多組學(xué)分析在昆蟲(chóng)滯育中的應(yīng)用

類(lèi)晶晶,公茂慶,劉麗娟

(山東省寄生蟲(chóng)病防治研究所醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)部,山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院),山東濟(jì)寧 272033)

組學(xué)是把與研究目標(biāo)相關(guān)的所有因素綜合在一起,作為一個(gè)“系統(tǒng)”來(lái)研究,是基于整體角度對(duì)某一組分的研究和評(píng)估(Hasinetal., 2017);包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等,各組學(xué)之間既相互獨(dú)立又具有聯(lián)系,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)技術(shù),將昆蟲(chóng)研究中的問(wèn)題展現(xiàn)在基因、蛋白質(zhì)和代謝物三個(gè)不同層次水平上,有利于進(jìn)一步探索和研究昆蟲(chóng)發(fā)育中的各項(xiàng)問(wèn)題。當(dāng)前組學(xué)技術(shù)已成為解讀昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程的新工具,為昆蟲(chóng)尤其是害蟲(chóng)的預(yù)防和控制奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

滯育是昆蟲(chóng)為應(yīng)對(duì)光周期、溫度等環(huán)境因素變化而進(jìn)入停滯發(fā)育的一種休眠形式,是一種適應(yīng)性和可塑性的表型,也是昆蟲(chóng)在不良環(huán)境下得以生存、繁衍和進(jìn)化的一大重要特征(Raglandetal., 2019; 姜春艷等,2021)。昆蟲(chóng)滯育過(guò)程主要包含三個(gè)階段,即滯育前期、滯育期和滯育后期(Kostál, 2006),且不同昆蟲(chóng)的滯育發(fā)生時(shí)期有所差異,即可能出現(xiàn)在卵、幼蟲(chóng)或若蟲(chóng)、蛹或成蟲(chóng)階段(Ko?táletal., 2017; Hutfilz, 2022)。單一組學(xué)研究結(jié)果可以從某一層面解釋滯育調(diào)控的分子機(jī)制,但尚不能系統(tǒng)全面的闡明其間的具體因果關(guān)系。進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代,轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等功能性“組學(xué)”技術(shù)為深入了解昆蟲(chóng)滯育提供了更為有效的方法;多組學(xué)分析是以中心法則為基礎(chǔ),綜合兩種以上組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行的比較關(guān)聯(lián)分析,利用不同組學(xué)水平分析結(jié)果間的相關(guān)性實(shí)現(xiàn)對(duì)單一數(shù)據(jù)的整合和深入分析,并在不同層面得到補(bǔ)充和印證,即更精準(zhǔn)的確定與滯育相關(guān)的差異基因、蛋白質(zhì)和代謝標(biāo)志物,有助于進(jìn)一步完善昆蟲(chóng)滯育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

本文主要綜述了組學(xué)以及多組學(xué)技術(shù)在昆蟲(chóng)滯育及其相關(guān)生理生化過(guò)程中的應(yīng)用,有助于更加深入了解昆蟲(chóng)生命活動(dòng)規(guī)律,為進(jìn)一步探明昆蟲(chóng)對(duì)當(dāng)前環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制以及探索害蟲(chóng)有效防制措施提供理論依據(jù)。

1 各組學(xué)技術(shù)在昆蟲(chóng)滯育中的應(yīng)用

1.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的研究,其分析方法依托于分子雜交技術(shù)和測(cè)序技術(shù)?，F(xiàn)今,轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已在多種昆蟲(chóng)滯育調(diào)控機(jī)制的研究中應(yīng)用(Zhaoetal., 2016; Dengetal., 2018; 劉敏,2020;孟佳和黃建,2022;趙娜等,2022)。研究者對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的昆蟲(chóng)進(jìn)行高通量測(cè)序,獲得昆蟲(chóng)全部生命時(shí)期的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄譜,為昆蟲(chóng)尤其是害蟲(chóng)的預(yù)防和控制奠定了重要的理論基礎(chǔ)(楊帆等,2014)。對(duì)同一昆蟲(chóng)滯育與非滯育階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析比較,以獲得滯育相關(guān)差異基因,從轉(zhuǎn)錄水平闡釋該昆蟲(chóng)的滯育調(diào)控機(jī)制(張博等,2020;李艷艷等,2021)。此外,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)也可驗(yàn)證一些激素或者基因在昆蟲(chóng)滯育過(guò)程中發(fā)揮的作用或者參與的具體的調(diào)節(jié)機(jī)制(Duetal., 2022; 姚知含等,2022)。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,RNA-Seq技術(shù)已成為在轉(zhuǎn)錄組水平上分析差異基因表達(dá)不可缺少的工具。Christine Merlin課題組借助RNA-seq等方法對(duì)北美帝王蝶Danausplexippus的生物鐘基因及晝夜節(jié)律系統(tǒng)進(jìn)行了深入的研究(Iiamsetal., 2019; Lugenaetal., 2019),獲得帝王蝶滯育分子機(jī)制的重要信息;Poupardin等人(2015)同樣采用RNA-seq技術(shù)對(duì)緣吸汁果蠅Chymomyzacostata幼蟲(chóng)滯育分析發(fā)現(xiàn)短光照觸發(fā)滯育與光周期敏感階段20-羥基蛻皮酮信號(hào)通路的抑制有關(guān)。借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),人們對(duì)昆蟲(chóng)的滯育行為有了更為豐富和客觀的認(rèn)識(shí)。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是以細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律為主要內(nèi)容的研究(Wilkinsetal., 1996),目前多借助于雙向凝膠電泳、iTRAQ/TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析、等電聚焦及生物質(zhì)譜分析等技術(shù)手段對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能鑒別和分類(lèi)。與滯育相關(guān)聯(lián)的蛋白在滯育期可特異表達(dá),多以?xún)?chǔ)藏蛋白、抗凍蛋白、熱休克蛋白、分子伴侶或其他重要的代謝調(diào)節(jié)酶類(lèi)物質(zhì)形式存在,在昆蟲(chóng)適應(yīng)及抵抗逆境脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用(張禮生等,2015)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)大多采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),再結(jié)合質(zhì)譜及生物信息學(xué)方法,對(duì)滯育期和非滯育期的昆蟲(chóng)進(jìn)行比較,獲得與滯育相關(guān)聯(lián)的蛋白,如黃鳳霞等人(2015)利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對(duì)煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis滯育前期及滯育期進(jìn)行分析,獲得與脂代謝相關(guān)的蛋白有脂質(zhì)運(yùn)載/胞質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白(gi322794737)、C型凝集素(gi607305114)、肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(W4X351_ATTCE)以及芳基貯存蛋白α亞基(gi332018934)等;Liu等人(2022)利用TMT蛋白定量技術(shù)聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析技術(shù)揭示歐洲熊蜂Bombusterrestris的滯育發(fā)生機(jī)制。此外蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在鞘翅目(七星瓢蟲(chóng)Coccinellaseptempunctata、沙蔥螢葉甲Galerucadaurica)、雙翅目(傘裙追寄蠅Exoristacivilis、淡色庫(kù)蚊Culexpipienspallens)及膜翅目(茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebustestaceipes)等昆蟲(chóng)中均有所應(yīng)用(劉遙,2014;Maetal., 2019; 張倩等,2019;劉敏,2020;韓海斌等,2021)。

1.3 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定性定量分析的一門(mén)學(xué)科,是繼轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)后的一項(xiàng)新技術(shù),常采用核磁共振、質(zhì)譜、色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法。代謝是基因與表型之間的重要橋梁,基于代謝層面的組學(xué)分析可通過(guò)篩選滯育相關(guān)差異代謝物,從代謝角度分析昆蟲(chóng)的滯育調(diào)節(jié)分子機(jī)制,而這種調(diào)節(jié)多與昆蟲(chóng)的抗寒性有關(guān)。如Li等人(2015)研究發(fā)現(xiàn)滯育和非滯育寄生蜂的代謝譜中多種冷凍保護(hù)劑、氨基酸和碳水化合物的水平有顯著差異,且宿主滯育狀態(tài)也對(duì)寄生蜂的代謝特征產(chǎn)生顯著影響;Ko?tál等人(2016)發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的高抗凍性與參與精氨酸和脯氨酸代謝的高水平氨基酸化合物密切相關(guān);昆蟲(chóng)滯育期產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物除了起冷凍保護(hù)劑的作用,還可能兼具代謝時(shí)鐘或時(shí)間保持器的調(diào)節(jié)作用(Lehmannetal., 2018)。

近年來(lái)組學(xué)分析技術(shù)在昆蟲(chóng)滯育中的應(yīng)用研究列于表1。無(wú)論是轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)還是代謝組學(xué),在昆蟲(chóng)滯育研究中都起到了不可忽視的作用,但單一組學(xué)研究結(jié)果往往局限于某一水平層次中,系統(tǒng)性和全面性不足,可能需要多個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)間的相互印證和補(bǔ)充以及更深層次的研究;此外樣本所處的滯育或生長(zhǎng)發(fā)育階段及質(zhì)量也與組學(xué)分析結(jié)果息息相關(guān)。

2 多組學(xué)聯(lián)合分析在昆蟲(chóng)滯育中的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析

雖然轉(zhuǎn)錄組學(xué)基于mRNA轉(zhuǎn)錄水平,蛋白質(zhì)組學(xué)基于蛋白質(zhì)翻譯水平,但兩者均用來(lái)展現(xiàn)基因的表達(dá)情況。將從兩者篩選得到的差異基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行通路富集,一方面可以有效提高蛋白的鑒定數(shù)量,另一方面也可以從蛋白水平對(duì)轉(zhuǎn)錄基因的突變信息進(jìn)行驗(yàn)證。因此蛋白質(zhì)組學(xué)常與轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行聯(lián)合分析,篩選出大量可能與昆蟲(chóng)滯育相關(guān)的基因和蛋白(Maetal., 2019),用以描述生物功能因果關(guān)系的完整性。

目前,轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析主要應(yīng)用于鞘翅目、鱗翅目、雙翅目以及膜翅目昆蟲(chóng)中,尤其在越冬昆蟲(chóng)的研究中應(yīng)用較多。以滯育狀態(tài)越冬的昆蟲(chóng)面臨諸多挑戰(zhàn),一方面食物短缺難以彌補(bǔ)能量的消耗,迫使該環(huán)境下生存的昆蟲(chóng)儲(chǔ)備大量的物質(zhì)能量以維持這一階段的正常生命活動(dòng);另一方面為抵御低溫的迫害,促使體內(nèi)產(chǎn)生低溫保護(hù)劑提高抗寒性,緩解或修復(fù)冷損傷(Teetsetal., 2023)。因此滯育期的特異基因和特異蛋白主要與碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生化代謝途徑相關(guān)聯(lián)。劉敏等人(2020)利用轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析,證實(shí)茶足柄瘤蚜繭蜂滯育相關(guān)基因和蛋白主要影響該昆蟲(chóng)的碳水化合物、脂質(zhì)和能量代謝以及蛋白質(zhì)翻譯等生物過(guò)程;中華通草蛉Chrysoperlasinica和日本通草蛉Chrysoperlanipponensis的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析結(jié)果也證實(shí)滯育相關(guān)基因和蛋白主要參與脂質(zhì)和碳水化合物代謝途徑,富集的代謝通路多與脂類(lèi)和碳水化合物相關(guān)(趙月明,2021;Chenetal., 2023)。另外,轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析常應(yīng)用于昆蟲(chóng)的生殖滯育研究中,Ma等人(2021)應(yīng)用基因克隆和RNAi技術(shù)證實(shí)了保幼激素JH信號(hào)通路在沙蔥螢葉甲生殖滯育中起著重要的調(diào)控作用;Yang等人(2020)發(fā)現(xiàn)大豆莢螟Etiellazinckenella與脂肪酸生物合成和長(zhǎng)壽調(diào)控相關(guān)的基因在滯育幼蟲(chóng)中表達(dá)上調(diào),而在新發(fā)育的蛹中表達(dá)下調(diào)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析在二斑葉螨Tetranychusurticae、煙蚜繭蜂等的生殖滯育研究中也有新的發(fā)現(xiàn)(Qiuetal., 2016; Zhaoetal., 2017)。此外,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析,證實(shí)昆蟲(chóng)激素通過(guò)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的滯育,如談倩倩等人(2016)運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)證實(shí)保幼激素參與調(diào)節(jié)滯育前脂質(zhì)積累、對(duì)抗逆基因的表達(dá)以及體內(nèi)的含水量,在大猿葉蟲(chóng)滯育中發(fā)揮了重要作用。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析

代謝組學(xué)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)的延伸,可為轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供更加表觀顯著的數(shù)據(jù)支持,基因的功能性變化最終會(huì)體現(xiàn)在代謝層面,而代謝物可以放大這些基因在功能水平的表達(dá),兩者聯(lián)合分析使結(jié)果更加明確的同時(shí)也讓檢測(cè)更為便捷。昆蟲(chóng)的滯育及滯育解除過(guò)程都離不開(kāi)糖類(lèi)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的加持,即滯育階段的差異基因及差異代謝物多與抗逆性以及抵抗力的提高有關(guān)。

滯育與非滯育狀態(tài)下昆蟲(chóng)的物質(zhì)代謝通路存在明顯的差異性,富集通路主要集中分布在物質(zhì)的合成和分解方面,甚至?xí)_(kāi)辟出新的代謝通路(Hahnand Denlinger, 2011; 劉遙,2014)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析在鞘翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲(chóng)中有所應(yīng)用。李媛媛等(2022)在轉(zhuǎn)錄和代謝水平上對(duì)滯育與非滯育傘裙追寄蠅蛹期進(jìn)行組學(xué)分析,獲得7 513個(gè)差異基因和501個(gè)差異代謝物,主要參與氨基酸代謝、神經(jīng)和消化系統(tǒng)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;劉敏(2020)研究結(jié)果表明茶足柄瘤蚜繭蜂滯育相關(guān)基因和代謝物在正離子模式下主要富集通路為氨基酸、脂以及核苷酸代謝通路,在負(fù)離子模式下,兩者僅富集到半乳糖代謝通路。轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)聯(lián)合分析往往結(jié)合生物信息學(xué)的方法,如王攀(2020)利用核磁共振技術(shù)分析了柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax滯育與非滯育蛹的代謝譜,通過(guò)GO分類(lèi)分析和KEGG分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)21種顯著差異代謝物多與三羧酸循環(huán)和抗寒性機(jī)制相關(guān),成功注釋的序列多與細(xì)胞過(guò)程、結(jié)合及催化活性相關(guān),KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋的通路以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)數(shù)量最多;另一對(duì)柑橘大實(shí)蠅蛹滯育的分析顯示,4 808個(gè)差異基因主要參與代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)和消化系統(tǒng)過(guò)程,作為溫度保護(hù)劑的脯氨酸和海藻糖在柑橘大實(shí)蠅的滯育調(diào)控中發(fā)揮重要作用(Wangetal., 2017)。此外Moos等人(2022)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)技術(shù)證實(shí)緣吸汁果蠅的食物攝入是碳骨架的重要來(lái)源,可直接同化或代謝轉(zhuǎn)化為昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)滯育和寒冷的冷凍保護(hù)劑。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析

蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析在昆蟲(chóng)中的應(yīng)用實(shí)例相對(duì)較少,在昆蟲(chóng)滯育層面相關(guān)的文獻(xiàn)少之又少。兩者聯(lián)合分析的案例雖然不多,但研究結(jié)果提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)資料.如棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera幼蟲(chóng)血淋巴和腦的平行蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析實(shí)驗(yàn),共獲得37個(gè)差異表達(dá)蛋白和22個(gè)差異代謝物,大腦中則均獲得49種差異蛋白和代謝物,其中兩實(shí)驗(yàn)中分別有28種和37種差異蛋白質(zhì)被成功鑒定,為棉鈴蟲(chóng)滯育分子機(jī)制闡明提供了線索(Zhangetal., 2012; 2013)。翼蚜外繭蜂Praonvolucre在滯育期間會(huì)積累高水平的山梨糖醇等低溫保護(hù)物質(zhì),多種蛋白質(zhì)也在這一時(shí)期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,包括具有細(xì)胞骨架和角質(zhì)層的重塑、脅迫耐受性、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、脂質(zhì)代謝和各種代謝酶等功能的蛋白質(zhì)(Colinetetal., 2012)。

多組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用有效避免了單一組學(xué)的局限性,通過(guò)多個(gè)組學(xué)間的內(nèi)在聯(lián)系,將基因、蛋白質(zhì)和代謝物三個(gè)維度間的信息優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),更具全面性和系統(tǒng)性,有助于推進(jìn)和完善昆蟲(chóng)滯育調(diào)控的分子機(jī)制,為益蟲(chóng)的生存和害蟲(chóng)的控制帶來(lái)新突破。表2為多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析在昆蟲(chóng)滯育研究中的案例。

表2 多組學(xué)分析技術(shù)在昆蟲(chóng)滯育中的應(yīng)用舉例

3 小結(jié)與展望

滯育是昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)不良環(huán)境條件暫時(shí)停止生長(zhǎng)發(fā)育的現(xiàn)象,為昆蟲(chóng)的生存、繁衍和進(jìn)化提供有利的保障。近年來(lái),人們對(duì)昆蟲(chóng)滯育的研究愈加深入,組學(xué)技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了昆蟲(chóng)滯育調(diào)控分子機(jī)制研究工作的進(jìn)步,通過(guò)單組學(xué)和多組學(xué)聯(lián)合分析等技術(shù),現(xiàn)已對(duì)部分昆蟲(chóng)的滯育機(jī)制有了突破性的研究進(jìn)展。但相關(guān)的工作大多缺乏功能性驗(yàn)證,即通過(guò)組學(xué)對(duì)滯育差異基因、蛋白或代謝物進(jìn)行初步分析和篩選,未對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證和挖掘,且多組學(xué)分析結(jié)果離不開(kāi)生物信息學(xué)分析結(jié)果的輔助,單一組學(xué)本身及組學(xué)數(shù)據(jù)間的整合仍然存在困難(Maoetal., 2019)。因此,想要真正解決昆蟲(chóng)滯育研究中的問(wèn)題,未來(lái)的研究一方面需要在不同組學(xué)數(shù)據(jù)間的整合方面做深入工作,以進(jìn)一步加強(qiáng)組學(xué)間的聯(lián)合應(yīng)用;另一方面在開(kāi)展多組學(xué)分析工作的同時(shí)應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)其與功能驗(yàn)證分析的聯(lián)合應(yīng)用,即通過(guò)組學(xué)分析獲得參與昆蟲(chóng)滯育調(diào)控的候選基因、蛋白或者代謝物,繼而利用RNAi、CRISPR基因編輯、以及經(jīng)典的分子生物學(xué)方法和技術(shù)等方式,明確候選基因、蛋白和代謝物的功能和參與調(diào)節(jié)滯育的深層機(jī)制。