基于UPLC 指紋圖譜和含量測(cè)定的積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

呂渭升，楊潔，侯栩軒，梁月儀，李振雨，孫冬梅，陳向東，賈小舟，2

（1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510400）

積雪草為傘形科植物積雪草Centella asiatica（L.）Urb.的干燥全草，夏、秋二季采收，除去泥沙，曬干[1]。積雪草廣泛生長(zhǎng)于我國(guó)的大部分省份，主產(chǎn)于廣西、貴州、云南等地，又名銅錢草、馬蹄草、錢齒草等，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味苦，寒；主大熱，惡瘡，癰疽，浸淫赤嫖，皮膚赤，身熱”[2]，具有清熱利濕，解毒消腫等功效[3-4]，臨床上主要用于跌打損傷、傳染性肝炎、流行性腦脊髓膜炎等[5-6]。積雪草所含化學(xué)成分中主要包括三萜類、黃酮類、酚酸類、多炔烯烴類，以及揮發(fā)油類成分[7]。《中國(guó)藥典》2020 年版中以積雪草苷和羥基積雪草苷為指標(biāo)性成分對(duì)積雪草的質(zhì)量進(jìn)行控制。羥基積雪草苷具有抗炎、鎮(zhèn)靜、促進(jìn)肌膚再生、改善肌膚紋理的作用[8]，而積雪草苷能改善皮膚水油平衡，有助于膠原蛋白的合成[9-10]。因此，積雪草不僅具有良好的藥用價(jià)值，還具有良好的護(hù)膚價(jià)值。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑理論被提出之后，便成為了中藥現(xiàn)代工藝轉(zhuǎn)化的標(biāo)尺，標(biāo)準(zhǔn)湯劑連接了傳統(tǒng)中藥飲片和現(xiàn)代中藥制劑，為控制中藥配方顆粒、經(jīng)典名方和部分使用水作為提取溶劑的中成藥的質(zhì)量提供了參照和研究基礎(chǔ)。由于不同的化學(xué)成分在水中的溶解度不同，其轉(zhuǎn)移率也會(huì)有差異，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)湯劑在化學(xué)組成上可能與藥材飲片不一致[11]，因此對(duì)中藥湯劑成分的研究更具有臨床指導(dǎo)性意義[12-13]。鑒于積雪草水煎劑和其他現(xiàn)代中藥制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，為保證用藥的有效性和安全性，本研究共收集了19批不同產(chǎn)地來源的積雪草藥材，炮制成飲片后制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，用于建立積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，首次同時(shí)測(cè)定其中的三萜類成分積雪草苷、羥基積雪草苷和黃酮類成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷3 種活性成分的含量，并使用SPSS 軟件和SIMCA-P 軟件對(duì)積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行主成分分析（PCA），對(duì)不同產(chǎn)地積雪草制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的整體評(píng)價(jià)提供思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

YRE-501 小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；全自動(dòng)煎藥壺（3 L，深圳一枚王有限公司）；JJ600 百分之一天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；ME204E萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；XP26百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；HZ-D（Ш）臺(tái)式循環(huán)水真空泵（上海力辰儀器科技有限公司）；DLSB-5/20 低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；TRL-0.5 真空冷凍干燥機(jī)（大連雙瑞科技有限公司）；LC-40Dxs島津超高效液相色譜儀（島津公司）；HWS28電熱數(shù)顯恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司）；KQ-500DE 超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑試藥

積雪草苷對(duì)照品（批號(hào)：110892-201505，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：91.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；羥基積雪草苷對(duì)照品（批號(hào)：110893-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；積雪草苷B 對(duì)照品（批號(hào)：ST78590120MG，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%，上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司）；異綠原酸C 對(duì)照品（批號(hào)：wkq18050905，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%，四川省維克奇生物科技有限公司）；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品（批號(hào)：CFN92172，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%，Chem Faces）；乙醇、甲醇（西隴科學(xué)股份有限公司），倍他環(huán)糊精（上海麥克林生化科技有限公司）為分析純；磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）、甲醇（默克股份有限公司）為HPLC色譜級(jí)；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.3 樣品及制備方法

19批不同產(chǎn)地收集得到的積雪草藥材信息詳見表1，經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為傘形科植物積雪草Centella asiatica（L.）Urb.的干燥全草，積雪草苷和羥基積雪草苷的總量均符合《中國(guó)藥典》2020年版“不得少于0.80%”的規(guī)定。

表1 19批積雪草藥材信息表Table 1 Source information of 19 batches of Centellae Herbs

《中國(guó)藥典》2020年版一部“積雪草”項(xiàng)下規(guī)定積雪草飲片的炮制方法為：除去雜質(zhì)，洗凈，切段，干燥。本研究對(duì)積雪草飲片的具體炮制方法為：取積雪草原藥材，揀去雜質(zhì)、變質(zhì)品，洗凈（清水噴淋，并不斷翻動(dòng)藥材），用鍘刀切制成5～15 mm 的段，干燥，用20 目篩除去碎屑物，即得積雪草飲片。根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》相關(guān)規(guī)定，建立積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的制備方法步驟為：分別取積雪草飲片約100 g，煎煮次數(shù)為2 次，第1次煎煮加水量為12倍，飲片浸泡時(shí)間為30 min，煎煮時(shí)間為30 min，煎煮后用200 目篩網(wǎng)趁熱過濾，濾液迅速用冷水冷卻，備用。第2 次煎煮加水量為10倍，煎煮時(shí)間為25 min，煎煮后用200 目篩網(wǎng)趁熱過濾，濾液迅速冷水冷卻，合并兩次濾液，65 ℃減壓濃縮，冷凍干燥，即得。按此法制得19 批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用色譜柱Waters CORTECS T3（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）；乙腈為流動(dòng)相A，含0.15%磷酸的2 mmol/L 倍他環(huán)糊精溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，13%～16%A；5～10 min，16%A；10～25 min，16%～19%A；25～30 min，19%～22%A；30～40 min，22%～24%A；40～45 min，24%～36%A）；流速為0.30 mL/min；柱溫為35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 參照物溶液的制備

取積雪草苷對(duì)照品、羥基積雪草苷對(duì)照品、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品、異綠原酸C 對(duì)照品、積雪草苷B 對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成5 種成分質(zhì)量濃度分別為218.454、209.425、20.145、25.574、13.505 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品參照物溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)：S4）按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。以9號(hào)羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.06%～0.14%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD 值在0.68%～1.31%范圍內(nèi)，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)：S4）6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以9 號(hào)羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.01%～0.15%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD值在0.30%～2.84%范圍內(nèi)，均小于3%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)：S4）按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在制樣后0、5、12、16、20、23 h 進(jìn)樣測(cè)定，以9 號(hào)羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到23 h 內(nèi)各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0.08%～0.23%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD值在0.87%～1.37%范圍內(nèi)，說明該供試品溶液在23 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取19批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，篩選共有峰，并進(jìn)行積分。將指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，以S1 號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，經(jīng)過多點(diǎn)校正，生成疊加圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜（R），共標(biāo)定11個(gè)共有峰，見圖1。通過與對(duì)照品保留時(shí)間及紫外全波長(zhǎng)3D 掃描曲線圖比較，指認(rèn)了其中的5 個(gè)成分，分別是峰1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、峰5 異綠原酸C、峰7 積雪草苷B、峰9 羥基積雪草苷、峰11 積雪草苷，見圖2。以9號(hào)羥基積雪草苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到19 批樣品中11 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 范圍為0.07%～0.50%，相對(duì)峰面積的RSD 范圍為4.53%～51.89%，說明11 個(gè)共有峰峰面積差異較大。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表2，19 批樣品指紋圖譜與積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照?qǐng)D譜（R）的相似度均＞0.900，說明19 批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分種類一致性較好，主要差異表現(xiàn)在各特征峰所代表的化學(xué)成分的含量上。

圖1 19批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC疊加圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜（R）Figure 1 UPLC superposition fingerprints and control fingerprint（R）for 19 batches of Centellae Herbs standard decoction

圖2 混合對(duì)照品、供試品與陰性樣品的色譜圖Figure 2 UPLC chromatograms of mixed reference substances，test sample and negative sample

表2 19批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Similarity results of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction

2.4.5 主成分分析 將19批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中11個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 25軟件，以峰面積為變量，特征值大于1.0 為主成分因子的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCA 分析，計(jì)算得到主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，PCA 共提取2 個(gè)特征值大于1 的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)80.428%，大于80%表明提取的前2個(gè)主成分可以代表積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰中大部分的信息[14-15]。旋轉(zhuǎn)后的成分載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，第1 主成分主要反映了峰2、4、5、6、10對(duì)其的貢獻(xiàn)；而峰8、11對(duì)第2主成分的貢獻(xiàn)率較大。將共有峰峰面積導(dǎo)入SMICA-P 軟件中，進(jìn)行無監(jiān)督模式識(shí)別PCA，得到主成分散點(diǎn)圖，結(jié)果見圖3。從結(jié)果可看出，所有樣品均在95%可信區(qū)間內(nèi)，以產(chǎn)地進(jìn)行分析，同一產(chǎn)地的樣品斑點(diǎn)分布較為分散，差異較大。而不同產(chǎn)地之間的樣品斑點(diǎn)均存在相互重疊的區(qū)域，無明顯性差異，這提示了產(chǎn)地可能不是造成積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量差異的主要因素。

圖3 19批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑PCA得分圖Figure 3 PCA score chart of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction samples

表3 主成分全部方差分析Table 3 Variance analysis of all the main components

表4 積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑主成分因子載荷矩陣Table 4 Principal component load matrix of Centellae Herbs standard decoction

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 供試品溶液的制備及色譜條件 分別同“2.3”、“2.1”項(xiàng)下方法。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 取積雪草苷、羥基積雪草苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL分別含150、200和20μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.5.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、“2.3”項(xiàng)下供試品溶液及陰性樣品（空白溶劑）溶液1 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，待測(cè)成分積雪草苷、羥基積雪草苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷與相鄰成分達(dá)到基線分離，陰性樣品無干擾。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密稱取積雪草苷對(duì)照品18.654 mg、羥基積雪草苷對(duì)照品27.113 mg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品5.325 mg，置25 mL 量瓶中，加80% 甲醇制成每1 mL 含積雪草苷680.498 μg、羥基積雪草苷1024.871 μg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷208.740 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、1.5、2、5、10 mL，分別置于25 mL 量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，制得不同濃度的混合對(duì)照品溶液，分別含積雪草苷13.610、27.220、40.830、54.440、136.100、272.199 μg/mL，羥基積雪草苷20.497、40.995、61.492、81.990、204.974、409.949 μg/mL；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷4.175、8.350、12.524、16.699、41.478、83.496 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液。按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各個(gè)濃度的色譜峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)照品配制濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明各對(duì)照品在進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表5。

表5 各成分線性關(guān)系Table 5 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度考察 精密吸取積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（批號(hào)：S4），按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果顯示積雪草苷峰面積RSD 為0.45%，羥基積雪草苷峰面積RSD 為0.84%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD 為1.22%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（批號(hào)：S4），按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在制樣后0、5、12、16、20、23 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，積雪草苷峰面積RSD 為0.42%，羥基積雪草苷峰面積RSD 為0.77%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD 為1.13%，均小于2%，表明積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在23 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性考察 按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，取積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（批號(hào)：S4）制備供試品溶液6 份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，積雪草苷平均含量為12.127 mg/g，RSD為1.34%；羥基積雪草苷平均含量為20.243 mg/g，RSD 為1.78%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷平均含量為5.334 mg/g，RSD 為1.64%，均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率測(cè)定 精密稱取積雪草苷對(duì)照品10.624 mg、羥基積雪草苷對(duì)照品16.545 mg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品4.265 mg，置200 mL量瓶中，加80% 甲醇制成每1 mL 含積雪草苷48.445 μg、羥基積雪草苷78.175 μg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷20.899 μg的混合對(duì)照品溶液，備用。

取積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（序號(hào)：S4）適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行6份，每份分別精密加入25 mL上述混合對(duì)照品溶液，然后按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，積雪草苷、羥基積雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的平均加樣回收率分別為100.31%、99.65%、98.70%，結(jié)果見表6。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”規(guī)定樣品中待測(cè)成分含量在0.1%～1%時(shí)回收率限度為90%～108%，含量在1%～10%時(shí)回收率限度為92%～105%，所有數(shù)據(jù)均在此范圍內(nèi)，回收率良好。

表6 積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of recovery tests for various constituents of Centellae Herbs standard decoction(n=6)

2.5.9 樣品含量測(cè)定 取19批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備19 份積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，各平行兩份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各批次的積雪草苷、羥基積雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量，結(jié)果見表7、圖4。

表7 19批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of the determination of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction(n=2)w/%

從表7 可見，19 批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中積雪草苷含量范圍為0.39%～2.54%，羥基積雪草苷含量范圍為1.47%～3.72%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量范圍為0.12%～0.60%，RSD 值分別為50.73%、31.51%和49.58%，說明各批次積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑各有效成分含量有所差異。在三萜皂苷類成分積雪草苷和羥基積雪草苷含量方面，廣西產(chǎn)地相對(duì)較高，其他產(chǎn)地差異不大；在黃酮苷類成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量方面，除來源于貴州的5 個(gè)樣品含量較為穩(wěn)定外，其他各個(gè)產(chǎn)地的樣品差異較大，暫無明顯地域性特征。

3 討論

在供試品溶液制備方法的考察中，先后考察了提取溶劑（甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇）、提取方式（超聲處理和加熱回流）、提取時(shí)間（15、30、60 min）和溶劑用量（15、25、50 mL）對(duì)指紋圖譜各個(gè)共有峰的影響，優(yōu)選最佳提取參數(shù)。結(jié)果顯示，采用80%甲醇25 mL，超聲處理30 min提取效率最高。

在色譜條件的考察中，對(duì)比了乙腈-2 mmol/L倍他環(huán)糊精溶液、乙腈-含0.15%磷酸的2 mmol/L倍他環(huán)糊精溶液、乙腈-含0.2%磷酸的2 mmol/L 倍他環(huán)糊精溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液4種流動(dòng)相的洗脫效果，結(jié)果顯示選取2 mmol/L 倍他環(huán)糊精溶液作為水相時(shí)，色譜峰的分離度較差；乙腈-0.2%磷酸溶液作為水相時(shí)積雪草苷B與羥基積雪草苷兩個(gè)成分難以分離；選擇另外兩種流動(dòng)相洗脫時(shí)色譜峰較多，分離效果較好，整體響應(yīng)度適中且無明顯差異，結(jié)合方法的耐用性及保護(hù)色譜柱的角度考慮，選取含0.15%磷酸的2 mmol/L 倍他環(huán)糊精溶液作為水相。之所以在流動(dòng)相中加入倍他環(huán)糊精是因?yàn)榉e雪草苷B與羥基積雪草苷是一對(duì)烏蘇烷型和齊墩果烷型結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體，采用普通流動(dòng)相時(shí)往往難以分離，而倍他環(huán)糊精則可與不同異構(gòu)體形成不同空間位阻的包含物，致使它們?cè)谏V柱中的保留時(shí)間產(chǎn)生差異，從而達(dá)到有效分離[16-17]。

積雪草的三萜皂苷類成分具有抗氧化應(yīng)激作用、促進(jìn)組織愈合和改善微循環(huán)作用、抗炎、抗焦慮等作用[18-19]。此外，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷屬于積雪草中的黃酮醇成分，具有抗感染、抗氧化、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物活性作用[20-21]。因此，本研究首次建立了UPLC 法同時(shí)測(cè)定積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中積雪草苷、羥基積雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量的方法。結(jié)果顯示3種成分均能在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中穩(wěn)定存在，能有效從飲片提取傳遞至標(biāo)準(zhǔn)湯劑之中。同一產(chǎn)地不同批次的樣品有效成分含量存在著不同程度的差異，例如廣西產(chǎn)地的積雪草苷含量為0.82%～2.54%，羥基積雪草苷含量為1.47%～3.72%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量為0.12%～0.41%，最大相差約3.5 倍，其他產(chǎn)地也存著同樣的差異，不同產(chǎn)地之間無明顯的地域性差異。

中藥指紋圖譜具有專屬性高、穩(wěn)定性好、整體性強(qiáng)的特點(diǎn)，能更全面地反映中藥材整體的化學(xué)成分信息。因此，本研究建立積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，共確定了11個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中5個(gè)成分，對(duì)控制積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。相似度結(jié)果顯示19 批積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照指紋圖譜的相似度較高，具有較好的一致性。PCA 結(jié)果則顯示不同產(chǎn)地及來源的積雪草標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品無明顯地域性差異。積雪草性喜溫暖潮濕，對(duì)栽培土要求不嚴(yán)，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖迅速，水陸兩棲皆可，因此能廣泛分布于國(guó)內(nèi)的大部分地區(qū)。有文獻(xiàn)研究得出影響積雪草質(zhì)量的因素除了產(chǎn)地土壤外，還可能與光照條件、種植密度、肥料等有關(guān)[22-23]。另外，藥材的采收季節(jié)、產(chǎn)地加工方式、儲(chǔ)存環(huán)境等因素也會(huì)對(duì)積雪草的質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響，下一步可對(duì)其他的影響因素進(jìn)行研究，為積雪草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。