人體痛風(fēng)石中微塑料的定性與定量分析

黃育斌，呂全偉

(1.汕頭市龍湖區(qū)長平路153號，廣東 汕頭 515057；2.汕頭市醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 汕頭 515031)

微塑料(microplastics)為粒徑小于5 mm 的塑料微粒，主要來源于工業(yè)生產(chǎn)的塑料顆粒制品和大塊塑料垃圾在環(huán)境中降解形成的微塑料碎片[1-2]。作為新型全球污染物，微塑料已被證實廣泛存在于空氣、土壤、食物和水中[3]，環(huán)境中微塑料的廣泛存在增加了其通過攝入和吸入進(jìn)入人體的機(jī)會。目前，包括肺、氣管、胎盤、睪丸、血液、血栓、精液等多種人體部位已發(fā)現(xiàn)有微塑料的存在[4-5]，這表明微塑料可以隨著血液循環(huán)等途徑分布到不同部位，并隨后可能積聚在多種器官和組織中。

許多基于體外和動物實驗的研究表明，微塑料可能會給人體健康帶來不良影響，其中包括且不限于生殖毒性、腸道功能紊亂和炎癥等[4]。2022 年，澳大利亞學(xué)者Rawle等[6]發(fā)現(xiàn)小鼠攝入微塑料一段時間后與長期關(guān)節(jié)炎相關(guān)，這項研究提示我們微塑料的攝入與關(guān)節(jié)炎癥之間可能存在聯(lián)系。

痛風(fēng)作為一種受遺傳、環(huán)境等多因素影響的常見代謝性關(guān)節(jié)炎，會給患者帶來關(guān)節(jié)腫脹和劇烈疼痛，并常常伴隨著痛風(fēng)石在關(guān)節(jié)處堆積這一重要特征[7]。痛風(fēng)在全球已影響約0.1%～10%的人口，在我國成人痛風(fēng)患病率約占0.86%～2.20%，且呈逐年上升的趨勢[8-9]。過往認(rèn)為不健康的飲食搭配是導(dǎo)致痛風(fēng)的關(guān)鍵風(fēng)險因素[10]，但是新的研究表明工業(yè)化帶來的污染(如空氣污染物二氧化硫)在誘發(fā)痛風(fēng)中也可能起到重要作用[11]。然而，微塑料這種新型污染物是否與痛風(fēng)存在聯(lián)系，或者確切來說，其是否在痛風(fēng)石中存在，或參與痛風(fēng)石這一病理性結(jié)構(gòu)的形成目前尚無報道。由于微塑料已經(jīng)于空氣、水，以及魚、肉、奶、菜等多種食物中檢出[12]，且已知痛風(fēng)又與環(huán)境、飲食搭配存在聯(lián)系，那么探討痛風(fēng)石樣品中是否存在微塑料，或許可以從不同角度探究痛風(fēng)(痛風(fēng)石)與環(huán)境因素和日常飲食的關(guān)系。本研究利用熱解氣相色譜/質(zhì)譜(pyrolysisgas chromatography-mass spectrometry，Py-GC/MS)對不同關(guān)節(jié)痛風(fēng)石樣品中的微塑料進(jìn)行分析鑒定，并探討微塑料在痛風(fēng)石形成中可能扮演的角色，擬為微塑料對人類健康的環(huán)境風(fēng)險評估提供新的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 痛風(fēng)石樣品的收集

在這項研究中，共計收集到來自于5 名男性痛風(fēng)患者(30～65歲)的5份痛風(fēng)石樣品。獲取樣品后，使用無塑化的生理鹽水充分沖洗樣品表面，以避免其被污染。之后，使用不銹鋼手術(shù)器械分割樣品，封裝在玻璃瓶(0～4 °C)中并運(yùn)送到第三方檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行微塑料分析(上海微譜檢測科技集團(tuán)股份有限公司)。痛風(fēng)及痛風(fēng)石診斷符合《中國高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南(2019)》[13]。本研究已經(jīng)汕頭市醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理審查委員會的批準(zhǔn)(SMSE2023001)。

對本次5份初始樣品，3份樣品的一小部分被分割出來并通過傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR spectrometer)檢測以進(jìn)一步確認(rèn)樣品為痛風(fēng)石。此外，4份樣品被分成2部分用于微塑料方面的重復(fù)檢測以盡可能排除偶然所得的檢測結(jié)果，1份樣品因為質(zhì)量有限僅夠用于1次檢測。因此，共計來自5名患者個體的9個樣品通過Py-GC/MS進(jìn)行微塑料分析。

1.2 痛風(fēng)石樣品的紅外光譜分析

我們采用壓片法對樣品進(jìn)行處理，即取1～2 mg樣品在瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉末，加入干燥的溴化鉀粉末約100～200 mg(樣品與溴化鉀的比約為1∶100)，研磨至混合均勻，裝入壓片模具內(nèi)，隨后使用模具真空壓緊并保持1 min，取出樣品并置于傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛Nicolet iS10)固體樣品架上檢測。

1.3 微塑料分析前的樣品預(yù)處理

基于先前文獻(xiàn)所描述的方法[14]，我們對Py-GC/MS微塑料分析方案予以修改完善。具體而言，就是將痛風(fēng)石樣品置于燒杯中，并按每克樣品加入3 mL 硝酸的比例進(jìn)行孵育。第1 次孵育在室溫下持續(xù)48 h，然后第2 次孵育在110 °C 下持續(xù)1～2 h 以達(dá)到充分降解。當(dāng)樣品完全溶解后，加入純水調(diào)節(jié)pH值至1～2 h供進(jìn)一步分析。

1.4 Py-GC/MS微塑料分析

在本研究中，通過熱解(PY-3030D Frontier) 與氣相色譜聯(lián)用檢測樣品中微塑料，即聚苯乙烯(polystyrene，PS)、聚乙烯(polyethylene，PE)、聚丙烯(polypropylene，PP)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)、聚碳酸酯(polycarbonate，PC)、聚己內(nèi)酰胺(polyamide，PA6)、聚己二酰己二胺(polyadiohexylenediamine，PA66)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚己二酸對苯二甲酸丁二醇酯[poly(butylene adipate-coterephthalate)，PBATResults 使用的色譜柱(Rtx-5MS)參數(shù)為長30 m、內(nèi)徑0.25 mm和膜厚0.25 μm。具體設(shè)置如下：30 min 程序?qū)崿F(xiàn)色譜分離，其中40 ℃保持2 min，然后以每分鐘20 ℃的速率升溫至320 ℃并保持14 min。離子源溫度設(shè)置為230 °C。氦氣用作載氣，分流比為5∶1。掃描范圍為質(zhì)荷比(m/Q) 29～600。

1.5 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

為避免外界污染干擾造成誤差，并且確保采集數(shù)據(jù)的可靠性，實驗過程中，包括樣本采集、儲運(yùn)、加工、分析在內(nèi)等環(huán)節(jié)均遵循無塑化原則。對采樣和測試過程中可能的污染點、設(shè)置程序和實驗室進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，包括盡可能增加重復(fù)次數(shù)以排除偶然性的檢出結(jié)果。操作過程中，我們采用不銹鋼器械分離痛風(fēng)石，隨后用玻璃容器儲存和運(yùn)輸。考慮到樣品采集、儲存或運(yùn)輸過程中周圍環(huán)境中的微塑料有可能進(jìn)入玻璃容器，因此我們設(shè)置了對照試驗，并選擇超純無菌水作為空白對照實驗材料來監(jiān)測可能存在的環(huán)境中的微塑料污染。在處理和分析過程中，檢測人員穿著棉質(zhì)實驗室外套和丁腈手套，整個過程在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。此外，所有使用的玻璃裝置均用明火燒灼，試劑通過帶有聚四氟乙烯膜(0.45 μm)的玻璃裝置泵送3 次，以排除可能存在的背景污染。在對照實驗中，具體而言就是使用玻璃滴管將過濾后的超純水裝入玻璃瓶中，玻璃瓶蓋上蓋后并放在實驗室攪拌器上過夜，其后，作為空白對照的超純水與測試樣品一起進(jìn)行所有樣品處理步驟。結(jié)果表示在質(zhì)量控制空白對照中未發(fā)現(xiàn)微塑料。

2 結(jié)果

2.1 患者基本信息及樣品的傅里葉紅外光譜分析

在本項研究中痛風(fēng)石樣品來自5 名痛風(fēng)患者的不同關(guān)節(jié)。本項研究涉及的5 名患者均為男性，年齡區(qū)間位于30～65 歲，其中4 名患者的痛風(fēng)患病時長為2～10 年，1 名時長未知。樣品取出的關(guān)節(jié)包括：肩關(guān)節(jié)、足部跖趾關(guān)節(jié)、食指關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)。患者有關(guān)情況詳見表1。術(shù)前臨床醫(yī)生除了通過MRI、CT 等影像手段在臨床上判定樣品為痛風(fēng)石之外，樣品取出后我們使用FTIR儀對樣品進(jìn)行紅外光譜測定，同時用尿酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品作對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品和尿酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品圖譜高度擬合，從而進(jìn)一步確認(rèn)樣品為痛風(fēng)石，圖譜對比見圖1。

圖1 樣品與尿酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品匹配圖

表1 患者基本情況

2.2 Py-GC/MS檢測中的陰性對照設(shè)置

在對痛風(fēng)石樣品進(jìn)行微塑料檢測分析前，為了確保檢出結(jié)果非有關(guān)器械或玻璃瓶中混有塑料成分而帶來的假陽性結(jié)果，實驗中設(shè)置了陰性對照。將鑷子等不銹鋼器械置于玻璃瓶中，加入純水劇烈攪動并靜置過夜，之后將所得液體全部通過同樣程序的微塑料檢測分析，結(jié)果顯示除微量的PA66 被檢出外(平均檢出量為0.035 9 mg/kg，遠(yuǎn)低于痛風(fēng)石樣品中的檢出量313.912 mg/kg)，無其余微塑料檢出，表明痛風(fēng)石樣品中的微塑料非有關(guān)器械或玻璃瓶接觸污染所得。陰性對照檢測結(jié)果見圖2。此外，為了確保檢出結(jié)果并非Py-GC/MS 儀器檢測時帶來的假陽性結(jié)果，每次于樣品檢測前，均進(jìn)行空白檢測，均未檢出微塑料。上樣前空白檢測結(jié)果見圖3。通過上述的陰性對照來確保檢出的結(jié)果可信，而非污染所得。

圖2 陰性對照的Py-GC/MS微塑料分析結(jié)果

圖3 上樣前空白儀器的Py-GC/MS微塑料分析結(jié)果(無微塑料檢出)

2.3 痛風(fēng)石樣品的Py-GC/MS微塑料檢測分析

Py-GC/MS微塑料檢測分析的結(jié)果顯示，5名患者中4 名患者的痛風(fēng)石樣品中共檢出4 種微塑料(PS、PE、PVC、PA66)。部分樣品譜圖見圖4、圖5。痛風(fēng)石中微塑料檢出率為80%。此外，因5 名患者的痛風(fēng)石樣品共分為9份，且其中8份檢出微塑料，故在9份樣品中微塑料檢出率為88.89%。檢出后，根據(jù)峰面積計算對應(yīng)的含量，結(jié)果3 名患者的5 份樣品里檢出PS，平均含量為20.300 mg/kg；3名患者的5份樣品里檢出PE，平均含量為115.157 mg/kg；1 名患者的2 份樣品里檢出PVC，平均含量為95.6247 mg/kg；1 名患者的1份樣品中檢出PA66，含量為313.912 mg/kg。柱狀圖見圖6，樣品微塑料檢出情況見表2。

圖4 樣品1a的Py-GC/MS微塑料分析結(jié)果

圖5 樣品4a的Py-GC/MS微塑料分析結(jié)果(檢出PE)

表2 患者痛風(fēng)石樣品中微塑料檢出情況

結(jié)果顯示，部分樣品盡管來自于同一患者，其檢測結(jié)果也可能并不一致(如患者1 的樣品1a 中檢出PA66、PS、PVC，而1b 卻僅檢出PS、PVC)，這可能是因為微塑料是不可溶的固體成分，在痛風(fēng)石中無法均勻分布，且我們在分割樣品時為隨機(jī)分割，因此可能導(dǎo)致來自于同一患者的兩個樣品的檢測結(jié)果存在差異。此外，結(jié)果顯示患者5 的樣品中也無微塑料檢出，推測可能是手術(shù)提供的樣品較小，由于微塑料為不可溶的固體成分，非均勻分布，此份樣品無微塑料檢出。

本研究以數(shù)據(jù)證據(jù)率先證明了微塑料可以于人類痛風(fēng)石中檢出，表明不可溶的微塑料可以在人類關(guān)節(jié)處累積并提示其可能參與痛風(fēng)石形成。

3 討論

痛風(fēng)石在關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、韌帶等部位的堆積是中、重度痛風(fēng)最主要的病理特征之一。在過去的幾十年里，不同科學(xué)團(tuán)隊使用多種檢測方法對痛風(fēng)石成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要由單鈉尿酸鹽晶體、包裹晶體的免疫細(xì)胞和結(jié)締組織組成，但仍有成分尚未鑒定出[15]。例如在2022年發(fā)表的一項研究稱，痛風(fēng)石中還存在少量的非晶態(tài)成分未被鑒定出，并推測痛風(fēng)石在形成過程中可能有其他易沉淀物質(zhì)的附著和參與[16]。本研究于痛風(fēng)石中檢出一定量的微塑料，并且鑒定出其為PS、PE、PVC、PA66，進(jìn)一步揭示了當(dāng)下痛風(fēng)石組成的可能性。

長期以來，塑料被認(rèn)為是一種惰性物質(zhì)，在進(jìn)入人體后，會經(jīng)過胃腸道、膽道排泄出體外。然而，有動物研究表明，小于10 μm的微塑料可以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并在多種組織中堆積[17]。同樣，人體樣本中已有不同種類的塑料成分被鑒定出來：痰液中主要鑒定出聚氨酯(PU)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、氯化聚乙烯(CPE)等；胎盤、乳汁、胎糞中主要鑒定出PA、PU；血液中主要鑒定出PET、PS、PE、PP、PMMA 等[4，18]。而本研究除了PS、PE 之外，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了PVC、PA66在人類組織中的存在，豐富了人體中現(xiàn)有檢出微塑料的種類。另痛風(fēng)石中檢出的PS、PE、PVC常用于生產(chǎn)食品或飲用水的包裝材料及運(yùn)輸水的管道材料，而PA66 廣泛應(yīng)用于汽車工業(yè)、儀器殼體以及其他需要有抗沖擊性和高強(qiáng)度要求的產(chǎn)品，也可用于制作紡織品。這表明較少用于制作與食品及水直接接觸的塑料成分PA66 同樣存在侵入人體并在人體部位殘留的風(fēng)險。

本研究僅驗證了人類痛風(fēng)石中能檢出微塑料，并未回答微塑料在痛風(fēng)石形成過程中充當(dāng)什么角色這一問題：它是痛風(fēng)石形成的“發(fā)起者”(或之一)，還是痛風(fēng)石形成的“加劇者”，亦或是二者皆有，再或者是充當(dāng)其他角色？一方面，作為痛風(fēng)石堆積的“始作俑者”——尿酸鹽，它能在關(guān)節(jié)處形成結(jié)晶可能需要“發(fā)起者”，即關(guān)鍵因素或誘導(dǎo)因子(如低溫等)[19]。雖然目前仍未鑒定出確切的“發(fā)起者”，但是微塑料作為人體的“外來物”——其粒徑微小、不可溶且具有獨特的表面特性(如粗糙、多孔及化學(xué)屬性)，可能通過以下幾種作用而充當(dāng)“發(fā)起者”的角色：①誘導(dǎo)尿酸鹽聚集。微塑料在關(guān)節(jié)腔滯留后，可能使得尿酸鹽晶體容易附著在其粗糙表面或多孔內(nèi)部，從而導(dǎo)致尿酸鹽晶體堆積并后續(xù)形成痛風(fēng)石。這種效果可能與尿路異物導(dǎo)致膀胱結(jié)石形成這一臨床發(fā)現(xiàn)相類似，有臨床發(fā)現(xiàn)，絲線、稻草等外源性異物通過尿道進(jìn)入人的膀胱后，長此以往使泌尿系統(tǒng)的結(jié)晶附著，從而形成結(jié)石[20-21]。②增加關(guān)節(jié)面磨損。微塑料作為外來不可溶異物，可能增加關(guān)節(jié)摩擦形成微小的凹凸損傷。這些損傷(或局部炎癥)一方面可能使尿酸鹽結(jié)晶更容易析出形成痛風(fēng)石，另一方面可能使個體即便在正常的尿酸鹽濃度范圍內(nèi)，這些損傷也帶來了類似于痛風(fēng)的痛楚感受。這種假說或許解釋了為什么當(dāng)下有相當(dāng)部分的患者血尿酸保持在正常范圍內(nèi)，卻仍然會遭受痛風(fēng)樣的痛楚[10，22]。③改變關(guān)節(jié)腔微環(huán)境。除了上述的通過磨損關(guān)節(jié)面改變微環(huán)境外，微塑料或其微量的析出物可能改變了其附近微環(huán)境，使得尿酸鹽更容易析出。目前已有報道，用于治療目的的外源性材料(如骨釘、硅膠、膨體)會對其附近帶來一定的諸如pH、溫度等方面改變。那么，同樣作為外源性異物的微塑料，是否也會改變關(guān)節(jié)腔微環(huán)境，從而使得尿酸鹽更容易析出呢，該可能性有待后續(xù)研究驗證。

另一方面，我們認(rèn)為，除了上述“發(fā)起者”的角色之外，微塑料可能又進(jìn)一步加劇了痛風(fēng)石的形成。目前有科學(xué)家推測尿酸鹽結(jié)晶誘發(fā)的炎癥反應(yīng)(如中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)狀陷阱，NETs)有可能是痛風(fēng)石形成并加劇的生理學(xué)機(jī)制[23]。而近年的研究表明，微塑料會導(dǎo)致小鼠等動物身體局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，此外，如前所述，動物研究表明微塑料可能促進(jìn)關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)程。那么結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，完全有理由猜測微塑料導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可能進(jìn)一步影響了痛風(fēng)石的形成。

需要指出的是，上述假設(shè)在未來如果被驗證成立，那么及時將人體關(guān)節(jié)堆積的微塑料(連同其附著的尿酸鹽晶體)排出且及時對微塑料帶來的關(guān)節(jié)磨損予以修復(fù)，可能是減緩乃至消除痛風(fēng)石堆積的干預(yù)手段之一。由關(guān)節(jié)滑囊和腱鞘的滑液膜分泌的關(guān)節(jié)滑液，就起著排出毒素和滋潤修復(fù)關(guān)節(jié)的多重作用[24]。因此我們推測，或許可以通過攝入氨基葡萄糖硫酸軟骨素、鹽酸氨基葡萄糖等成分來強(qiáng)化滑膜液功能性[25]，從而一定程度增加了關(guān)節(jié)腔環(huán)境潤滑度，減少尿酸鹽等對關(guān)節(jié)面的磨損，同時促進(jìn)包括微塑料在內(nèi)的關(guān)節(jié)毒素的排出，進(jìn)而降低痛風(fēng)石形成的可能性、減少痛風(fēng)發(fā)作或痛風(fēng)樣痛楚發(fā)生、及維持關(guān)節(jié)正常功能。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，用100 ℃蒸餾水浸泡一次性塑料餐具，并將浸出液連續(xù)飼喂小鼠10 d，可導(dǎo)致骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率、精子畸變率、肝細(xì)胞DNA拖尾率顯著增加，即表明對小鼠有致突變作用[26]。最新研究發(fā)現(xiàn)，飼喂含低濃度聚苯乙烯微塑料的飲用水可導(dǎo)致小鼠睪丸發(fā)育障礙和精子發(fā)生功能障礙[27]。由此可見，攝入塑料(或微塑料)對動物機(jī)體存在致畸變、突變的風(fēng)險。但是由于此2 項研究一方面基于雄性小鼠實驗，另一方面均未直接檢測小鼠體內(nèi)是否含有微塑料，而本研究則直接證實了人體內(nèi)環(huán)境(痛風(fēng)石)微塑料的檢出，且鑒于檢出微塑料的痛風(fēng)石來自于52～65 歲中老年個體，他們暴露于微塑料的時間理應(yīng)較久，或許微塑料已給他們帶來多種負(fù)面健康影響。因此，未來需要有更多更深的研究來論證微塑料污染對人體的致突變和致畸變影響?？偠灾?，于人體痛風(fēng)石中檢出微塑料這一發(fā)現(xiàn)一方面給我們再次敲響了警鐘，微塑料對人體健康的影響或許比我們想象得更加深遠(yuǎn)，另一方面該發(fā)現(xiàn)在揭示痛風(fēng)石形成的生理學(xué)機(jī)制及臨床上進(jìn)一步治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供了一定理論支撐。

(致謝：感謝上海微譜檢測科技集團(tuán)股份有限公司提供檢測服務(wù)及技術(shù)指導(dǎo))