草地貪夜蛾高致病力綠僵菌菌株的篩選與鑒定

趙建偉,丁雪玲,鄭 宇,趙金鳳,姚鳳鑾,盧學(xué)松,何玉仙*

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省作物有害生物綠色防控工程研究中心,福州 350013;2. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福州 350002)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda起源于美洲,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害極大,被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為全球重大遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一(Nagoshietal., 2017;Guietal., 2020),可危害玉米、高粱、大豆等200多種重要農(nóng)作物(Harrisonetal., 2019;彭國(guó)雄等,2019)。草地貪夜蛾于2019年初入侵我國(guó)云南地區(qū),現(xiàn)已擴(kuò)散至全國(guó)大部分地區(qū),給我國(guó)農(nóng)業(yè)及糧食安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅(潘興魯?shù)?2020;占軍平等,2020)。福建地處亞熱帶,氣候適宜常年種植玉米,為草地貪夜蛾越冬提供了良好的寄主條件,是草地貪夜蛾周年繁殖區(qū),防控任務(wù)艱巨(邱良妙等,2020)。

針對(duì)草地貪夜蛾在我國(guó)的遷飛路徑和危害特點(diǎn),國(guó)內(nèi)植保工作者已提出多種監(jiān)測(cè)防治手段并提出了殺蟲(chóng)劑田間應(yīng)用策略(劉妤玲等,2019),但過(guò)度依賴(lài)農(nóng)藥可能導(dǎo)致草地貪夜蛾產(chǎn)生抗藥性問(wèn)題。在草地貪夜蛾的起源地美國(guó)、巴西等國(guó)家,由于長(zhǎng)期依靠化學(xué)防治,導(dǎo)致其對(duì)傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了高水平抗性(Al-Sararetal., 2006;Zhangetal., 2020)。因此,生物防治相關(guān)方法也已被提出,如發(fā)掘和利用昆蟲(chóng)病原真菌(徐毓笛等,2020)、捕食性天敵(孫貝貝等,2020)、寄生性天敵(湯印等,2020)等生物資源進(jìn)行草地貪夜蛾防治。其中,利用昆蟲(chóng)病原微生物實(shí)施“以菌治蟲(chóng)”具有低毒、低殘留、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn),是害蟲(chóng)生物防治的關(guān)鍵措施,也是害蟲(chóng)綠色防控體系發(fā)展的趨勢(shì)(宋曉兵等,2016)。

綠僵菌作為一類(lèi)重要而常見(jiàn)的蟲(chóng)生真菌,可寄生多種害蟲(chóng),在農(nóng)、林及衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治中應(yīng)用廣泛(Donald and Dymond, 2004;張亞波等,2020)。國(guó)外在利用綠僵菌防治草地貪夜蛾方面已有較多報(bào)道,墨西哥、巴西等國(guó)家很多地區(qū)的玉米種植區(qū)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)大量被萊氏綠僵菌感染的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)(Ruiz-Nájeraetal., 2013;Ordóez-Garcíaetal., 2015);Akutse等(2019)測(cè)定了多種昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的毒力,其中金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死率低于10%。鑒于草地貪夜蛾在我國(guó)的入侵時(shí)間較短,國(guó)內(nèi)關(guān)于綠僵菌防治草地貪夜蛾的研究剛剛起步。彭國(guó)雄等(2019)在室內(nèi)條件下測(cè)定了金龜子綠僵菌CQMa421對(duì)草地貪夜蛾不同齡期幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)和卵的殺蟲(chóng)活性,發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)草地貪夜蛾低齡幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性并引起蛹黑化。2019年7～8月,鄭亞強(qiáng)等(2019)在云南省曲靖市玉米田調(diào)查發(fā)現(xiàn),田間草地貪夜蛾的萊氏綠僵菌感染率在2.52%～29.83%之間;雷妍圓等(2020)從廣州市玉米田染菌草地貪夜蛾幼蟲(chóng)上獲得一株萊氏綠僵菌,高濃度孢子懸浮液處理下草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的死亡率達(dá)100%。本研究從福建省不同地區(qū)收集罹病草地貪夜蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)以及其他鱗翅目和半翅目幼蟲(chóng)僵蟲(chóng),對(duì)病原真菌進(jìn)行常規(guī)分離及產(chǎn)孢培養(yǎng),采用浸漬法測(cè)試其對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)和蛹的致病力,并對(duì)高致病力菌株進(jìn)行鑒定,以期為草地貪夜蛾的生物防治提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株:采自福建省三明永安、漳州長(zhǎng)泰、龍巖上杭、南平建甌、莆田仙游、福州閩侯和永泰地區(qū)等田間罹病的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)以及其他罹病鱗翅目和半翅目幼蟲(chóng)僵蟲(chóng),在超凈臺(tái)內(nèi)挑取帶菌蟲(chóng)體少許孢子,采用劃線法接種于薩氏麥芽糖瓊脂酵母(SMAY)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、麥芽糖40 g、酵母浸粉2 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L),置于光照培養(yǎng)箱(溫度26±1℃, 相對(duì)濕度70%±5%,光周期L∶D=14 h∶10 h,)中培養(yǎng)。6～8 d后挑取孢子轉(zhuǎn)接到新的SMAY培養(yǎng)基中進(jìn)行單孢培養(yǎng),10～15 d后刮取分生孢子置于高壓滅菌處理的30%甘油中,震蕩混勻后于-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?。供試菌株詳?xì)信息見(jiàn)表1。

表1 供試綠僵菌菌株基本信息

供試蟲(chóng)源:供試草地貪夜蛾于2019年6月采自福建省建甌市東峰鎮(zhèn)玉米地,經(jīng)室內(nèi)人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室種群,室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度 26±1℃、相對(duì)濕度60%～70%、光周期L∶D=14 h∶10 h。選取2齡幼蟲(chóng)和1日齡蛹進(jìn)行致病力測(cè)定。

人工飼料:草地貪夜蛾人工飼料參考李子園等(2019)方法配制。

1.2 孢子懸浮液的制備

將供試菌株接種于SMAY固體培養(yǎng)基,置于光照培養(yǎng)箱(溫度26±1℃,相對(duì)濕度70%±5%,光周期L∶D=14 h∶10 h)中培養(yǎng)15 d,收集孢子,加入無(wú)菌0.05% Tween-80水溶液,充分震蕩后用6層無(wú)菌紗布濾掉菌絲體獲得孢子懸浮液,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),最終將孢子濃度調(diào)整為5×107個(gè)/mL備用。

1.3 菌株對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致死率測(cè)定

挑取大小一致、健康的草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)在濃度為5×107個(gè)/mL的供試菌株孢子懸浮液中浸漬5 s后取出晾干,然后將其移置人工氣候箱內(nèi)(溫度26±1℃,相對(duì)濕度65%±5%)用塑料養(yǎng)蟲(chóng)盒(直徑為3 cm,高為3 cm)單頭飼養(yǎng),養(yǎng)蟲(chóng)盒內(nèi)放入人工飼料供其取食。設(shè)3次重復(fù),每重復(fù)20頭幼蟲(chóng),以0.05% Tween-80無(wú)菌水處理的2齡幼蟲(chóng)為對(duì)照。每日定期記錄試蟲(chóng)的死亡數(shù)量,持續(xù)觀察8 d。死亡試蟲(chóng)及時(shí)挑出保濕培養(yǎng),若體表長(zhǎng)出白色菌絲并產(chǎn)綠色孢子,則視為染菌死亡。

1.4 菌株對(duì)草地貪夜蛾蛹的致死率測(cè)定

選取大小一致的1日齡蛹,放入配制好的濃度為5×107個(gè)/mL的供試菌株孢子懸浮液浸漬5 s后取出晾干,然后將其移置人工氣候箱內(nèi)(溫度26±1℃,相對(duì)濕度65%±5%)用塑料養(yǎng)蟲(chóng)盒(直徑為6 cm,高為5 cm)飼養(yǎng),養(yǎng)蟲(chóng)盒內(nèi)放入棉球保濕,每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)盒中放入5頭蛹。設(shè)3次重復(fù),每重復(fù)20頭蛹,以0.05% Tween-80無(wú)菌水處理的草地貪夜蛾蛹作為對(duì)照。每日定期記錄蛹的死亡情況(蛹體多次觸碰均無(wú)反應(yīng)則視為死亡),持續(xù)觀察8 d。死亡蛹體及時(shí)挑出保濕培養(yǎng),若體表長(zhǎng)出白色菌絲并產(chǎn)綠色孢子,則視為染菌死亡。

1.5 菌株鑒定

菌株形態(tài)學(xué)觀察:將高致力菌株FJMR2和FJXY7接種于SMAY培養(yǎng)基,于溫度26±1℃、相對(duì)濕度70%±5%、光周期L∶D=14 h∶10 h的人工氣候箱中培養(yǎng)7 d,記錄菌落培養(yǎng)特征,并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子形態(tài)以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

分子鑒定:提取純化菌株FJMR2和FJXY7的基因組DNA,利用真菌通用引物IT1(5′-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′)對(duì)菌株rDNA-ITS序列進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系:DNA模板2 μL(20 ng/μL),上、下游引物各2 μL(10 μmol/L),2×EsTaq PCR Master Mix 25 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 40 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后選擇相近序列,采用MEGA 7.0軟件的鄰接法重復(fù)1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2013和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn),分析比較不同菌株間的致病力差異,并利用Probit方法計(jì)算半數(shù)致死時(shí)間(LT50)。

死亡率(%)=死蟲(chóng)數(shù)/試蟲(chóng)總數(shù)×100。

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(100-對(duì)照組死亡率)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試綠僵菌菌株對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致病力

用5×107個(gè)/mL孢子濃度的懸浮液處理8 d后,8株綠僵菌菌株對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致病力差異顯著,其中菌株FJMR2和FJXY7對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致死率最高,分別為88.76%和82.13%;其次為菌株FJNP8和FJMR1,致死率分別為77.78%和76.19%;菌株FJMH4、FJYT6和FJLY5的致死率在52.33%～60.70%之間;菌株FJXY3的致死率最低,僅為28.25%。菌株FJMR2和FJXY7對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致死速率最快,半數(shù)致死時(shí)間(LT50)分別為4.81 d和4.93 d;其次為菌株FJNP8和FJMR1,LT50分別為5.37 d和5.53 d;菌株FJYT6、FJLY5和FJMH4的LT50在6.94 d～7.14 d之間;菌株FJXY3的致死率低于50%,故無(wú)法計(jì)算LT50(表2)。

2.2 供試綠僵菌菌株對(duì)草地貪夜蛾蛹的致病力

用5×107個(gè)/mL孢子濃度的懸浮液處理8 d后,8株綠僵菌菌株對(duì)草地貪夜蛾蛹的致病力差異顯著,其中菌株FJMR2和FJXY7對(duì)蛹的致死率最高,分別為86.57%和84.00%;其次為菌株FJNP8、FJMR1和FJMH4,致死率在72.74%～75.39%之間;菌株FJLY5的致死率為56.55%;菌株FJXY3和FJYT6的致死率均低于50%。菌株FJMR1、FJMR2、FJMH4和FJXY7對(duì)蛹的半數(shù)致死時(shí)間(LT50)為4.83～5.86 d,差異不顯著;菌株FJLY5和FJNP8對(duì)蛹的LT50分別為6.63 d 和6.29 d;菌株FJXY3和FJYT6對(duì)蛹的致死率均低于50%,故無(wú)法計(jì)算LT50(表3)。

表3 8株綠僵菌菌株對(duì)草地貪夜蛾蛹的毒力測(cè)定

總體上,菌株FJMR2和FJXY7對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)和蛹的致死率最高、半數(shù)致死時(shí)間最短。

2.3 菌株FJMR2和FJXY7的種類(lèi)鑒定

菌株FJMR2和FJXY7在SMAY培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)相似。培養(yǎng)7 d后,菌落直徑6～9 mm,質(zhì)地短絨狀凸起,正面乳白色,反面土黃色,無(wú)分泌物;菌絲表面光滑透明,具分隔,直徑1.1～4.2 μm;分生孢子梗著生于氣生菌絲,圓柱形,近基部明顯膨大,大小2.5～5.5×1.5～3.0 μm,瓶梗呈輪生狀,每輪3～5個(gè);分生孢子鏈生,卵圓形或橢圓形,大小2.5～4.0×1.5～2.5 μm,表面光滑(圖1-C)。初步鑒定菌株FJMR2和FJXY7為萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi。

圖1 萊氏綠僵菌形態(tài)特征及草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)和蛹感染萊氏綠僵菌的癥狀(以FJMR2為例)Fig.1 Morphological characteristics of Metarhizium rileyi and symptoms of infected Spodoptera frugiperdaexternal symptoms of larvae, pupa of Spodoptera frugiperda after infection Metarhizium riley (Take FJMR2 as an example)注:A,菌株生長(zhǎng)初期;B,菌株生長(zhǎng)后期;C,分生孢子和菌絲形態(tài);D,田間被綠僵菌感染的僵蟲(chóng);E,2齡幼蟲(chóng)染病初期;F,2齡幼蟲(chóng)染病后期;G,蛹染病后期;H,蛹染病前期。Note: A, Initial stage of colony growth; B, Late stage of colony growth; C, Mycelia and branched conidiophores; D, Symptoms of S.frugiperda infected by M.rileyi in field; E, Initial stage of the 2nd instar larvae infected by M.rileyi; F, Late stage of the 2nd instar larvae infected by M.rileyi; G, Late stage of the pupae infected by M.rileyi; H, Initial stage of the pupae infected by M.rileyi.

以ITS1和ITS4為引物,從菌株FJMR2和FJXY7基因組DNA分別擴(kuò)增出1條約550 bp的序列。將獲得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST相似性比對(duì),發(fā)現(xiàn)該2株菌株與MetarhiziumrileyiCBS 806.71(GenBank登錄號(hào)MH872111)的同源性高達(dá)99.9%以上,位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)最小進(jìn)化分支,親緣關(guān)系最近(圖2)。綜合菌株培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和分子生物學(xué)方法鑒定,最終確定菌株FJMR2和FJXY7均為萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi。

圖2 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株FJMR2和FJXY7與相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the strain FJMR2 and FJXY7 with others related species based on rDNA-ITS sequences

3 結(jié)論與討論

綠僵菌作為重要的害蟲(chóng)生防真菌,國(guó)內(nèi)外在其物種資源、致病力研究及生防產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中已取得重要成果(蒲蟄龍和李增智,1996)。鑒于草地貪夜蛾在我國(guó)的入侵時(shí)間較短,有關(guān)草地貪夜蛾綠僵菌資源的研究主要集中在金龜子綠僵菌和萊氏綠僵菌(彭國(guó)雄等,2019;雷妍圓等,2020)。致病力是評(píng)價(jià)菌株應(yīng)用潛力的核心指標(biāo),也是篩選優(yōu)良菌株的基本依據(jù),為進(jìn)一步挖掘防治草地貪夜蛾的優(yōu)良菌株,本研究測(cè)定了分離自福建省不同地區(qū)不同寄主的8株綠僵菌菌株對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)和蛹的致病力,發(fā)現(xiàn)8株供試菌株對(duì)草地貪夜蛾均有不同程度的致病力,致死率為28.25%～88.76%,LT50為4.81～7.14d。從中篩選出2株對(duì)草地貪夜蛾具較強(qiáng)致病力的菌株FJMR2和FJXY7,根據(jù)菌株形態(tài)特征和rDNA-ITS序列對(duì)比分析,鑒定2株菌株均為萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi。

萊氏綠僵菌又名萊氏野村菌Nomuraearileyi,可侵染多種鱗翅目害蟲(chóng),尤其針對(duì)夜蛾科多種為害較大的害蟲(chóng),如斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius、銀紋夜蛾Argyrogrammaagnata(Staudinger)、甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner等,是一種生防潛力極高的蟲(chóng)生真菌,在適宜的自然環(huán)境下能夠引發(fā)害蟲(chóng)的病害流行,顯著降低害蟲(chóng)的種群密度(Srisukchayakuletal.,2005;羅卿權(quán)等,2018)。周立峰等(2012)測(cè)定了5株萊氏綠僵菌對(duì)斜紋夜蛾的毒力,第10天的侵染率在60%～95%之間。胥志民等(2019)研究發(fā)現(xiàn),萊氏綠僵菌Nr 5772在5×109個(gè)/mL孢子濃度下對(duì)甜菜夜蛾3、4、5齡幼蟲(chóng)的LT50分別為4.44 d、4.48 d和4.85 d。雷妍圓等(2020)用孢子濃度為1×109個(gè)/mL的萊氏綠僵菌GZSF-1處理草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng),7 d后幼蟲(chóng)的死亡率達(dá)100%。本研究結(jié)果顯示,萊氏綠僵菌FJMR2和FJXY7對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)具有較高致病力,在5×107個(gè)/mL孢子濃度下對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死率均達(dá)80%以上,與龍秀珍等(2021)的研究報(bào)道結(jié)果一致。另研究發(fā)現(xiàn),FJMR2和FJXY7能侵染草地貪夜蛾蛹,在5×107個(gè)/mL濃度下對(duì)蛹的致死率達(dá)84%以上,大大降低了蛹的羽化率;而龍秀珍等(2021)研究發(fā)現(xiàn),萊氏綠僵菌CDTLJ1對(duì)草地貪夜蛾蛹的致死率僅有20%,可能是菌株地理來(lái)源不同,致病性差異較大造成的。土壤具有更好的保濕保溫能力,又可避免紫外線的照射,為孢子的萌發(fā)創(chuàng)造了有利條件,更適合綠僵菌等殺蟲(chóng)真菌對(duì)土壤中棲息害蟲(chóng)的防治(Maetal.,2019),而且在土壤中施加菌劑以防治地下害蟲(chóng)被認(rèn)為是一種安全有效且可持續(xù)的害蟲(chóng)防控措施(Roggeetal.,2017)。鑒于草地貪夜蛾大部分在土壤中化蛹,可以考慮在土壤中添加菌劑,達(dá)到對(duì)草地貪夜蛾持續(xù)控制的目的。

綜上所述,文中篩選到2株對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)及蛹有較高致病力的萊氏綠僵菌FJMR2和FJXY7,具有研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力,但本文研究結(jié)果是基于穩(wěn)定的室內(nèi)環(huán)境條件下取得的,如何讓該菌株在復(fù)雜的自然環(huán)境中發(fā)揮對(duì)草地貪夜蛾的持續(xù)控制作用仍有待進(jìn)一步研究。