超聲輔助法提取當歸總黃酮工藝優(yōu)化研究*

汪 凡，張 旭，汪本宗，彭文彬，鄭秀文，周雪韋，趙啟宇，宋俊梅

(巢湖學(xué)院，安徽 合肥 238024)

當歸為傘形科植物當歸(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根。秋末收獲，除去泥沙和須根，只保留主根；待水分稍微蒸發(fā)，包扎成小捆，上棚，用煙火慢慢烘干，再切薄片[1]。當歸又名秦歸、馬尾歸、馬尾當歸等，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，主要產(chǎn)自于我國云南、甘肅等地。其味甘、辛而溫，中醫(yī)認為歸心、肝、脾經(jīng)，具有補血調(diào)經(jīng)、活血止痛、潤腸通便的功效[2-3]。所謂“十方九歸”，可見當歸在中醫(yī)組方中的重要地位，故有“藥王”之稱。研究發(fā)現(xiàn)當歸還具有抗氧化、抗腫瘤、消炎、平喘、抗抑郁等功能，在婦科疾病中也有廣泛的應(yīng)用[4]。

黃酮是當歸的重要成分之一。黃酮類化合物是一類多酚類天然產(chǎn)物，常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在于幾乎所有綠色植物中。黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，分布廣泛，種類繁多，且多數(shù)化合物容易以結(jié)晶形式獲得[5-8]。當歸總黃酮經(jīng)分離純化后可分為木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和木犀草素-7-O-蘆丁糖苷兩類[9]。當歸作為一種良好的中藥抑菌劑，其總黃酮對于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等菌具有一定的抑制作用；還能夠調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)，促進胰島B細胞的恢復(fù)，降低血糖和膽固醇。因此對糖尿病及其并發(fā)癥具有一定治療作用，也降低輻射對DNA的損傷[10]。

目前總黃酮的提取方法主要有超聲提取法、加熱回流法、超聲復(fù)合酶法等，超聲輔助浸取便是利用超聲波產(chǎn)生的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)等增加溶劑的穿透力，可使物料中的有效成分加速溶出，大大減少提取時間，提高提取效率[11]。因此，本實驗以干燥當歸切片為原料，采用超聲提取法探討當歸總黃酮提取工藝，通過單因素及正交實驗考查乙醇濃度、超聲時間、超聲功率、物料比對當歸總黃酮含量的影響，以期為提高當歸總黃酮類化合物的提取效率提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

當歸，產(chǎn)地為甘肅定西；醫(yī)用酒精(C2H5OH)，95%，河北瑞康醫(yī)藥科技有限公司；亞硝酸鈉(NaNO2)，分析純，天津市天茂化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉(NaOH)，分析純，西隴化工股份有限公司；硝酸鋁[Al(NO3)3·9H2O]，分析純，天津市天茂化學(xué)試劑廠。

電子天平(FA1004N)，上海箐海儀器有限公司；新型密封型搖擺式高速粉碎機(100克)，雷邁機械設(shè)備有限公司；數(shù)控超聲清洗儀(500W)(JK-500DB)，合肥金尼克機械制造有限公司；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ΙΙΙ)，河南省予華儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(41K30RA-C)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；紫外可見分光光度計(UV-5100B)，上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制備

用蘆丁標準品配置成 0.4 mg/mL 的蘆丁標準品溶液，用吸量管準確量取0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0 mL 置于試管中，后分別加入 1 mL 質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置 6 min；再吸取 1 mL 質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置 6 min；最后加入 10 mL 質(zhì)量分數(shù)為4%的氫氧化鈉溶液；再加入60%的乙醇溶液稀釋至 25 mL，搖勻靜置 10 min；在 510 nm 的條件下分別測定其吸光度。以蘆丁標準品的質(zhì)量(mg)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得到蘆丁標準回歸曲線方程Y=0.5224X-0.0813 (r=0.9995)。

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.2 當歸總黃酮提取及含量測定

稱取 4 g 當歸，進行超聲提取，過濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到蒸發(fā)液。用乙醇溶液定容至50 mL得到總黃酮提取液。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法，在 510 nm 條件下測定其吸光度，平行3次。利用(1)式計算當歸總黃酮的提取率：

(1)

式中：m1為試樣的測定質(zhì)量，mg；D為稀釋倍數(shù)；m0為稱量的當歸質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實驗

1)乙醇體積分數(shù)的選擇

選擇乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%，超聲時間 30 min，超聲功率40%，物料比 1∶10 g/mL。

2)超聲時間的選擇

選擇乙醇體積分數(shù)60%，超聲時間 30 min，超聲功率40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，物料比1∶10。

3)超聲功率的選擇

選擇乙醇體積分數(shù)60%，超聲時間 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，超聲功率80%，物料比 1∶10 g/mL。

4)物料比的選擇

選擇乙醇體積分數(shù)60%，超聲時間 20 min，超聲功率80%，物料比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL。

1.2.4 正交實驗優(yōu)化提取工藝

綜合上述單因素實驗結(jié)果，進而設(shè)計正交表，進行實驗，采用正交實驗法在四因素三水平上對當歸總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。

1.2.5 驗證實驗

對正交實驗篩選的最佳提取工藝組合進行驗證，按最佳組合條件進行實驗，并與先前各組實驗數(shù)據(jù)進行對比，以驗證最佳提取工藝的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇質(zhì)量分數(shù)

由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，當歸總黃酮的提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在乙醇體積分數(shù)處于30%～60%時，當歸總黃酮提取量呈上升趨勢，在乙醇體積分數(shù)為60%時，提取量達到最大值；隨著乙醇體積分數(shù)的進一步增大，可能是乙醇體積分數(shù)過高時，增大了脂溶性物質(zhì)浸出增加，雜質(zhì)增加，從而當歸總黃酮的提取量減少[12]。因此選擇乙醇體積分數(shù)50%、60%、70%進行正交實驗。

圖2 乙醇濃度對當歸總黃酮的影響

2.1.2 超聲功率

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，當歸總黃酮的提取量先增加后減少。在40%～80%范圍內(nèi)，當歸總黃酮提取量隨超聲功率增加而增加；超聲波的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)、熱效應(yīng)使細胞破裂程度增加，當歸總黃酮的浸出率增大。而超過80%時，對細胞的破壞達到最大，使大量雜質(zhì)開始溶出，且對黃酮類化合物產(chǎn)生一定破壞，從而使當歸總黃酮提取量下降[13]。因此選擇超聲功率70%、80%、90%進行正交實驗。

圖3 超聲功率對當歸總黃酮的影響

2.1.3 超聲時間

由圖4可知，在10～20 min 范圍內(nèi)，超聲波對細胞有一定破壞作用。隨著時間的增加，細胞破裂更充分，有利于黃酮類化合物的浸出。而超過 20 min 以后，雜質(zhì)的浸出量增加，過長的超聲時間，也對當歸總黃酮產(chǎn)生一定破壞，使得總黃酮的提取量下降[14]。因此選擇超聲時間 10、20、30 min 進行正交實驗。

圖4 超聲時間對當歸總黃酮的影響

2.1.4 物料比

由圖5可知。隨著物料比的增大，當歸總黃酮提取量基本呈先上升后下降再緩步上升的過程。當物料比在1∶5～1∶15 g/mL 范圍內(nèi)，隨著浸取液增加，溶出的黃酮類化合物含量增加。超過 1∶15 g/mL 時，其他雜質(zhì)的溶出量增加，改變浸取液理化性質(zhì)，使當歸總黃酮的浸出量減少[15]；故在物料比為 1∶15 g/mL 時當歸總黃酮提取量最大。因此選擇物料比1∶10、1∶15、1∶20 g/mL 進行正交實驗。

圖5 物料比對當歸總黃酮的影響

2.2 正交實驗

為優(yōu)選當歸總黃酮超聲提取工藝，根據(jù)單因素考察結(jié)果和正交試驗設(shè)計方法原則，按照L9(34)正交試驗(表1)。

表1 正交實驗因素水平表

正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。根據(jù)正交分析圖中，從影響因素乙醇濃度來看，三個水平中均值一最高，表明乙醇體積分數(shù)為60%時提取率最大；從影響因素超聲功率來看，三個水平中均值三最高，表明超聲功率為90%時提取效率最大；從影響因素超聲時間來看，三個水平中均值一最高，表明超聲時間 10 min 時提取效率最大；從影響因素料液比來看，三個水平中均值三最高，表明料液比為 1∶20 g/mL 時提取效率最大，綜上所述較優(yōu)提取工藝為應(yīng)選擇A2B3C1D3的條件即超聲功率90%、乙醇濃度60%、超聲時間 10 min、料液比 1∶20 g/mL。由極差分析可知，超聲功率對當歸總黃酮的影響較大，各因素的主次順序為B(超聲功率)﹥A(乙醇體積分數(shù))﹥C(超聲時間)﹥D(料液比)。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 驗證實驗

為了驗證正交實驗結(jié)果的可行性與穩(wěn)定性，以正交實驗所得超聲功率90%、乙醇濃度60%、超聲時間 10 min、物料比 1∶20 g/mL 進行驗證實驗，三次平行實驗如表3，得到當歸中提取總黃酮的含量均值為4.9018(mg/g)。并與正交實驗結(jié)果對比分析，因此確認該設(shè)計方法得到的當歸總黃酮的提取條件合理有效。

表3 驗證實驗結(jié)果與極差分析

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取當歸總黃酮，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法檢驗總黃酮的提取量，利用單因素實驗和正交實驗對提取工藝進行優(yōu)化。在對乙醇濃度、超聲功率、超聲時間、物料比4個單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交實驗優(yōu)化得到影響當歸總黃酮提取量大小的因素為：超聲功率﹥乙醇濃度﹥超聲時間﹥料液比，最佳的提取方案為A2B3C1D3，即超聲功率90%(450 W)、乙醇體積分數(shù)60%、超聲時間 10 min、料液比 1∶20 g/mL，并通過驗證實驗得到在此條件下當歸總黃酮的提取量為4.9018(mg/g)。

在大健康產(chǎn)業(yè)背景下，國家越來越重視藥食兩用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，2019年新增當歸為藥食兩用物質(zhì)。本實驗采用超聲提取法，優(yōu)化當歸總黃酮提取工藝，旨為進一步開發(fā)和利用當歸總黃酮提供理論依據(jù)；同時，有利于促進中國傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化。