復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1表達(dá)及意義#

徐麗偉 張圓圓 康樂 王杉杉 趙青竹

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，河南 開封 475100）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（Recurrent spontaneous abortion，RSA）指連續(xù)發(fā)生率兩次及以上自然流產(chǎn)，其發(fā)生原因較復(fù)雜，可能與免疫、內(nèi)分泌、遺傳等因素有關(guān)，RSA對孕婦生理及心理均造成較大影響，臨床需根據(jù)RSA患者情況準(zhǔn)確判斷其RSA發(fā)生原因并及時采取應(yīng)對、治療措施，降低流產(chǎn)風(fēng)險，預(yù)防患者再次流產(chǎn)。

胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞在胚泡侵襲子宮內(nèi)膜、胎盤形成及孕期內(nèi)分泌等存在重要作用，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡與胎盤生長發(fā)育密切相關(guān)。自噬為真核細(xì)胞基礎(chǔ)代謝反應(yīng)之一，可維持細(xì)胞動態(tài)穩(wěn)定，輔助物質(zhì)、能量再利用，參與妊娠各個時期的生理及病理過程，正常自噬對妊娠存在促進(jìn)作用，但自噬過度會破壞細(xì)胞穩(wěn)定，導(dǎo)致胎盤組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等損傷甚至凋亡，引發(fā)胚胎死亡及流產(chǎn)。胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞微管相關(guān)蛋白輕鏈3（Light chain，LC3）能靶向定位于自噬體膜，參與自噬過程。自噬相關(guān)蛋白Beclin-1為自噬體形成的必須分子之一，監(jiān)測胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平可反應(yīng)胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平。

目前臨床大多研究胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平與子癇前期的關(guān)系。因此，本次旨在分析RSA患者胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1表達(dá)及其意義，為臨床防治RSA、降低流產(chǎn)率提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2021年1月至2021年12月河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的50例RSA患者及50例胚胎發(fā)育正常行人工流產(chǎn)者的臨床資料。將RSA患者納入RSA組，將人工流產(chǎn)者納入人工流產(chǎn)組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：RSA組患者均符合RSA診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；月經(jīng)正常，無腫瘤、畸形等生殖系統(tǒng)疾?。粺o糖尿病等內(nèi)分泌疾病；夫妻雙方染色體均正常；人工流產(chǎn)組均有正常妊娠、分娩史。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在明確環(huán)境、遺傳因素導(dǎo)致流產(chǎn)；人工流產(chǎn)組存在不良妊娠、分娩史；高齡產(chǎn)婦。

RSA組中年齡22～31 歲，平均26.52±2.33 歲；流產(chǎn)次數(shù)2～4 次，平均3.12±0.46 次；早期流產(chǎn)29 例，晚期流產(chǎn)21 例。人工流產(chǎn)組中年齡21～33歲，平均26.89±2.41 歲；妊娠次數(shù)2～4 次，平均3.08±0.42 次；分娩次數(shù)1～3 次，平均1.97±0.43次。本次研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

RSA組及人工流產(chǎn)組均在其清宮術(shù)后采集其胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，并使用等滲生理鹽水漂洗其中血液，漂洗后放在凍存管內(nèi)，放入-80 ℃環(huán)境下保存。

1.2.2 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3檢測

取出凍存的絨毛組織，加入細(xì)胞裂解液，在4℃條件下以10000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，取30 μL上層清液使用考馬斯亮藍(lán)法調(diào)整蛋白濃度，依次使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜、5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入鼠抗人LC3Ⅱ、LC3I一抗，在4 ℃條件下放置過夜，然后使用緩沖鹽水和洗滌劑洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，在室溫下放置1 h，再次洗滌，洗滌后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑盒進(jìn)行顯影、定影，使用以色列DNR成像系統(tǒng)儀器分析蛋白條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，以LC3Ⅱ/LC3I為LC3相對表達(dá)量。

1.2.3 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞Beclin-1水平檢測

檢測方法同胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞Beclin-1水平檢測，測定其蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例或率（n（%））表示，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以Spearman分析模型分析相關(guān)性。組別賦值“RSA組”=1、“人工流產(chǎn)組”=0，計入二元Logistic回歸模型，以胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平為協(xié)變量，得出預(yù)測概率，以預(yù)測概率為聯(lián)合預(yù)測評估預(yù)測效能；將胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平及聯(lián)合預(yù)測錄入，繪制受試者工作曲線（Receiver operator characteristic，ROC），讀取曲線下面積（Area under the curve，AUC）、置信區(qū)間（Confidence interval，95%CI）、敏感度、特異度、截斷值。

2 結(jié)果

2.1 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平

RSA組患者胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平顯著高于人工流產(chǎn)組（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平比較（± SD，n=50）

表1 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平比較（± SD，n=50）

注：與人工流產(chǎn)組比較，*P＜0.05。

組別 LC3 Beclin-1 RSA組 1.43±0.31* 1.81±0.43*人工流產(chǎn)組 1.01±0.28 1.22±0.40

圖1 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平

2.2 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平與RSA發(fā)生的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman分析模型分析，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平與RSA發(fā)生呈正相關(guān)（r=0.783，P=0.003；r=0.825，P=0.002）。

2.3 胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平預(yù)測RSA發(fā)生的預(yù)測價值分析

ROC曲線中，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平預(yù)測RSA發(fā)生的AUC分別為0.862、0.862，截斷值分別為1.29、1.43；聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.942，敏感度為92.00 %，特異度為86.00 %，見圖2、表2。

表2 ROC曲線參數(shù)

圖2 ROC曲線

3 討論

RSA對孕婦身體造成較大傷害，且對孕婦及其家屬心理也造成較大心理壓力，RSA發(fā)生的影響因素較復(fù)雜，臨床需判斷RSA患者流產(chǎn)原因，并及時采取針對性治療等應(yīng)對措施，降低流產(chǎn)率，因此需研究影響RSA患者流產(chǎn)的影響因素。

胎盤生長發(fā)育情況直接影響孕婦妊娠，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤組織生長發(fā)育及妊娠期內(nèi)分泌的重要作用細(xì)胞之一，當(dāng)胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞自噬活性升高，使胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降，從而導(dǎo)致胎盤著床較淺，引發(fā)流產(chǎn)。胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1均為自噬過程重要參與因子，其水平直接影響到自噬活性[2]。

本研究結(jié)果顯示，RSA組患者胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平顯著高于人工流產(chǎn)組；經(jīng)Spearman分析模型分析，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平與RSA發(fā)生呈正相關(guān)，提示胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1語RSA發(fā)生存在明顯相關(guān)性。究其原因，Beclin-1蛋白為自噬發(fā)生的主要蛋白之一，可調(diào)節(jié)自噬前體的生成，引導(dǎo)其他相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)移至自噬體膜，并平衡胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞自噬和凋亡[3]。LC3為自噬雙膜蛋白，在前自噬泡、自噬泡膜表面均有存在，參與自噬體形成、生長過程，可反映自噬程度[4]。當(dāng)胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平上升時，表示自噬程度升高，一方面過量自噬可能直接導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，另一方面過量自噬可降解生存素等抗凋亡因子的釋放，引發(fā)胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胎盤著床淺，孕婦發(fā)生流產(chǎn)。

并且，本研究通過ROC曲線顯示，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平預(yù)測RSA發(fā)生的AUC分別為0.862、0.862，截斷值分別為1.29、1.43；聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.942，敏感度為92.00 %，特異度為86.00 %，說明當(dāng)孕婦胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3≥1.29、胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞Beclin-1水平≥1.43時，孕婦發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險極高。原因在于，當(dāng)胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平異常升高時，發(fā)生病理性細(xì)胞凋亡，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致胎盤發(fā)育障礙以及內(nèi)分泌等功能異常，引發(fā)流產(chǎn)[5]。因此臨床可將胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平納入篩選RSA早期診斷的靶向目標(biāo)，及時采取針對性治療措施，降低流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險。

綜上所述，胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞LC3、Beclin-1水平與RSA發(fā)生存在明顯相關(guān)性，且其用于早期診斷RSA發(fā)生具有較高預(yù)測價值，為臨床防治RSA、降低流產(chǎn)率提供方向及參考依據(jù)。