膜聯(lián)蛋白A3在膿毒癥中的表達變化及功能分析

馬聰聰,陸紅祥,馬筱潔,史清海

1.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生院,烏魯木齊 830054; 2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍臨床檢驗診斷中心,烏魯木齊 830000; 3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,烏魯木齊 830000; 4.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院輸血科,烏魯木齊 830001

創(chuàng)傷是45歲以下人群的主要死亡原因。膿毒癥是創(chuàng)傷后期相關(guān)死亡的主要原因,被定義為由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起危及生命的器官功能障礙[1-2]。創(chuàng)傷后膿毒癥增加了重癥患者的病死風(fēng)險,創(chuàng)傷后膿毒癥的及時診斷和適當(dāng)治療對于改善創(chuàng)傷患者的住院結(jié)局至關(guān)重要[3-4]。因此,探尋可能影響創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的關(guān)鍵分子及防治新靶標(biāo)對提高嚴(yán)重創(chuàng)傷患者預(yù)后具有重要的臨床意義。

目前C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein,CRP)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和降鈣素原(procalcitonin,PCT)作為非特異性炎癥標(biāo)志物在膿毒癥的早期診斷中被廣泛應(yīng)用,但其特異性一直飽受爭議[5-6]。特別在創(chuàng)傷患者中,早期CRP和血漿IL-6水平升高對膿毒癥的診斷意義不大。膜聯(lián)蛋白A3(annexin A3,ANXA3)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一,屬于Ca2+依賴性磷脂和膜結(jié)合蛋白[7-8]。研究表明,該家族參與多種生物學(xué)過程,在細(xì)胞發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用[9]。ANXA3參與中性粒細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)膜融合和顆粒聚集,在氧化應(yīng)激、免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Toufiq等[10]系統(tǒng)分析了6個數(shù)據(jù)集中ANXA3的表達變化,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANXA3在膿毒癥患者中表達升高。同時,Yao等[11]發(fā)現(xiàn)ANXA3可鑒別膿毒癥和非膿毒癥患兒。但目前還沒有研究報道ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中的表達變化,同時ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中發(fā)揮作用的功能機制尚未見報道。

資料與方法

1 數(shù)據(jù)集篩選

在本研究中,根據(jù)檢索關(guān)鍵詞:Sepsis,Trauma,Post-injury,從Gene Expression Omnibus (GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下載創(chuàng)傷后膿毒癥患者數(shù)據(jù)集,包括GSE28750[12]、GSE70311[2]及GSE12624。3個數(shù)據(jù)集的基本信息見表1。針對所有數(shù)據(jù)集進行歸一化及l(fā)og2化處理。從各個數(shù)據(jù)集中提取對應(yīng)ANXA3 mRNA的表達數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

表1 納入研究數(shù)據(jù)集的基本信息

2 生物信息學(xué)分析

利用R語言的Limma軟件包對GSE12624數(shù)據(jù)集中創(chuàng)傷后膿毒癥ANXA3高表達組與ANXA3低表達組中差異表達基因進行鑒定。以倍數(shù)變化FC(fold change)>1.5和FDR(false discovery rate)<0.05為閾值判斷差異表達基因的顯著性。為分析差異基因的功能,對差異表達基因進行GO富集和KEGG通路分析。FDR<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。以上分析均通過在線分析網(wǎng)站臨床生信之家在線完成分析(https://www.aclbi.com/static/index.html#/)[13]。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中表達升高

在GSE28750數(shù)據(jù)集中,共包含20例健康志愿者,11例術(shù)后非膿毒癥患者及10例術(shù)后膿毒癥患者,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANXA3 mRNA表達水平在膿毒癥患者中較健康志愿者及非膿毒癥患者顯著上調(diào)(P<0.05,圖1a)。在GSE70311數(shù)據(jù)集中包含10例嚴(yán)重創(chuàng)傷患者傷后0、1、2、3、5、7、14、21d的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),其中5例創(chuàng)傷后膿毒癥患者及5例創(chuàng)傷后非膿毒癥患者,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者的ANXA3 mRNA動態(tài)變化趨勢總體高于非膿毒癥患者,其中以傷后第2、21天天最為顯著(P均<0.05,圖1b)。因此,筆者考慮ANXA3可能在創(chuàng)傷后膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3

2 ANXA3對創(chuàng)傷后膿毒癥患者的早期預(yù)警分析

為進一步探索ANXA3對創(chuàng)傷后膿毒癥的早期預(yù)警作用,筆者將樣本量最大的GSE12624數(shù)據(jù)集作為驗證數(shù)據(jù)集。在GSE12624數(shù)據(jù)集中共包含36例創(chuàng)傷后非膿毒癥患者及34例創(chuàng)傷后膿毒癥患者,分析結(jié)果同樣證實ANXA3 mRNA表達水平在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中顯著上調(diào)(P<0.05,圖1c)。同時,筆者將GSE12624數(shù)據(jù)集中的ANXA3用于創(chuàng)傷后膿毒癥的早期預(yù)警,分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),ANXA3的AUC=0.766(0.650～0.859),在最佳截斷值6.06,敏感性和特異性分別為76.47%和80.56%(圖1d)。因此,ANXA3可用于膿毒癥的早期預(yù)警。

3 ANXA3可能影響膿毒癥中免疫炎癥的表達變化

本研究在GSE12624的34例創(chuàng)傷后膿毒癥患者中進一步分析了ANXA3與細(xì)胞因子、趨化因子和表面分子等免疫炎癥相關(guān)分子的相關(guān)性,分析結(jié)果顯示ANXA3與細(xì)胞因子(IL-10、IL1R1)、趨化因子(CCL19、CXCL13)、表面分子(CD163、CD55、CD58)等呈正相關(guān)(圖2),提示ANXA3可能通過影響這些免疫炎癥相關(guān)分子的表達,從而參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。

ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3

4 ANXA3在膿毒癥中發(fā)揮作用的功能分析

為探尋ANXA3在膿毒癥中發(fā)揮作用的功能,本研究在GSE12624的34例創(chuàng)傷后膿毒癥中分析了ANXA3的可能作用。首先根據(jù)ANXA3的最佳截斷值6.06,將34例創(chuàng)傷后膿毒癥患者分為ANXA3高表達組與低表達組,然后比較兩組間的差異基因。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有416個基因差異表達(FC>1.5且FDR<0.05),其中包括221個上調(diào)基因及195個下調(diào)基因(圖3a、b),從圖中可以看出,在ANXA3高表達組與低表達組的差異表達基因分析中,ARG1、CLECIB、PCOLCE2、CPNE5、DNAJC5、CD177、CD163、IL-10等基因表達上調(diào),這些基因受ANXA3正向調(diào)控,促進表達;另外,CPA3、USP16、CLC、IFI44L、P2RY14、P2RY14、ETV7、SERPINB2等基因表達下調(diào),ANXA3使這些基因受負(fù)面調(diào)控,抑制其表達。GO分析提示上調(diào)基因主要參與中性粒細(xì)胞脫顆粒,參與免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞活化和對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等通路的富集較為顯著(圖4),這提示膿毒癥期間以中性粒細(xì)胞為代表的固有免疫系統(tǒng)的改變;上調(diào)基因的KEGG分析發(fā)現(xiàn)主要參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用,河馬信號通路和胰島素信號傳導(dǎo)途徑等通路的富集最為顯著(圖5),這些結(jié)果表明,ANXA3通過影響免疫調(diào)節(jié)通路在膿毒癥中發(fā)揮作用。下調(diào)基因的GO分析提示主要參與免疫反應(yīng)激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo),免疫應(yīng)答激活細(xì)胞表面受體信號通路和抗原受體介導(dǎo)的途徑等信號通路的富集較為顯著(圖6);而KEGG分析的下調(diào)基因主要顯著富集在人類T細(xì)胞白血病病毒1的感染,PD-L1在腫瘤中的表達與PD-1檢查點通路和T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)途徑等通路(圖7);這提示膿毒癥期間T細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙、免疫功能受損。以上GO及KEGG分析均表明ANXA3可通過免疫調(diào)節(jié)信號通路而引起創(chuàng)傷性膿毒癥。

ANXA3:膜聯(lián)蛋白A3

圖5 差異表達基因的京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫分析以及相關(guān)上調(diào)信號通路富集分析氣泡圖(橫軸代表富集倍數(shù),縱軸代表各通路名稱,P值代表點的顏色,數(shù)量由點的大小表示,代表該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù),泡泡的大小和色度顯示了基因表達的比例和調(diào)整后的P值)

圖6 差異表達基因的基因本體論分析以及相關(guān)下調(diào)信號通路富集分析氣泡圖(橫軸代表富集倍數(shù),縱軸代表各通路名稱,P值代表點的顏色,數(shù)量由點的大小表示,代表該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù),泡泡的大小和色度顯示了基因表達的比例和調(diào)整后的P值)

圖7 差異表達基因的京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫分析以及相關(guān)下調(diào)信號通路富集分析氣泡圖(橫軸代表富集倍數(shù),縱軸代表各通路名稱,P值代表點的顏色,數(shù)量由點的大小表示,代表該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù),泡泡的大小和色度顯示了基因表達的比例和調(diào)整后的P值)

討 論

在本研究中筆者使用生物信息學(xué)方法分析了ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中的表達變化及功能。首先,在GEO中搜索與創(chuàng)傷后膿毒癥相關(guān)的數(shù)據(jù)集,最終納入3個數(shù)據(jù)集(GSE28750、GSE70311及GSE12624),分析結(jié)果均表明ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中表達升高,ANXA3可能參與創(chuàng)傷后膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。進一步的功能分析發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中ANXA3與細(xì)胞因子(IL10、IL1R1),趨化因子(CCL19、CXCL13),表面分子(CD163、CD55、CD58)等多種免疫基因表達相關(guān)。GO和KEGG富集分析均提示ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中通過影響免疫調(diào)節(jié)通路發(fā)揮作用。因此,ANXA3可能是作為創(chuàng)傷后膿毒癥早期預(yù)警的生物標(biāo)志物及治療新靶標(biāo)。

目前,多項研究證實ANXA3可以激活多種信號通路,通過促進血管生成、血栓形成、誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫,在感染、腫瘤、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[14]。目前已有研究表明ANXA3轉(zhuǎn)錄組水平在膿毒癥患者中升高[10-11]。且有研究證實ANXA3蛋白在膿毒癥小鼠不同組織和細(xì)胞上的表達情況;利用ANXA3基因敲除小鼠通過不同的實驗?zāi)Ｐ?探索了ANXA3在膿毒癥中的作用,結(jié)果表明ANXA3可作為膿毒癥的生物標(biāo)志物[15]。蔣萬威和楊國輝[16]對膿毒癥外周血及膿毒癥心肌功能障礙差異基因進行GO和KEGG富集分析,得出ANXA3是膿毒癥心肌功能障礙潛在的關(guān)鍵基因。在本研究中,筆者通過3個不同的創(chuàng)傷后膿毒癥數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)并驗證了ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中表達上調(diào),進一步表明了ANXA3在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。既往研究表明ANXA3參與多種疾病的免疫炎癥反應(yīng)[14]。Zhu等[17]研究表明ANXA3通過誘導(dǎo)趨化因子CXCL8和CCL25釋放,從而上調(diào)中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比率。Meng等[18]研究證明當(dāng)ANXA3下調(diào)時血清中IL-6、TNF水平明顯降低。本研究中,筆者分析了ANXA3與細(xì)胞因子、趨化因子和表面分子等多種免疫應(yīng)答分子的相關(guān)性,其中IL10、IL1R1、CCL19、CXCL13、CD163、CD55和CD58等與ANXA3表達呈正相關(guān),進一步證實了ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中參與調(diào)控免疫應(yīng)答途徑,從而在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

為進一步探索ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中發(fā)揮作用的功能,本研究比較了創(chuàng)傷后膿毒癥患者中ANXA3高表達組與低表達組間的差異表達基因,共發(fā)現(xiàn)416個基因差異表達,并對其生物學(xué)功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進行功能分析。GO和KEGG分析提示差異基因主要參與中性粒細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象、免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞活化和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用等通路。Perl等[19]研究發(fā)現(xiàn)ANXA3具有延長中性粒細(xì)胞壽命的作用,并與終末器官損傷有關(guān)。同時,目前的研究證實ANXA3介導(dǎo)鈣依賴顆粒-噬菌體融合,從而增強中性粒細(xì)胞對微生物的殺滅活性。因此,本研究進一步證實ANXA3可能通過介導(dǎo)上述生物學(xué)進程參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。這些富集的信號通路也可能是創(chuàng)傷后膿毒癥患者的診療評估中的關(guān)鍵因素,為膿毒癥的治療提供新思路。

本研究尚有不足之處。一是由于本研究獲得的結(jié)果僅包含3個數(shù)據(jù)集,納入研究的樣本量有限,容易造成誤差,可進一步增加GEO芯片數(shù)據(jù)或聯(lián)合其他數(shù)據(jù)庫進行分析;二是本研究基于生物信息學(xué)分析,未進行大規(guī)模的臨床樣本驗證,需要更大的多中心前瞻性研究來進一步驗證。今后課題組的相關(guān)工作將基于臨床樣本進行實驗研究,以驗證本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性,并進一步探索ANXA3參與創(chuàng)傷后膿毒癥的作用機制。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥患者中表達上調(diào),可能在創(chuàng)傷的早期階段預(yù)測膿毒癥的發(fā)生風(fēng)險。同時,ANXA3在創(chuàng)傷后膿毒癥中參與調(diào)節(jié)多條免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)通路,為以ANXA3作為創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生發(fā)展的分子靶標(biāo)研究提供新的思路。

作者貢獻聲明：馬聰聰:論文起草及撰寫;陸紅祥:數(shù)據(jù)分析并制作圖表、論文修改;馬筱潔:數(shù)據(jù)收集整理;史清海:設(shè)計方案、論文修改及審校