南海冷泉區(qū)深海沉積物來源放線菌的分離培養(yǎng)及其抑菌活性

陳以秋，韓梅桂，韓 壯，唐 敏

（1. 海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，?？?570228; 2. 中國科學(xué)院 深?？茖W(xué)與工程研究所，三亞 572000）

放線菌具有重要的生態(tài)學(xué)意義，也是很多生物活性物質(zhì)的來源之一[1]。放線菌種類繁多，在陸地和水域生態(tài)系統(tǒng)中都有廣泛分布。國內(nèi)外的研究者在陸源放線菌及其活性物質(zhì)方面已開展了較充分的研究，從相關(guān)菌株中也發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物。目前對海洋環(huán)境中放線菌的研究還需進(jìn)一步加強(qiáng)，特別是對深海區(qū)域放線菌的探索和開發(fā)尚處于起步階段。地球表面約71%的面積是海洋，其中95%的海域深度超過1 000 m[2]，深海環(huán)境具有高壓、低溫、黑暗、寡營養(yǎng)等特征，生活在其中的生物也具備相應(yīng)獨(dú)特的適應(yīng)能力，這些適應(yīng)能力通常伴隨著對基因、初級及次級代謝途徑的調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)在長期的進(jìn)化過程中，深海放線菌等生物體內(nèi)常產(chǎn)生有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的次生代謝物，且具有一定的生物活性[4-5]，而且這些活性物質(zhì)具有是陸源微生物中未被發(fā)現(xiàn)過的新穎化合物結(jié)構(gòu)[6]，具有重要的研究價(jià)值?？梢?，廣闊而獨(dú)特的深海環(huán)境是研究和開發(fā)放線菌資源的良好場所。

南海是西太平洋最大的邊緣海域，海域面積達(dá)350萬km2，平均深度為1 350 m，最深深度超過5.5 km[7-8]。冷泉是一種特殊的海底環(huán)境，在冷泉深部富含硫化氫、甲烷等碳?xì)浠衔锏牧黧w會向海底表面滲漏或噴發(fā)，因此冷泉環(huán)境中含有大量的甲烷[9]，因此冷泉環(huán)境中的微生物群落優(yōu)勢種屬多為硫酸鹽還原菌、好氧甲烷菌、氧甲烷菌、硫氧化菌等[10]，該類群的冷泉微生物豐富度高于熱液和普通海底沉積物[11]。不同冷泉的微生物群落存在差異[12]。南海冷泉區(qū)微生物資源多樣性豐富[13]，從南海冷泉區(qū)豐富的微生物資源中尋找新型次級代謝產(chǎn)物有利于加強(qiáng)對海馬冷泉未知生物資源的開發(fā)與利用。已有許多新型活性物質(zhì)來源于南海冷泉微生物[14-19]，對微生物資源的利用推動了深海微生物資源的應(yīng)用潛力評價(jià)。

海馬冷泉位于南海西北陸坡，是南海2個活躍的冷泉之一[10]，目前對海馬冷泉微生物群落研究較少[20-23]。本研究主要在南海海馬冷泉區(qū)，對沉積物中的放線菌進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)鑒定、多樣性分析及次級代謝產(chǎn)物抗菌活性的研究，旨在挖掘海馬冷泉區(qū)可培養(yǎng)的放線菌資源，及其潛在的生物活性價(jià)值，為后續(xù)研究和開發(fā)冷泉放線菌資源提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 沉積物樣品由中國科學(xué)院深?？茖W(xué)與工程研究所“探索一號”科考船搭載的“深海勇士”號載人潛水器于2021年2月采集于南海海馬冷泉區(qū)。樣品采集后，放置4 ℃冰箱冷藏。巡航結(jié)束后，所有樣品放在冰上運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，放置4 ℃保存?zhèn)溆?。樣品分?組HM2、HM3、HM6（表1）。

表1 深海沉積物樣品信息表

抗菌活性檢測采用7種供試菌，即H119（糞腸球菌Enterococcus faecalis）、H57（甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）、G280（甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌methicillin-susceptibleStaphylococcus aureus,MSSA）、H442（亞胺培南敏感鮑曼不動桿菌imipenem-susceptibleAcinetobacter baumannii）、E292（亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌imipenemresistantAcinetobacter baumannii）、G1（高地芽孢桿菌Bacillus altitudinis）、F1（副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus）。菌株分離、發(fā)酵、抑菌活性測試使用相應(yīng)的培養(yǎng)基（表2）。

表2 深海沉積物放線菌分離、發(fā)酵、活性測試所用培養(yǎng)基配方

1.2 深海放線菌菌株分離與保存 在無菌條件下，稱取0.1 g深海沉積物樣品，加入1 mL無菌海水，振蕩10 min，隨后將沉積物懸濁液梯度稀釋10-1到10-6，稀釋倍數(shù)為10-6懸濁液100 μL于培養(yǎng)基中涂布，28 ℃倒置培養(yǎng)，每隔24 h觀察菌落生長狀況，待形成菌落后，挑取部分菌，采用三區(qū)劃線法接種到分離培養(yǎng)基，重復(fù)純化培養(yǎng)多次直至得到單一純化菌株。隨后用含25%甘油液體培養(yǎng)基凍存（-80 ℃）保種。

1.3 深海放線菌菌株鑒定 利用試劑盒提取DNA（TIANamp Bacteria DNA Kit），以16S rDNA序列通用引物27F/1492R[24]、Taq酶體系對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對PCR產(chǎn)物驗(yàn)證通過后測序（擎科生物公司）。測序結(jié)果拼接完成后，上傳EZbiocloud在線數(shù)據(jù)庫（https://www.ezbiocloud.net）進(jìn)行對比分析，獲得菌株的分類信息。以近緣菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象，采用MEGA軟件neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)及次級代謝產(chǎn)物的提取在2216E瓊脂培養(yǎng)基上采用平板劃線法培養(yǎng)菌株形成菌落，挑取單菌落，接種至5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)（28 ℃，180 r·min-1）3 d，獲得種子菌液。隨后，按照發(fā)酵培養(yǎng)基∶種子液（v∶v）= 100∶5的比例進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（28 ℃，180 r·min-1）7 d，發(fā)酵液總體積為105 mL。發(fā)酵完成后，取乙酸乙酯與發(fā)酵液等體積充分混合，萃取3次，有機(jī)相合并后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮獲得粗提物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 深海放線菌的抑菌活性分析 采用K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[25]檢測放線菌發(fā)酵粗提物對7種供試菌的抑菌活性。用甲醇（分析純）配制待測粗提物溶液（10 g·L-1），分2次滴加到滅菌濾紙片（直徑6 mm）上，每次滴加5 μL，將風(fēng)干的濾紙片貼在涂布了供試菌的固體培養(yǎng)基上（供試菌稀釋至10-3涂布），采用萬古霉素以及氯霉素（1 g·L-1）為陽性對照，甲醇溶液為空白對照，37 ℃培養(yǎng)24 h。通過與陽性對照的抑菌圈直徑對比，判斷粗提物的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 深海沉積物中放線菌的菌種分離鑒定及其多樣性分析 實(shí)驗(yàn)從HM2、HM3、HM6三組沉積樣中分離出50株放線菌，從HM3樣品組中分離的放線菌最多，共26株，其次是HM6樣品組，19株，HM2樣品組的最少，只有5株（圖1）。這50株放線菌都屬稀有類型，形態(tài)類似于細(xì)菌，無氣生菌絲，隸屬于7個屬（圖2），其中類諾卡式菌屬（Nocardioides）22株、迪茨氏菌屬（Dietzia）13株、喬治菌屬（Georgenia）6株、考克氏菌屬（Kocuria）4株、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）2株、小單孢菌屬（Micromonospora）2株、印度洋金色丸菌屬（Chryseoglobus）1株。各放線菌屬間的相對豐富度呈現(xiàn)一定差異，其中類諾卡氏菌屬在3組樣品中屬于優(yōu)勢菌。采用2216E培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基和ISP3瓊脂培養(yǎng)基分別篩選到18、29和3株放線菌，R2A培養(yǎng)基更適合用于篩選深海放線菌?；趯撛谛戮N的界定[26-28]，在這50株放線菌中，有6株與近緣菌株16S rRNA基因的相似度低于98.7%，初步判斷為潛在新種（表3）。

圖1 從各沉積樣品中分離到的放線菌種類

圖2 分離出的50株放線菌與近緣菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 50株放線菌中潛在的新菌株

2.2 放線菌的抑菌活性分析 通過對50株放線菌的發(fā)酵液粗提物進(jìn)行抑菌活性分析，發(fā)現(xiàn)7株放線菌的粗提物對3種供試菌顯示出不同程度的抑菌作用，抑制活性比例為14%。其中，5株菌對F1有抑菌活性，4株對G280有活性，2株對H57有活性。編號為 LDBS2366和LDBS2469的菌株粗提物僅對 G280 有抑菌活性。 LDBS3832、LDBS3950和 LDBS3974對F1有輕微抑菌活性，此外LDBS3974 對H57也有輕微抑菌活性。LDBS3949的菌株粗提物對H57、G280、F1均有抑菌活性。LDBS3988的菌株粗提物對G280和F1有抑菌活性。50株放線菌粗提物對H119、H422、E292、G1均沒有活性。小單孢菌屬的抑菌活性及抑菌范圍都優(yōu)于類諾卡式菌屬（表4）。其中，小單孢菌屬的菌株LDBS3949和LDBS3988呈現(xiàn)出良好的抑菌效果。

表4 放線菌代表性菌株的抗菌活性

3 討 論

從南海海馬冷泉區(qū)的三組沉積物樣品中分離到50株放線菌，屬于5個科，7個屬，其中類諾卡式菌屬、迪茨氏菌屬是優(yōu)勢菌，后者為海洋特有。這與從南大西洋深海沉積物分離出的36株放線菌不同，屬于6個科，8個屬，其中微球菌屬、迪茨氏菌屬和微桿菌屬是優(yōu)勢菌[29]，也有實(shí)驗(yàn)分離出132株放線菌，屬于13個科，19個屬，其中考克氏菌屬、短桿菌屬和鏈霉菌屬是優(yōu)勢菌[30]。在這些沉積樣品中，共有種屬的放線菌有迪茨氏菌屬、考克氏菌屬、微球菌屬、微桿菌屬。不同沉積樣品的放線菌種屬存在著差異，這可能一方面是源自地域環(huán)境差異，另一方面是因不同的培養(yǎng)條件和分離方法造成的?；趯撛谛路N的界定，本研究分離的放線菌中有6株的相似性低于98.7%初步認(rèn)為是潛在新種，它們屬于迪茨氏菌屬、類諾卡式菌屬、小單孢菌屬。有研究發(fā)現(xiàn)Nocardioidessp.strain CF18利用單加氧酶（pBMO）在丁烷上生長，而pBMO與甲烷氧化細(xì)菌的甲烷單加氧酶（pMMO）基因序列相似[31]，推測這些酶助力于類諾卡式菌屬菌株在含大量甲烷環(huán)境的冷泉中能生存并成為優(yōu)勢屬。

本研究中發(fā)現(xiàn)諾卡式菌屬和小單孢菌屬的發(fā)酵液粗提物都呈現(xiàn)出較好的抗菌活性，其中，小單孢菌屬的LDBS3988和LDBS3949菌株對G+菌MRSA、MSSA，以及G-菌V. parahaemolyticus都表現(xiàn)出抑制作用。Zhang等[32]曾從南海沉積物來源的小單孢菌屬的次級代謝產(chǎn)物中分離到3個新化合物fluostatins I-K，小單孢菌屬的次級代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用。除了能產(chǎn)多種化合物的小單孢菌屬外，本研究分離到的類諾卡式菌屬對MRSA、MSSA、V. parahaemolyticus也呈現(xiàn)出一定的抗菌活性，這是首次報(bào)道深海來源類諾卡式菌屬有抑菌活性。尤其是小單孢菌屬的2株菌LDBS3988和LDBS3949的發(fā)酵粗提物呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性，具有較好的深入研究價(jià)值。

目前對南海冷泉沉積樣品中硫化細(xì)菌的研究較多[33]，但對放線菌的研究還較少。本研究揭示了冷泉區(qū)豐富的放線菌資源，這些具有活性的菌株可作為挖掘深海放線菌抗菌天然產(chǎn)物的重要資源。后期研究將通過優(yōu)化培養(yǎng)條件、發(fā)酵條件、激活沉默次級代謝合成途徑等手段進(jìn)一步挖掘新穎活性化合物，為從深海極端環(huán)境中尋找新型抗生素提供參考資料。