連翹葉速溶茶制備及多種功能成分分析*

李 敬 尤 穎, 趙慶生 李 航 常森林

（1. 河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 石家莊 050061；2. 中國科學(xué)院過程工程研究所 北京 100190）

連翹（Forsythia suspensa）為木犀科連翹屬植物，具有清熱解毒、消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱等多種藥用功效（孫建瑞等，2017）。如，“連花清瘟膠囊”中含有連翹果，研究表明，連翹果中的連翹苷通過抑制核因子kappaB 信號通路的激活，有效抑制新型冠狀病毒的復(fù)制（Wanget al. 2021），對新冠肺炎有良好的治療效果，如，“連花清瘟膠囊”中含有連翹果?！吨腥A本草》中記載，連翹葉“性寒，主治心肺積熱”（國家中藥管理局編委會, 1999），連翹葉中也含有連翹苷、連翹酯苷A、連翹脂素等多種化學(xué)成分，并且連翹苷、連翹酯苷的含量遠(yuǎn)高于連翹果中的含量（范毅等，2015; 張旭等，2021）。

連翹具有保持水土的生態(tài)功能，在我國山西、河南、河北等地廣泛種植，僅在山西安澤縣的天然連翹林總面積達(dá)10 萬 hm2，每年秋季有大量落葉， 造成資源浪費(fèi) (龍沈飛等, 2019；任子蓓等，2016)。若能對連翹葉中功能成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，并且開發(fā)以連翹葉為原料的食品， 不僅可以提高連翹的經(jīng)濟(jì)效益, 保護(hù)自然資源, 也可使主要分布在華北地區(qū)的連翹林得以保護(hù)， 并為農(nóng)民增收、鄉(xiāng)村振興做貢獻(xiàn)。2017 年，山西省頒布了《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 連翹葉》，將連翹葉列入食品范疇（山西省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)審評委員會,2017），為連翹葉及其提取物產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。速溶茶粉是一種攜帶方便、沖泡簡單、深受年輕消費(fèi)者的喜愛的新型飲料，并且有效成分容易被人體吸收（Srivastav, 2012；羅龍新, 2019）。目前已開發(fā)的有黑果枸杞（Lycium ruthenicum）速溶粉、桑葉速溶茶粉，研究數(shù)據(jù)表明均保持較高的功能成分（楊冬彥, 2018a；2019；馮曉新, 2021），關(guān)于連翹葉速溶茶的研究未見報(bào)道。

本文以不同處理的連翹葉為原料，研究連翹葉速溶茶的制備工藝，并對制備的連翹葉速溶茶進(jìn)行感官評價(jià)及成分分析，以期為連翹葉速溶茶的工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，為連翹葉資源的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 3 種連翹葉（陰干連翹葉、炒制殺青的連翹葉、殺青發(fā)酵的連翹葉），源自山西省臨汾安澤縣。

1.1.2 試劑 連翹苷、連翹酯苷A、連翹脂素、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度均>98%）均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；沒食子酸采購自北京市興津化工廠；三氯甲烷采購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；高效液相色譜儀所用試劑為色譜純；其余均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為蒸餾水和超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 連翹葉提取工藝試驗(yàn) 以殺青發(fā)酵的連翹葉速溶茶得率為響應(yīng)值，分析料液比、浸提時(shí)間、溫度、提取次數(shù)對連翹葉速溶茶得率的影響，通過試驗(yàn)確定提取次數(shù)為2 次，采用Design-Expert 8.0.軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以優(yōu)化試驗(yàn)條件。因素水平設(shè)計(jì)見表1（Raymond， 2008）。

表1 因素水平設(shè)計(jì)Tab. 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 干燥方法對連翹葉速溶茶的影響 分別用熱風(fēng)干燥、冷凍干燥和噴霧干燥對連翹葉水提物進(jìn)行干燥，制備連翹葉速溶茶（楊冬彥， 2018b）。

1.2.3 理化性質(zhì)測定 溶解時(shí)間參照果香型固體飲料標(biāo)準(zhǔn)參照(QB/T 3623—1999）；穩(wěn)定性、堆積密度、吸濕率測定參照楊冬彥（2018b)的方法。

1.2.4 感官評價(jià) 根據(jù)固體飲料標(biāo)準(zhǔn)GB/T 29602—2013（國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會, 2013），對連翹葉速溶茶進(jìn)行感官評價(jià)。其中，色澤20 分，組織形態(tài)30 分，滋味30 分，氣味20 分，共計(jì)100 分。由10 名人員對連翹葉速溶茶進(jìn)行評分，結(jié)果取平均值。

1.2.5 污染物砷、鉛含量測定 分別參照《食品中總砷和無機(jī)砷的測定》（GB 5009.11—2014）（中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會，2014）和《食品中鉛的測定》（GB 5009.12—2017）（中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會，2017）分別測定砷含量、鉛含量。

1.2.6 成分測定 水分和灰分含量測定參照《固體飲料標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T 29602—2013）（國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會, 2013）；蛋白質(zhì)含量測定使用考馬斯亮藍(lán)法（曲春香, 2006）；黃酮含量測定使用紫外分光光度法；采用苯酚-硫酸法測定總糖含量（呂建平, 2014）；連翹苷、連翹酯苷A（孫建瑞, 2017）和連翹脂素含量測定采用液相色譜法（梅建鳳, 2016）。

1.2.7 膜分離提取速溶茶多糖 通過1.2.2 選定干燥方式制得3 種速溶茶粉：陰干連翹葉速溶茶粉（FSLD）, 炒制殺青連翹葉速溶茶粉（FSL-G）和殺青發(fā)酵連翹葉速溶茶粉（FSL-B）。取連翹葉速溶茶FSL-D、FSL-G、FSL-B 各20 g， 加200 mL 蒸餾水溶解，按照1∶4 的比例加入800 mL 的4 ℃預(yù)冷乙醇，靜置2 h，離心。將沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，48 h 后得粗多糖（FSLDP，F(xiàn)SL-GP，F(xiàn)SL-BP）；采用Sevag 法對粗多糖進(jìn)行純化（Burns, 2020）對粗多糖進(jìn)行純化；隨后用超濾膜對連翹葉多糖進(jìn)行分離，得到不同分子量分布范圍的多糖，分別命名為FSL-BP<1 kDa、3 kDa 10 kDa。

1.2.8 多糖抗氧化活性及紅外表征 DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基清除試驗(yàn)、ABTS（（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid））自由基清除試驗(yàn)參照Garzon（2009）。紅外光譜（Infrared Spectrum，F(xiàn)T-IR）利用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS50）進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS20.0進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式展示，顯著水平為P<0.05；繪圖采用Origin8.0、EXCEL 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹葉速溶茶制備工藝優(yōu)化

2.1.1 連翹葉速溶茶提取工藝單因素優(yōu)化 料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度對連翹葉速溶茶得率的影響見圖1。連翹葉速溶茶得率隨著料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)都有先上升后下降的趨勢，提取溫度對連翹葉速溶茶得率影響較大。較優(yōu)提取條件為料液比為1∶20 g·mL-1、提取時(shí)間150 min、溫度80 ℃、提取次數(shù)2 次。

圖1 料液比（a）、提取時(shí)間（b）、提取次數(shù)（c）、提取溫度（d）對連翹葉速溶茶得率的影響Fig. 1 Effects of solid-liquid ratio (a), extraction time (b), extraction times (c) and extraction temperature (d) on yield of Forsythia suspensa leaf instant tea

2.1.2 連翹葉速溶茶提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化 以連翹葉速溶茶得率為響應(yīng)值，根據(jù)表1 的數(shù)據(jù)，由Design-Expert 8.0 軟件得到連翹葉速溶茶得率的預(yù)測模型：響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。該模型回歸顯著（P<0.01），方程擬合良好。通過方差分析和回歸模型響應(yīng)面分析圖（圖2）可知，一次項(xiàng)C 因素對結(jié)果有顯著影響；二次項(xiàng)A2、交互項(xiàng)BC 對試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著，二次項(xiàng)B2對試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。

圖2 各因素對連翹葉速溶茶得粉率的交互影響Fig. 2 Response surface showing the interaction of various factors on the yield of Forsythia suspensa leaf instant tea powder

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 2Experimental results for orthogonal test analysis

通過響應(yīng)曲面優(yōu)化，較佳工藝參數(shù)為：料液比1∶20.14 g/mL，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間180 min，預(yù)測為15.876 1%。在最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果分別為15.16%、15.32%、15.40%，平均速溶茶得率為15.30%，與理論值相比其相對誤差約為0.576%。

2.1.3 連翹葉速溶茶干燥方式研究 由圖3 可知，干燥方式對連翹苷和連翹脂素的影響較大，噴霧干燥得到的連翹苷和連翹脂素含量分別為4.85%和0.11%，均高于熱風(fēng)干燥、冷凍干燥所得連翹苷和連翹脂素含量。這可能是由于噴霧干燥的干燥時(shí)間短，對功能成分的損失比較小。干燥方式對連翹酯苷A 的含量基本無影響。

圖3 不同干燥方式對連翹葉水提物中連翹苷、連翹酯苷A、連翹脂素的含量影響Fig. 3 Effects of different drying methods on the contents of phillyrin, forsythioside A and phillygenin in water extract of Forsythia suspensae leaves

2.2 原料選擇對連翹葉速溶茶品質(zhì)的影響

2.2.1 溶解時(shí)間 FSL-D、FSL-G、FSL-B 平均溶解時(shí)間分別為50.04 、55.19 和46.46 s，均小于60 s，其中FSL-B 的溶解性較好。

2.2.2 堆積密度 FSL-B 的堆積密度為0.43g·mL-1，低于FSL-D 和FSL-G 的堆積密度0.54 g·mL-1和0.47 g·mL-1，表明在一定體積下，F(xiàn)SL-B 的質(zhì)量較輕。

2.2.3 穩(wěn)定性 FSL-D、FSL-G、FSL-B 的K 值平均值分別為0.006、0.039 及0.003，均小于0.05，表明3 種連翹葉速溶茶的沖調(diào)穩(wěn)定性均較好，無顯著差別。

2.2.4 吸濕率 3 種連翹葉速溶茶的吸濕率如圖4 所示。在室溫條件下，在0~30 h 內(nèi)，3 種速溶茶的吸濕率增長較快，隨后增加較緩慢，在150 h 時(shí)逐漸達(dá)到平衡，此時(shí)FSL-D、FSL-G 和FSL-B 的吸濕率分別為21.27%、20.33%和16.78%，其中FSL-B 的引濕性相對較弱，更易于保存。

圖4 3 種連翹葉速溶茶在RH 為 80%±2%下的吸濕百分率Fig. 4 Hygroscopic percentage of three kinds of Forsythia suspensa leaf instant tea powder at 80%±2% Rh

2.2.5 速溶茶感官評價(jià) 收集得到連翹葉速溶茶的感官評分，根據(jù)樣品模糊關(guān)系矩陣式，3 種速溶茶均為一等品。其中FSL-B 的滋味、氣味優(yōu)于其他2 種連翹葉速溶茶，感官指標(biāo)得分較高，這可能與發(fā)酵過程中生成的特殊香氣和滋味有關(guān)（蔡麗, 2020）。

2.2.6 速溶茶污染物砷、鉛含量分析 FSL-D、FSLG 和FSL-B 的砷含量分別為0.007 4、0.006 6 和0.006 9 mg·kg-1，鉛含量分別為0.327 9、0.300 4 和0.325 7 mg·kg-1，符合國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017 食品中污染物限量指標(biāo)，固體飲料中砷含量<0.5 mg·kg-1、鉛含量≤1.0 mg·kg-1。

2.2.7 速溶茶功能成分分析 速溶茶的功能成分分析如表3 所示。3 種連翹葉速溶茶的水分和灰分含量均符合固體飲料標(biāo)準(zhǔn)（國家輕工業(yè)局，1999），蛋白質(zhì)含量均在11%以上，總酚含量為3.22%以上，總黃酮含量為4.44%以上，總糖含量為47.76%以上。3 種連翹葉茶中的連翹苷（C27H34O11）含量分別為3.69%（FSL-D）、3.33%（FSL-G）、3.82%（FSL-B）；在連翹酯苷A（C29H36O15）的含量方面，F(xiàn)SL-G 中含量較高，為19.96%， FSL-D、FSL-B 中分別為14.76%和15.50%。

表3 3 種連翹葉速溶茶成分含量表Tab. 3 Composition content table of three kinds of Forsythia suspensa leaf instant tea powder

2.2.8 速溶茶粗多糖 由表4 可知， FSL-B 中粗多糖含量較高，為26.22%，經(jīng)脫蛋白純化后，F(xiàn)SL-DP-D、FSL-GP-D、 FSL-BP-D 的多糖含量分別為25.09%、30.64%和31.36%，比純化前的多糖含量分別提高了28.40%、26.14%及19.60%。

表4 連翹葉速溶茶多糖得率及含量Tab. 4 4yield and content of crude polysaccharide of three kinds of Forsythia suspensa leaf instant tea powder

2.3 分子量對FSL-BP-D 多糖的影響

2.3.1 自由基清除能力測試 采用超濾膜分離不同分子量的多糖，并進(jìn)行抗氧化活性分析，結(jié)果見圖5。樣品對ABTS 自由基的清除能力與DPPH 自由基清除能力相似，隨著樣品分子量的增加，樣品的抗自由基清除能力越來越強(qiáng)。分子量大于10 kDa 多糖對DPPH自由基和對DPPH 自由基的IC50 分別為107 μg·mL-1與42 μg·mL-1，均優(yōu)于未進(jìn)行膜分離之前的多糖。

圖5 不同分子量多糖的ABTS（A）和DPPH（B）自由基清除能力Fig. 5 ABTS(A) and DPPH(B) radicalscavenging activityof polysaccharides with different molecular weight

2.3.2 紅外光譜分析 對多糖進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果見圖6。研究發(fā)現(xiàn)多糖的FT-IR 光譜圖在4 000~500 cm-1波數(shù)內(nèi)有典型的吸收峰：3 700~3 100 cm-1內(nèi)的寬吸收峰為O-H 伸縮振動，1 800~1 600 cm-1為 C=O伸縮振動峰，1 430~1 290 cm-1為-C-H 彎曲振動峰，1 200~1 000 cm-1為糖類C-O 伸縮振動峰。

圖6 不同分子量多糖的紅外光譜圖Fig. 6 Infrared spectra of polysaccharides with different molecular weights

3 討論

3.1 連翹葉速溶茶制備工藝優(yōu)化

連翹葉速溶茶制備工藝分為提取和干燥兩個(gè)階段。在提取階段，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取條件下提取率為15.30%。優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的12.50% （李可, 2021）。與茯磚速溶茶最大出粉率17.2%較接近 （曹霞, 2021）。在干燥階段，噴霧干燥的干燥時(shí)間短，對功能成分的損失比較小，同時(shí)，噴霧干燥成本低的優(yōu)勢（Srivastavet al., 2012；楊海燕, 2016），因此采用噴霧干燥來制備連翹葉速溶茶。

3.2 原料選擇對連翹葉速溶茶品質(zhì)的影響

采用陰干連翹葉、炒制殺青連翹葉、殺青發(fā)酵連翹葉制備得到3 種速溶茶FSL-D、FSL-G、FSL-B。穩(wěn)定性、污染物含量、溶解性、穩(wěn)定性分析表明，3 種速溶茶均符合國家對于固體飲料的規(guī)定。吳茂玉等（2019）報(bào)道的破壁靈芝孢子粉的堆積密度在0.4~0.65 g·mL-1之間，與本研究中速溶茶的堆積密度較接近。殺青發(fā)酵連翹葉制備得到的FSL-B 表現(xiàn)都更佳，其中FSL-B 的滋味、氣味優(yōu)于其他2 種連翹葉速溶茶，感官指標(biāo)得分較高，這可能與發(fā)酵過程中生成的特殊香氣和滋味有關(guān)（蔡麗，2020），具有溶解速度快、堆積密度小、吸濕率低、感官評價(jià)高、多糖含量高的特點(diǎn)。因此，選擇殺青發(fā)酵連翹葉作為制備速溶茶的原料。

3.3 分子量對FSL-BP-D 多糖的影響

對殺青發(fā)酵連翹葉速溶茶多糖FSL-BP-D 進(jìn)行超濾分級分離，制得三種分子量多糖樣品FSL-BP<1 kDa、3 kDa 10 kDa。對得到的多糖分別進(jìn)行了ABTS、DPPH 自由基清除能力測試，結(jié)果表明分子量大的多糖樣品抗氧化活性明顯高于分子量小的多糖樣品，這說明抗氧化活性集中在一定分子量范圍的多糖中。通過對不同分子量多糖的紅外圖譜對比可以發(fā)現(xiàn)分子量大于10 kDa 的多糖多了一個(gè)小的碳碳雙鍵的伸縮振動峰，同時(shí)隨著分子量的增加，O-H 伸縮振動峰、C=O 鍵的伸縮振動峰及-C-H 彎曲振動峰逐漸削弱。

4 結(jié)論

研究采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化水提工藝，并考察干燥方式對功能成分的影響，然后利用陰干連翹葉、炒制殺青的連翹葉、殺青發(fā)酵的連翹葉為原料制備速溶茶粉，最后分析連翹葉速溶茶粉理化性質(zhì)和功能成分。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，在料液比1:20.14 g·mL-1、溫度90 ℃的條件下，提取時(shí)間180 min，連翹葉速溶茶的平均得率最高。噴霧干燥更有利于連翹苷和連翹脂素等功能成分的保持。3 種連翹葉速溶茶粉沖調(diào)穩(wěn)定性、吸濕性、污染物含量、總酚含量都符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，連翹苷含量在3.34%以上，連翹酯苷A 在14.76%以上，連翹脂素在0.13%以上。其中殺青發(fā)酵的連翹葉速溶茶粉具有堆積密度低、吸濕性弱的優(yōu)點(diǎn)，并且感官評價(jià)分值高，更適宜于進(jìn)一步開發(fā)研究。對其粗多糖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，抗氧化性隨著分子量增大而提高，且與O-H 伸縮振動峰、C=O 鍵的伸縮振動峰及-C-H 彎曲振動峰活性減弱相關(guān)。本研究采用水提工藝，無輔料添加，安全、環(huán)保、健康；同時(shí)速溶茶粉飲用方便、保質(zhì)期長、健康美味，豐富了現(xiàn)有連翹產(chǎn)品種類，有望進(jìn)一步開發(fā)成抗氧化等功能性產(chǎn)品，提高連翹種植經(jīng)濟(jì)效益。