。加菌對低鹽魚露發(fā)酵過程AAN含量的影響如圖4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，低鹽自然發(fā)酵魚露和低鹽加菌發(fā)酵魚露的AAN含量均呈顯著增加的趨勢。當(dāng)發(fā)酵10 d，低鹽自然發(fā)酵魚露的AAN質(zhì)量濃度達(dá)到0.73 g/100 mL，根據(jù)SB/T 10324—1999《魚露》[13]，達(dá)到二級魚露的標(biāo)準(zhǔn)（＞0.65 g/100 mL）；發(fā)酵30 d，AAN質(zhì)量濃度達(dá)到0.92 g/100 mL，達(dá)到國家一級魚露標(biāo)準(zhǔn)（＞0.9 g/100 mL）。袁樹昆[28]對低鹽魚露（鹽度為18%）發(fā)酵過程中的AAN進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，在發(fā)酵30 d，AAN超過1.2 g/100 mL，達(dá)到一級魚露標(biāo)準(zhǔn)，與本研究結(jié)果相似。與傳統(tǒng)發(fā)酵魚露相比，降低鹽濃度可以提高發(fā)酵速度，這可能是因?yàn)閭鹘y(tǒng)發(fā)酵魚露的高鹽環(huán)境抑制了微生物的生長和代謝[29]，而在低鹽環(huán)境下微生物生長和代謝較快，且微生物菌群更為豐富，魚肉蛋白質(zhì)的分解速度加快。因此，對于AAN指標(biāo)來說，低鹽發(fā)酵具有明顯優(yōu)勢。與低鹽自然發(fā)酵魚露相比，加菌發(fā)酵魚露的AAN含量明顯增加，其中發(fā)酵15 d的AAN質(zhì)量濃度可達(dá)到1.23 g/100 mL，超過一級魚露的AAN含量標(biāo)準(zhǔn)，而此時(shí)自然發(fā)酵魚露的AAN質(zhì)量濃度僅為0.79 g/100 mL，為二級魚露。在泰國傳統(tǒng)發(fā)酵食品thua-nao[30]中也有相似的結(jié)果，添加B.subtilis可以提高AAN含量，發(fā)酵速率更高。這可能是因?yàn)锽.subtilisB-2具有很高的耐鹽性并且所產(chǎn)的蛋白酶在高鹽條件下仍具有較強(qiáng)的活力[11]，因此可以加速原料魚蛋白分解為氨基酸，從而促進(jìn)AAN的形成。結(jié)果表明，B.subtilisB-2加菌發(fā)酵可以有效縮短低鹽魚露發(fā)酵時(shí)間并且提升其品質(zhì)。

2.6 低鹽魚露品質(zhì)指標(biāo)與微生物菌屬間的相關(guān)性分析

微生物代謝在傳統(tǒng)發(fā)酵食品品質(zhì)形成上發(fā)揮著核心作用。為研究低鹽自然發(fā)酵魚露和加菌發(fā)酵魚露品質(zhì)形成機(jī)制，本研究首先利用P e a r s o n相關(guān)性檢驗(yàn)研究主要微生物菌屬、8 種生物胺、AAN、α多樣性指數(shù)間的相關(guān)性。如圖5A所示，在低鹽自然發(fā)酵組中，3 1 個(gè)微生物菌屬分成2 個(gè)明顯的聚類，包括聚類1（Bacillus、Staphylococcus、Vagococcus、Rhizobium、Ralstonia、Paraburkholderia、Actinomarina、Peptoniphilus、Ornithinimicrobium、Pontibaca、Paracoccus、Aequorivita、Psychrobacter、Roseovarius、Clostridiisalibacter、Delftia、Gallicola、Peptostreptococcus、Dietzia、Brevibacterium、Brachybacterium、Cyanobium、Synechococcus、c h l o r o p l a s t）和聚類2（S t e n o t r o p h o m o n a s、Rhodococcus、Achromobacter、Brucella、Pseudomonas、Tetragenococcus、Erysipelothrix）。聚類1中的大部分微生物菌屬與Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、苯乙胺和色胺呈正相關(guān)，與Simpson指數(shù)、AAN、組胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺和精胺呈負(fù)相關(guān)，聚類2中的大部分微生物菌屬則反之。結(jié)果表明，低鹽自然魚露發(fā)酵過程中微生物豐富度和均勻度的下降可能是由聚類1中微生物菌屬豐度的下降引起，而發(fā)酵過程AAN和關(guān)鍵生物胺（組胺、腐胺、尸胺、酪胺）的增加主要可能是由聚類2中微生物菌屬的代謝引起。如圖5B所示，在加菌發(fā)酵組中，12 個(gè)微生物菌屬分成3 個(gè)明顯的聚類，包括聚類1（Bacillus、Synechococcus）、聚類2（Pseudomonas、chloroplast、Stenotrophomonas）和聚類3（Cyanobium、Achromobacter、Rhodococcus、Brucella、Tetragenococcus、Staphylococcus、Delftia）。聚類1中的微生物菌屬與Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)的正相關(guān)性較高，聚類2中的微生物菌屬與Shannon指數(shù)、苯乙胺、亞精胺、腐胺產(chǎn)生明顯的正相關(guān)性，聚類3中的微生物菌屬與AAN、組胺、尸胺、酪胺、色胺和精胺正相關(guān)性較高。

圖5 微生物菌屬與低鹽魚露品質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between microbial genera and quality indexes in low-salt fish sauce

進(jìn)一步根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)構(gòu)建了微生物菌屬與生物胺、AAN、α多樣性指數(shù)間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（|r|＞0.6且P＜0.05）。如圖5C所示，在低鹽自然發(fā)酵組中，與Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著正相關(guān)的菌屬主要集中在Brevibacterium、Dietzia、Paracoccus、Aequorivita、Brachybacterium，表明這些微生物菌屬豐度的下降是低鹽自然發(fā)酵魚露發(fā)酵末期微生物多樣性下降的主要原因。Stenotrophomonas與大多數(shù)生物胺（4 種）呈顯著正相關(guān)，其次是Pseudomonas、Ralstonia、Erysipelothrix（2 種）。Stenotrophomonas是與尸胺（r=0.8 1 9）、組胺（r=0.7 3 6）、腐胺（r=0.699）和酪胺（r=0.699）高度相關(guān)的主要菌屬，有助于它們在發(fā)酵后期濃度增加。與色胺產(chǎn)生有關(guān)的菌屬最多，包括Staphylococcus（r=0.622）、Delftia（r=0.882）、Ralstonia（r=0.679）、Paraburkholderia（r=0.695）、Ornithinimicrobium（r=0.784）、Paracoccus（r=0.769）、Aequorivita（r=0.781）、Brachybacterium（r=0.624）、Rhizobium（r=0.664）、Gallicola（r=0.749）、Roseovarius（r=0.752）、Pontibaca（r=0.670）。其次是與尸胺產(chǎn)生有關(guān)的菌屬，包括Pseudomonas（r=0.735）、Stenotrophomonas（r=0.819）、Achromobacter（r=0.632）、Rhodococcus（r=0.642）和Brucella（r=0.636）。Pseudomonas和Stenotrophomonas是造成食品儲(chǔ)存期間腐敗的主要微生物菌屬[31]，且Pseudomonas被確定為水產(chǎn)品中產(chǎn)生生物胺的核心腐敗菌[32-34]。在本研究中，應(yīng)進(jìn)一步控制低鹽魚露中的腐敗微生物，特別是Pseudomonas和Stenotrophomonas，以抑制生物胺的產(chǎn)生。AAN與多個(gè)微生物菌屬呈顯著正相關(guān)，包括Tetragenococcus（r=0.707）、Stenotrophomonas（r=0.825）、Achromobacter（r=0.744）、Rhodococcus（r=0.752）、Brucella（r=0.748）、Erysipelothrix（r=0.654），說明這些菌屬有可能產(chǎn)生蛋白酶，有利于魚肉蛋白質(zhì)的分解，從而導(dǎo)致AAN增加。

如圖5D所示，在加菌發(fā)酵組中，與α多樣性指數(shù)顯著相關(guān)的菌屬明顯減少，其中與Shannon指數(shù)顯著正相關(guān)的菌屬主要包括Pseudomonas（r=0.951）、Stenotrophomonas（r=0.797）、chloroplast（r=0.756），說明這些菌屬在維持加菌發(fā)酵魚露微生物菌群均勻度方面發(fā)揮重要作用。Tetragenococcus（r=0.611）、Stenotrophomonas（r=0.707）、Delftia（r=0.667）與AAN呈顯著正相關(guān)，表明這些菌屬在魚露發(fā)酵過程AAN變化中發(fā)揮著重要作用。微生物菌屬與多種生物胺之間呈顯著正相關(guān)，其中與組胺生成顯著正相關(guān)的有Stenotrophomonas（r=0.769）、Delftia（r=0.699）；與酪胺顯著正相關(guān)的有Tetragenococcus（r=0.611）、Stenotrophomonas（r=0.649）、Delftia（r=0.638）；與腐胺顯著正相關(guān)的有Stenotrophomonas（r=0.724）；與尸胺顯著正相關(guān)的有Stenotrophomonas（r=0.612）、Delftia（r=0.628）。結(jié)果表明，Stenotrophomonas在加菌發(fā)酵魚露中生物胺形成方面發(fā)揮著重要作用，這與自然發(fā)酵魚露的結(jié)果一致。

2.7 加菌發(fā)酵改善低鹽發(fā)酵魚露品質(zhì)的作用機(jī)制

為進(jìn)一步揭示B.subtilisB-2加菌發(fā)酵改善低鹽發(fā)酵魚露品質(zhì)的作用機(jī)制，將發(fā)酵末期低鹽自然發(fā)酵魚露和加菌發(fā)酵魚露間的微生物菌屬、生物胺、AAN、α多樣性指數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，并進(jìn)一步構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（|r|＞0.6且P＜0.05）。

如圖6所示，僅有Bacillus和Staphylococcus與Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)，而與Simpson指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，而其他微生物菌屬則正好相反。同時(shí)，只有Bacillus和Staphylococcus與AAN呈顯著正相關(guān)，與組胺、腐胺、尸胺、酪胺等關(guān)鍵生物胺呈顯著負(fù)相關(guān)。發(fā)酵食品中的核心菌群是指微生物菌屬豐度占絕對豐度并能在其風(fēng)味或品質(zhì)起核心作用的菌群[3,12]。如圖7所示，B.subtilisB-2加菌發(fā)酵后，Staphylococcus的相對豐度僅從0.05%增加到0.12%。因此雖然Staphylococcus與品質(zhì)指標(biāo)的改善起顯著相關(guān)，但是在其中占比很小，并不是發(fā)酵食品品質(zhì)改善的核心菌群。相反，B.subtilisB-2加菌發(fā)酵后，Bacillus在發(fā)酵末期的相對豐度從0.04%顯著增加到93.63%，其在低鹽魚露品質(zhì)改善上發(fā)揮著核心作用，是加菌發(fā)酵魚露中的核心微生物菌群。結(jié)果表明，B.subtilisB-2加菌發(fā)酵后，腐敗微生物種類和豐度的下降，AAN含量的提高，以及組胺、腐胺、尸胺、酪胺等關(guān)鍵生物胺含量的下降主要由Bacillus即所添加的發(fā)酵劑代謝引起的。本研究表明B.subtilisB-2作為發(fā)酵劑具有很好的改善低鹽發(fā)酵魚露品質(zhì)的作用，具有在低鹽發(fā)酵魚露中應(yīng)用的潛力。

圖6 基于發(fā)酵末期低鹽自然發(fā)酵魚露和加菌發(fā)酵魚露間的微生物菌屬與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Correlation network map between microbial genera and quality indexes in naturally fermented and B. subtilis B-2 fermented low-salt fish sauce at the end of fermentation

圖7 B. subtilis B-2加菌發(fā)酵改善魚露品質(zhì)的作用機(jī)制圖Fig.7 Mechanism for quality improvement of low-salt fish sauce by fermentation with B. subtilis B-2

3 結(jié) 論

B.subtilisB-2加菌發(fā)酵能夠顯著降低低鹽魚露發(fā)酵過程中微生物群落的豐富度和均勻度。在低鹽自然發(fā)酵魚露中共檢測到31 種主要的微生物菌屬（相對豐度＞0.1%），其優(yōu)勢菌屬從發(fā)酵初期的Cyanobium變?yōu)榘l(fā)酵末期的Pseudomonas；而加菌發(fā)酵后，微生物菌屬減少至12 種，其中Bacillus始終占主導(dǎo)地位，在發(fā)酵末期的相對豐度達(dá)到93.69%，腐敗微生物豐度顯著降低。B.subtilisB-2加菌發(fā)酵能夠顯著抑制低鹽魚露中組胺、腐胺、尸胺和酪胺的生成，其含量在發(fā)酵末期較自然發(fā)酵魚露分別下降了25.9%、35.6%、23.6%和9.3%。B.subtilisB-2加菌發(fā)酵可顯著增加低鹽魚露的AAN含量，其中發(fā)酵15 d的AAN可達(dá)到1.23 g/100 mL，超過一級魚露的AAN含量標(biāo)準(zhǔn)，而此時(shí)自然發(fā)酵魚露的AAN僅為0.79 g/100 mL（僅達(dá)到二級魚露）。相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果顯示，在低鹽自然發(fā)酵組中，與Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著正相關(guān)的菌屬主要集中在Brevibacterium、Dietzia、Paracoccus、Aequorivita、Brachybacterium，表明這些微生物菌屬豐度的下降是低鹽自然發(fā)酵魚露發(fā)酵末期微生物多樣性下降的主要原因；在低鹽自然發(fā)酵魚露和低鹽加菌發(fā)酵魚露中，Stenotrophomonas均與多種生物胺呈顯著正相關(guān)，表明其在低鹽魚露生物胺產(chǎn)生中發(fā)揮核心作用；B.subtilisB-2加菌發(fā)酵后，腐敗微生物種類和豐度的下降、AAN含量的提高以及關(guān)鍵生物胺含量的下降主要由Bacillus即所添加的發(fā)酵劑代謝引起。B.subtilisB-2作為發(fā)酵劑具有在改善低鹽發(fā)酵魚露品質(zhì)中的應(yīng)用潛力。