靚竹彩葉形成的細(xì)胞學(xué)以及光合色素*

徐薪璐 蔡 鷗 趙婉琪 呂 卓 姚文靜 李 龍 林樹燕

（1. 南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué)竹類研究所 南京 210037；3. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院 南京 210037）

葉是植物進(jìn)行光合作用的重要器官。彩葉植物是長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)葉片呈現(xiàn)如紫色、金色、紅色、條紋等非綠色的植物（何冰，2006），彩葉植物在葉片生長(zhǎng)過(guò)程的某個(gè)階段會(huì)出現(xiàn)變色期，這種葉色變化與葉綠素含量、葉綠體發(fā)育程度有關(guān)。葉綠素代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，中間任何一個(gè)過(guò)程受抑制均會(huì)引起葉綠素的大量累積或降解從而引起葉色變異。目前，關(guān)于彩葉植物葉色呈色機(jī)制的研究多集中于銀杏（Ginkgo biloba）（王改萍等， 2020）、 紫葉李（Prunus cerasifera）（高艷等，2014）、金葉女貞（Ligustrum vicaryi）（鄭健等，2012）、雞爪槭（Acer palmatum）（蔡雪雁等，2015）、槭樹（Acer pseudosieboldianum）（姜楠南等，2013）等較為常見的彩葉植物上，也有一些研究從分子水平研究彩葉產(chǎn)生的機(jī)制，如楊樹（Populus）中AP3的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)葉片衰老并降低葉綠素含量（Duet al.，2022）。Zhou等（2022）在綠白葉觀賞羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea）中鑒定出PSBQ、LHCB1.3、LHCB2.4和HSP70是葉綠體形成的關(guān)鍵基因（Zhouet al.，2022）。

許多觀賞彩葉竹種特點(diǎn)為全綠色葉片上出現(xiàn)黃色或白色條紋。 楊海蕓（2015）在花葉矢竹（Pseudosasa japonicaf.akebonosuji）中發(fā)現(xiàn)ELIPs基因參與調(diào)控葉綠體發(fā)育，抑制色素合成。黃滔等（2016）對(duì) 白 紋 陰 陽(yáng) 竹（Hibanobambusa tranquillans‘Shiroshima’)、 鼓 節(jié) 竹 （Bambusa tuldoides‘Swolleninternode’）、花稈早竹（Phyllostachys violascens‘Viridisulcata’）和美麗箬竹 （Indocalamus decorus）4 個(gè)觀賞竹種的光合特性進(jìn)行了比較研究，探究各竹種葉片的光合能力。陳凌艷等（2017）對(duì)銀絲竹（Bambusa multiplex‘Silverstripe’）不同葉色葉片的光合色素含量、葉綠素合成前體相對(duì)含量及葉片顯微和超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素合成受阻、葉綠體發(fā)育異常是葉色變異產(chǎn)生的原因。徐胤（2020）在白化類型的綠竹（Bambusa oldhamii）中發(fā)現(xiàn)PIFs 通過(guò)抑制PEP 的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)參與葉綠素生物合成相關(guān)基因，導(dǎo)致綠竹中的葉綠體發(fā)育異常，進(jìn)而葉綠素合成受阻。

靚竹（Sasaella glabra‘Albostriata’）為禾本科（Poaceae）竹亞科（(Bambusoideae)）東笆竹屬竹種，高度20~40 cm，直徑0.1~0.2 cm，葉片具3~5 條黃色條紋，為優(yōu)良地被類觀賞植物。1984 年周芳純從日本引至南京林業(yè)大學(xué)，目前已廣泛分布在我國(guó)華東、華北地區(qū)。該種可作為竹坪、林下綠化或作為盆栽觀賞竹，還可用于礦區(qū)土壤修復(fù)，山坡綠化，避免水土流失。靚竹葉色在葉片發(fā)育過(guò)程中形成，且能夠穩(wěn)定遺傳。目前，對(duì)于彩葉竹種葉色形成原因的研究都集中在成熟功能葉，而對(duì)于葉片發(fā)育過(guò)程中葉色形成的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究以不同發(fā)育階段的靚竹葉片為材料，通過(guò)比較各時(shí)期葉片顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、光合色素以及葉綠素合成前體物質(zhì)，同時(shí)對(duì)成熟功能葉的黃區(qū)和綠區(qū)的表皮結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、光合色素進(jìn)行比較，分析竹葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)及光合色素合成在不同時(shí)期及不同葉色分區(qū)的差異，為探討靚竹彩葉形成機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需靚竹葉片于2022 年4—5 月采自南京林業(yè)大學(xué)白馬苗圃繁育基地(119°10'35″ E，31°36'19″ N)。葉片按照生長(zhǎng)發(fā)育及葉色變化特征分為S1、S2、S3和S4 4 個(gè)時(shí)期（表1，圖1），成熟功能葉根據(jù)葉色分為黃區(qū)(yellow stripe，YS)和綠區(qū)(green stripe，GS)。靚竹集中于4—6 月抽枝展葉。

圖1 靚竹不同發(fā)育時(shí)期葉片發(fā)育過(guò)程中形態(tài)Fig. 1 Appearance of morphological characteristics at different developmental stages of S. glabra ‘Albostriata’

表1 靚竹葉片不同發(fā)育時(shí)期特征描述Tab. 1 Description of leaf characteristics at different developmental stages of S. glabra ‘Albostriata’

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靚葉片發(fā)育過(guò)程中內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察 1）光學(xué)顯微鏡觀察顯微結(jié)構(gòu)：分別取靚竹葉片4 個(gè)發(fā)育時(shí)期各15 片， 選取S1、 S2 時(shí)期的葉片放入50% FAA（formaldehyde-acetic acid-alcohol）固定液中，S3、S4 時(shí)期的葉片放入70% FAA 固定液中，固定2 天以上，待用，每個(gè)時(shí)期樣品至少3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。固定后取S1、S2 時(shí)期的葉片中段、S3、S4 時(shí)期的葉片及S4 時(shí)期葉片YS、GS 區(qū)切取中部以主脈為中軸10 mm×5 mm 大小區(qū)域，置于25% HF（氫氟酸）中軟化48～72 h。采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)（李正理，1987）切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，Leica RM 2255 自動(dòng)切片機(jī)切片(厚度為 8 μm) ，番紅—固綠雙重染色法染色，中性樹膠封片，Leica DM 2500 光學(xué)顯微鏡選取成熟葉片沿主脈左右對(duì)稱視野拍照觀察。Leica LAS X 軟件對(duì)葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、梅花狀細(xì)胞長(zhǎng)度、指狀臂細(xì)胞長(zhǎng)度、梭形細(xì)胞空隙長(zhǎng)度、泡狀細(xì)胞長(zhǎng)度、主脈面積、側(cè)脈（1 級(jí)脈、2 級(jí)脈）面積進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)時(shí)期的葉片選取10 個(gè)切片，每個(gè)切片選取10 個(gè)視野觀測(cè)，每個(gè)時(shí)期測(cè)量至少50 個(gè)數(shù)據(jù)。此外，將靚竹S4 時(shí)期葉片的黃綠條紋區(qū)域分開分別放入PBS 溶液中固定，制作方法參考張書敏等（2015），將制作好的徒手切片置于Leica DM 2500 光學(xué)顯微鏡下觀察，利用Leica LAS X 軟件拍照，黃綠兩區(qū)各選取10 個(gè)視野觀測(cè)。

2）透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)：分別取靚竹的4 個(gè)時(shí)期葉片各3 片，其中已經(jīng)出現(xiàn)條紋葉色的S2、S3、S4時(shí)期要將黃區(qū)和綠區(qū)分開取樣，避開葉脈切取葉片的三角形葉塊（2 mm×2 mm，底×高），置于2%戊二醛混合固定液(pH 7.0) 中，抽氣使葉片下沉，4 ℃下固定24 h，每個(gè)樣品至少設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。固定后參考 Hall等（1991）的方法，磷酸緩沖液沖洗 3 次后，乙醇逐級(jí)脫水，丙酮置換，LR. white 樹脂包埋，Leica EM UC6 超薄切片機(jī)切片（切片厚度約為 90 nm），醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在電子透射電鏡 JEM-1400 下拍照觀察。

3）掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)：取新鮮S4 時(shí)期葉片洗凈，將葉片區(qū)別YS 和GS 區(qū)修剪成0.5 cm × 0.5 cm的小塊于FAA 固定液中固定24 h，脫水后真空鍍膜，在PHILIPS XL30 ESEM 掃描電鏡下觀察表皮系統(tǒng)。

1.2.2 光合色素含量的測(cè)定 對(duì)各發(fā)育時(shí)期葉片及S4 時(shí)期葉片的YS、GS 區(qū)進(jìn)行光合色素含量測(cè)定。提取方法參考 Hodgins 等（1986）的方法，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。按照下列公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量。

式中：Ca、Cb、C(x+c)分別代表葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量(mg·g-1)，A為吸光值，V為提取液總體積(mL)，若稀釋則乘以相應(yīng)的倍數(shù)，W為葉片鮮質(zhì)量(g)。

1.2.3 葉綠素合成前體物質(zhì)的測(cè)定 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)含量的測(cè)定：根據(jù)Dei（1985）的方法稍加改動(dòng)，取混合液2 mL 加入2 mL顯色液（Ehrlich-Hg 試劑），黑暗處理15 min 后測(cè)定553 nm 處的OD 值。并按下述公式計(jì)算ALA 摩爾濃度：A=ε·C·L，其中A為吸光值，ε 為摩爾消光系數(shù)（ALA 的含量以553 nm 處的摩爾消光系數(shù)7.2×104L·mol-1cm-1計(jì)算），C為摩爾濃度，L為測(cè)試液的液層厚度。

卟啉原（porphobilinogen, PBG）含量的測(cè)定參照Bogorad（1962）的方法稍加改動(dòng)，取混合液2 mL，加入2 mL 顯色液（Ehrlich-Hg 試劑），黑暗中放置15 min 后，測(cè)定553 nm 處的OD 值。

按下述公式計(jì)算PBG 摩爾濃度：A=ε·C·L，其中A為吸光值，ε 為摩爾消光系數(shù)（PBG 的含量以553 nm處的摩爾消光系數(shù)6.1×104L·mol-1cm-1計(jì)算），C為摩爾濃度，L為測(cè)試液的液層厚度。

尿卟啉原III（UrogenIII）和糞卟啉原III（CoprogenIII）含量的測(cè)定參照Bogorad（1962）的方法稍加改動(dòng)，按下述公式計(jì)算摩爾濃度：A=ε·C·L，其中A為吸光值，ε為摩爾消光系數(shù)（UrogenIII 含量以405.05 nm 處的摩爾消光系數(shù)5.48×105L·mol-1cm-1計(jì)算；CoprogenIII 含量以399.5 nm 處的摩爾消光系數(shù)4.89×105L·mol-1cm-1計(jì)算），C為摩爾濃度，L為測(cè)試液的液層厚度。

原卟啉IX（ProtoIX）、鎂原卟啉IX（Mg-ProtoIX）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的測(cè)定參照Hodgins 等（1986）的方法，根據(jù)下列公示計(jì)算原卟啉IX（ProtoIX）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的含量：

式中，E、F分別為摩爾消光系數(shù)、OD 值，下標(biāo)為nm 值。

鎂原卟啉IX（Mg-ProtoIX）的相對(duì)含量以E400F595值直接表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析，利用Graphpad Prism 9 作圖，Microsoft PowerPoint 作表，圖表中所有數(shù)據(jù)值均為重復(fù)測(cè)定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 靚竹不同發(fā)育時(shí)期葉片內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

靚竹葉片各發(fā)育時(shí)期內(nèi)部細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化如圖2a–e 所示。不同發(fā)育時(shí)期的葉片內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)差異較大。S1 時(shí)期葉片卷曲未露出葉鞘，因此整個(gè)葉片嫩黃白色，此時(shí)期的葉片內(nèi)部細(xì)胞界限不清晰，細(xì)胞核大，組織分化程度低，維管系統(tǒng)初步分化但無(wú)明顯的主側(cè)脈之分，上下表皮無(wú)明顯差異（圖2a）。S2 時(shí)期葉片卷曲、剛露出葉鞘，初步出現(xiàn)條紋葉色，此時(shí)期的葉片內(nèi)部細(xì)胞相對(duì)清晰，細(xì)胞壁加厚，細(xì)胞核近似圓形，組織分化程度較明顯，維管系統(tǒng)分化出明顯的1 級(jí)側(cè)脈和2 級(jí)側(cè)脈，主脈和1 級(jí)側(cè)脈的差異不顯著，下表皮出現(xiàn)乳突結(jié)構(gòu)，上下表皮差異顯著（圖2b）。S3 時(shí)期葉片由卷曲逐漸展平，葉片出現(xiàn)穩(wěn)定的條紋葉色，此時(shí)期葉片內(nèi)部細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞壁加厚，組織分化程度高，可觀察到明顯的梅花狀細(xì)胞、指狀臂細(xì)胞、泡狀細(xì)胞和梭形細(xì)胞，維管束完整，有清晰的主側(cè)脈之分，上下表皮差異顯著，下表皮乳突結(jié)構(gòu)清晰（圖2c）。S4 時(shí)期為功能葉，葉片展平，細(xì)胞結(jié)構(gòu)與S3 時(shí)期類似（圖2d–e）。功能葉綠區(qū)（圖2d）和黃區(qū)（圖2e）葉片顯微結(jié)構(gòu)差異較大，區(qū)別在于綠區(qū)上表皮附近的指狀臂細(xì)胞有2~3 層且結(jié)構(gòu)清晰、排列緊密；而黃區(qū)葉肉細(xì)胞中僅有1 層清晰可見的指狀壁細(xì)胞緊貼上表皮，其余葉肉細(xì)胞無(wú)明顯指狀臂細(xì)胞和梅花狀細(xì)胞的區(qū)別。葉片黃區(qū)和綠區(qū)著色程度不同，綠區(qū)細(xì)胞較易染色。隨著發(fā)育過(guò)程的推進(jìn)，葉片厚度、上下表皮、葉肉厚度均不斷增厚（表2），葉脈面積不斷增加，前期主脈和1 級(jí)側(cè)脈差異較小，S3 到S4 時(shí)期主脈發(fā)育速度最快（表3）。

圖2 靚竹葉片不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察Fig. 2 Microstructure comparison of S. glabra ‘Albostriata’ in different stages

表2 靚竹葉片不同生長(zhǎng)階段顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)（一）①Tab. 2 Leaves microstructure parameters in S. glabra ‘Albostriata’

表3 靚竹葉片不同生長(zhǎng)階段顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)（二）①Tab. 3 Leaves microstructure parameters in S. glabra ‘Albostriata’

2.2 靚竹不同發(fā)育時(shí)期葉片超微結(jié)構(gòu)觀察

靚竹S1 時(shí)期葉肉細(xì)胞較小，形狀相對(duì)規(guī)則，細(xì)胞排列緊密，未出現(xiàn)梅花細(xì)胞和指狀臂細(xì)胞的分化（圖3a1）；細(xì)胞壁??；細(xì)胞核大質(zhì)濃，成分生細(xì)胞狀態(tài)（圖3a2）；線粒體數(shù)目較多，多靠近細(xì)胞壁分布；細(xì)胞質(zhì)中散布核糖體和高爾基體等細(xì)胞器（圖3a3）；未出現(xiàn)明顯的葉綠體結(jié)構(gòu)，有較大的淀粉粒出現(xiàn)在原質(zhì)體中(圖3a4)。

圖3 靚竹不同發(fā)育時(shí)期葉片超微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 3 Ultrastructure comparison of S. glabra ‘Albostriata’ in different stages

靚竹葉片S2 期初步出現(xiàn)條紋，綠區(qū)各類型細(xì)胞壁較S1 時(shí)期加厚；葉肉細(xì)胞開始出現(xiàn)梅花狀細(xì)胞和指狀臂細(xì)胞的初步分化（圖3b1）；多數(shù)細(xì)胞內(nèi)有較大面積的空洞，部分發(fā)育中的細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞核大質(zhì)濃；細(xì)胞器較少；原質(zhì)體開始向葉綠體轉(zhuǎn)化，靠近細(xì)胞壁分布，但葉綠體數(shù)量較少且內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，少數(shù)類囊體片層垛堞成基粒，基粒數(shù)量少且分散（圖3b2）。同時(shí)期黃區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)如圖3b3，此時(shí)期細(xì)胞壁較S1 時(shí)期加厚；葉肉細(xì)胞開始出現(xiàn)梅花狀細(xì)胞和指狀臂細(xì)胞的初步分化；相較于綠區(qū)，更多細(xì)胞內(nèi)有較大面積的空洞，部分發(fā)育中的細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞核大質(zhì)濃；線粒體飽滿；原質(zhì)體靠近細(xì)胞壁分布，無(wú)明顯葉綠體結(jié)構(gòu)（圖3b4）。

靚竹葉片S3 期綠區(qū)葉肉細(xì)胞多分化為梅花狀，細(xì)胞壁加厚，細(xì)胞核不明顯，細(xì)胞空腔面積小，無(wú)明顯細(xì)胞器（圖3c1）；質(zhì)體靠近細(xì)胞壁附近分布，葉綠體數(shù)量多且內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)部有小型淀粉粒和嗜餓顆粒，嗜餓顆粒分散分布，類囊體垛疊層數(shù)多，基粒間距大、片層多（圖3c2）。同時(shí)期黃區(qū)細(xì)胞如圖3c3 所示，同樣觀察到細(xì)胞壁加厚、細(xì)胞核不明顯的現(xiàn)象，相較于S2 時(shí)期黃區(qū)細(xì)胞空腔面積縮小，細(xì)胞器減少，葉綠體數(shù)量少且發(fā)育不完全，內(nèi)部有嗜餓顆粒集中分布（圖3c4）。

如圖3d1 所示，S4 綠區(qū)的葉肉細(xì)胞形狀清晰，完全分化為梅花狀結(jié)構(gòu)和指狀臂結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯空腔，細(xì)胞壁加厚，細(xì)胞核不明顯，無(wú)明顯細(xì)胞器；質(zhì)體靠近細(xì)胞壁附近分布，葉綠體數(shù)量多且面積大，基粒數(shù)量多且排列密集，內(nèi)部有嗜餓顆粒分散分布(圖3d2)。黃區(qū)細(xì)胞中可觀察到大面積空腔，與綠區(qū)相似，同樣出現(xiàn)細(xì)胞壁加厚，細(xì)胞核不明顯，無(wú)明顯細(xì)胞器的現(xiàn)象(圖3d3)；質(zhì)體靠近細(xì)胞壁分布，無(wú)清晰葉綠體結(jié)構(gòu)，淀粉粒大且數(shù)量多，嗜餓顆粒集中分布（圖3d4）。

2.3 靚竹葉片YS 和GS 的徒手切片及掃描電鏡觀察

通過(guò)徒手切片可以看出黃區(qū)YS 及綠區(qū)GS 的葉綠體數(shù)量以及分布有明顯差別。黃區(qū)的葉綠體數(shù)量明顯少于綠區(qū)。綠區(qū)的葉綠體在上下表皮間葉肉細(xì)胞中均有分布（圖4a），黃綠交界區(qū)域的葉綠體主要集中分布在下表皮附近的梅花狀細(xì)胞中，靠近上表皮的指狀壁細(xì)胞中葉綠體分布很少（圖4b），而黃區(qū)（圖4c）葉肉細(xì)胞呈黃色，無(wú)明顯葉綠體分布。

圖4 靚竹分區(qū)徒手切片觀察Fig. 4 Microscopic structure of hand sectioning of different stripes of S. glabra ‘Albostriata’

顯微結(jié)構(gòu)觀察（圖5），與石蠟切片類似，靚竹葉片的黃區(qū)(圖5i、l)及綠區(qū)(圖5c、f)的葉表皮及橫切面結(jié)構(gòu)差異明顯，綠區(qū)葉片厚于黃區(qū)葉片，且綠區(qū)葉片內(nèi)部細(xì)胞排列緊密。二者上表皮(圖5a、g)均較為平整，能夠清晰地分辨出葉脈部分和脈間部分，少有附屬物；下表皮(圖5b、h)均著生密集的乳突，綠區(qū)的乳突密度較黃區(qū)的乳突密度大；乳突有大乳突和小乳突兩種類型，大乳突為三角狀，小乳突為顆粒狀，大乳突體積約為小乳突的10 倍，少數(shù)區(qū)域有須狀刺撓著生(圖5d、j)；二者在下表皮的顆粒狀乳突中有氣孔分布(圖5e、k)，且氣孔形狀類似，均為狹長(zhǎng)橢圓形，氣孔兩端各有2 個(gè)小乳突，區(qū)別在于綠區(qū)氣孔數(shù)目較黃區(qū)多。

圖5 靚竹葉片分區(qū)的表皮及葉片橫切面的超顯微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 5 Ultrastructure of epidermis and transsections of S. glabra ‘Albostriata’ in different stripes

2.4 靚竹葉片光合色素的測(cè)定

光合色素是導(dǎo)致葉色變化的重要因素，提取靚竹不同時(shí)期葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素，由表4 可知，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素的含量均隨著發(fā)育而逐漸增加。S1、S2 期葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素含量較低，且差異不顯著（P>0.05），發(fā)育到功能葉差異較為顯著（P<0.05）。

表4 靚竹不同時(shí)期葉片光合色素含量變化①Tab. 4 Changes of leaves photosynthetic pigment content during different stages of S. glabra ‘Albostriata’

將靚竹葉片分為黃區(qū)和綠區(qū)分別測(cè)定各區(qū)光合色素，并與靚竹完整葉片進(jìn)行比較分析，由表5 可知，葉片黃區(qū)及綠區(qū)各光合色素均存在顯著差異（P<0.05）。綠區(qū)的各光合色素含量均高于黃區(qū)，綠區(qū)的葉綠素含量是黃區(qū)葉綠素的10 倍左右，類胡蘿卜素是葉綠素的9 倍左右，綠區(qū)中葉綠素和類胡蘿卜素的比例為3.542，高于黃區(qū)的2.952，說(shuō)明綠區(qū)中影響葉色的主要原因是葉綠素的積累。

表5 靚竹S4 時(shí)期葉片光合色素含量分區(qū)對(duì)比①Tab. 5 Photosynthetic pigment content comparision in different stripes at S4 stage of S. glabra ‘Albostriata’

2.5 靚竹葉片葉綠素合成前體物質(zhì)的測(cè)定

對(duì)靚竹葉片不同時(shí)期的前體物質(zhì)相對(duì)含量進(jìn)行比較，以功能葉S4 時(shí)期為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如圖6 所示，除尿卟啉原III（UrogenIII）之外的物質(zhì)都是隨著發(fā)育過(guò)程推進(jìn)逐漸積累的。UrogenIII 在靚竹葉片發(fā)育前期（S1、S2）顯著高于葉色穩(wěn)定的后期（S3、S4），并且相較于糞卟啉原III（CoprogenIII）的相對(duì)含量，原卟啉IX（Proto IX）各時(shí)期相對(duì)含量驟減。以上結(jié)果說(shuō)明，隨著靚竹葉片條紋的出現(xiàn)，UrogenIII 向CoprogenIII 的轉(zhuǎn)化增加，CoprogenIII 向Proto IX 的轉(zhuǎn)化過(guò)程受阻從而造成CoprogenIII 的大量積累。由此推測(cè)，UrogenIII和CoprogenIII 是靚竹葉片發(fā)育過(guò)程中葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵物質(zhì)。

圖6 靚竹葉片不同前體物質(zhì)在不同發(fā)育階段的相對(duì)含量Fig. 6 Relative concentration of different precursor material of chlorophyll during different stages of S. glabra ‘Albostriata’

3 討論

3.1 解剖結(jié)構(gòu)與彩葉形成的關(guān)系

Hara（1957）認(rèn)為彩葉葉片表面具有不同顏色，形成規(guī)則圖案或不規(guī)則斑點(diǎn)或斑塊。Sheue 等（2012）將彩葉分為5 種類型：葉綠素型、色素型、表皮型、空腔型和附屬物類型，而其中表皮型、空腔型和附屬物類型的彩葉屬于結(jié)構(gòu)型彩葉。葉片結(jié)構(gòu)很大程度上會(huì)引起彩葉的形成，影響因素主要是葉片的表皮形態(tài)和葉肉細(xì)胞排列方式具有差異。葉肉細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間隙大導(dǎo)致光反射，從而影響葉色。銀色葉片葉色變異歸因于表皮細(xì)胞和柵欄細(xì)胞之間存在廣泛的細(xì)胞間隙（Burgeret al.，1998；Hochet al.，1980）。Tsukaya等（2004）發(fā)現(xiàn)廣西落檐（Schismatoglottis calyptrata）葉片的斑塊葉色是由于葉肉細(xì)胞松散、表皮和柵欄組織之間有不規(guī)則的細(xì)胞間隙造成；王振興等（2016）的研究認(rèn)為狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikt）這種彩葉變異與彩葉葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為疏松從而導(dǎo)致的光反射有關(guān)；尖萼報(bào)春苣苔（Primulina pungentisepala）白葉類型葉肉細(xì)胞的柵欄組織細(xì)胞呈白色球形且排列松散（Chenet al.，2022）。在本研究中，通過(guò)對(duì)靚竹不同發(fā)育時(shí)期及成熟功能葉分區(qū)的葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察中發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)育過(guò)程不斷推進(jìn)，各細(xì)胞及葉脈面積不斷增大，細(xì)胞界限逐漸清晰；葉片綠區(qū)的表皮細(xì)胞與葉肉細(xì)胞、葉肉細(xì)胞間均排列緊密，黃區(qū)葉肉細(xì)胞內(nèi)部不易被染色，且分化程度低，黃區(qū)指狀臂細(xì)胞層數(shù)少于綠區(qū)，因此，靚竹彩葉的形成與指狀臂細(xì)胞的分化和排列方式有關(guān)。

由于表皮細(xì)胞的形狀可將光聚焦到色素上（Zhanget al.，2009）以及葉片表皮上的腺毛和蠟質(zhì)等附屬結(jié)構(gòu)，從而來(lái)影響葉色(Reicoskyet al.，1978；Karabourniotiset al.，1999)。禾本科植物的葉表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為在研究種的分類和系統(tǒng)關(guān)系方面具有重要的價(jià)值(陳志強(qiáng)等，1987；Bothmeret al.，1993)，稻型葉片表皮系統(tǒng)具有上表皮有長(zhǎng)短細(xì)胞之分、葉脈帶常有微毛或兼有刺毛、下表皮乳突密集等特征（張志耘等，1998）。靚竹葉片屬于稻型葉片表皮系統(tǒng)，本研究在對(duì)靚竹不同葉色分區(qū)進(jìn)行掃描電鏡觀察，可以觀察到靚竹葉片上表皮均較為平整、葉脈清晰、下表皮均著生密集的乳突，乳突有三角狀和顆粒狀兩種，氣孔兩端各附著2 個(gè)小乳突。但是不同葉色之間的表皮結(jié)構(gòu)差異不顯著，說(shuō)明靚竹葉色變異受到表皮的影響較小。

植物組織的質(zhì)地和顏色可能受到組織中色素濃度和分布的影響（Neillet al.，1999；Gouldet al.，2000）。通過(guò)對(duì)不同葉色區(qū)域的葉片進(jìn)行徒手切片，觀察到綠區(qū)葉片葉綠體在靠近上下表皮的葉肉細(xì)胞中均有分布，而黃區(qū)葉片葉綠體靠近下表皮分布。綜上，可以推斷在靚竹葉片中，葉綠體在葉肉細(xì)胞中的分布情況會(huì)對(duì)葉色產(chǎn)生影響，而表皮、葉片內(nèi)部細(xì)胞排列方式并非決定葉色變異的因素。

3.2 彩葉形成過(guò)程中葉綠體發(fā)育與葉綠素合成的變化

葉色變異與光合色素有著密切聯(lián)系，光合色素的含量及組成均會(huì)對(duì)葉色的形成產(chǎn)生影響（陳星旭，2009; 邱義蘭等，2010）。光合色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，葉綠素又包括葉綠素a 和葉綠素b，其中葉綠素a 呈黃綠色，葉綠素b 呈藍(lán)綠色。葉綠素位于葉綠體上，葉綠體發(fā)育異?；蚪Y(jié)果受損均會(huì)引起葉色變異（Yuet al.，2016）。葉綠體發(fā)育進(jìn)程與葉片發(fā)育大致同步，葉片發(fā)育的過(guò)程也是葉色逐漸加深的過(guò)程。王嘯晨（2012）在對(duì)4 種彩葉竹種葉片研究中發(fā)現(xiàn)，白紋陰陽(yáng)竹和白紋椎谷笹的葉肉細(xì)胞則呈現(xiàn)基粒片層降解、產(chǎn)生大量嗜鋨顆粒等不同程度的葉綠體變異。白紋陰陽(yáng)竹、白紋椎谷笹、菲黃竹和黃條金剛竹葉片呈現(xiàn)不同顏色可能由光合色素合成途徑受抑制引起；成敏敏（2018）研究花葉矢竹不同復(fù)綠階段葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)和光合色素，確定葉綠素累積是使花葉矢竹白葉復(fù)綠的原因，并且可觀察到復(fù)綠過(guò)程中葉綠體內(nèi)膜系統(tǒng)由無(wú)序泡狀到有序的片層和基粒類囊體排列；蘇佳露等（2020）研究了6 個(gè)彩葉竹種在不同分區(qū)的葉色與光合色素，以及與細(xì)胞顯微超微結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，證明彩葉葉片不同葉色的呈現(xiàn)與部分細(xì)胞內(nèi)葉綠體發(fā)育異常和光合色素含量較低有關(guān)。本研究中，靚竹葉片黃區(qū)細(xì)胞及葉綠體發(fā)育異常，表現(xiàn)為細(xì)胞空腔大、葉綠體數(shù)量少且內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰；綠區(qū)葉肉細(xì)胞中的葉綠體隨發(fā)育進(jìn)程不斷趨于成熟，這與蘇佳露等（2020）的研究結(jié)果類似。在光合色素上，各時(shí)期光合色素的含量隨著發(fā)育而逐漸積累，功能葉的黃區(qū)及綠區(qū)在光合色素的含量上也有顯著差異，這也與蘇佳露等（2020）的研究結(jié)果類似。說(shuō)明葉色是光合色素含量的直觀呈現(xiàn)，且葉片在發(fā)育過(guò)程中，光合色素處于不斷積累的狀態(tài)，葉綠素的積累是影響葉色的最主要原因。

在高等植物葉片中，葉綠素是由L-谷氨酸-tRNA經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)合成的。這一過(guò)程中ALA 的合成和鎂原卟啉IX 的合成對(duì)于葉綠素合成速度有限制作用，屬于葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵步驟。葉綠素合成途徑中需要20 多個(gè)基因編碼的15 種酶的參與(Beale， 2005)。在合成過(guò)程中，其中任何一個(gè)基因發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致合成途徑中的中間產(chǎn)物大量積累，阻礙葉綠素的合成。目前有一些對(duì)于發(fā)生葉色變異的葉片其葉綠素合成途徑的研究，陳凌艷等（2017）的研究中證明銀絲竹葉片呈現(xiàn)出白色性狀的原因在于其葉片葉綠素生物合成過(guò)程受阻，受阻點(diǎn)位于CoprogenIII至ProtoIX 的轉(zhuǎn)化過(guò)程中；楊熒等（2019）推測(cè)安吉白茶（Camellia sinensis‘Baiyel 1’）由于葉綠素合成階段中Mg-proto IX 合成葉綠素a 時(shí)受阻，使Mg-proto IX在白化葉片中積累，使白化葉中Mg-proto IX 含量高于返綠葉；徐胤（2020）在對(duì)綠竹白化葉片的研究中證明，綠竹白化變異類型的葉綠素合成途徑在合成ALA 之前就可能受到了阻礙；黃婧等（2021）證明復(fù)綠期黃金枸骨（Ilex×attenuata‘Sunny Foster’）葉片的葉綠素積累可能起始于UrogenIII 的增加。在對(duì)葉片光合色素的研究中發(fā)現(xiàn)了靚竹葉片中光合色素的含量是隨著發(fā)育進(jìn)程不斷積累的。為了探究這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，尋找葉綠素合成途徑中的差異，故對(duì)于葉綠素合成途徑中的前體物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并發(fā)現(xiàn)靚竹葉片多個(gè)發(fā)育時(shí)期在CoprogenIII 向Proto IX 轉(zhuǎn)化過(guò)程中受到阻礙，出現(xiàn)了CoprogenIII 的大量積累，另外在彩葉功能葉中除UrogenIII 之外的物質(zhì)都是隨著發(fā)育過(guò)程推進(jìn)逐漸積累，可推測(cè)UrogenIII 和CoprogenIII 對(duì)于靚竹葉片發(fā)育進(jìn)程中的葉色變異有重要影響，CoprogenIII 的合成受阻或CoprogenIII 至ProtoIX 的轉(zhuǎn)化受阻均會(huì)導(dǎo)致葉色變異，這與陳凌艷等（2017）的研究結(jié)果一致。

3.3 類胡蘿卜素含量對(duì)于葉色的影響

除葉綠素之外，類胡蘿卜素及葉黃素的大量積累也可以引起葉色變黃。葉片通過(guò)合成類胡蘿卜素和葉黃素來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用。之前研究中一些金葉植物葉片黃化與類胡蘿卜素的含量增加有關(guān)。Li 等（2018）在銀杏中發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因ZISO、ZDS和LCYE促進(jìn)類胡蘿卜素的積累，類胡蘿卜素與葉綠素比率的變化是導(dǎo)致突變株葉片呈金色的主要因素（Liet al.，2018）。但在Tian 等（2021）的研究中發(fā)現(xiàn)金葉楊突變體JHY 的葉綠素和類胡蘿卜素含量低于原種L22025，但類胡蘿卜素/葉綠素比值高于L22025。這兩種色素之間的差異是葉片顏色變化的原因之一。本研究經(jīng)對(duì)比黃區(qū)及綠區(qū)的光合色素含量，未觀察到黃區(qū)類胡蘿卜素含量增高，黃、綠兩區(qū)的葉綠素：類胡蘿卜素比例基本在3∶1 左右浮動(dòng)，綠區(qū)比值高于黃區(qū)，這與Tian 等（2021）的研究結(jié)果類似。說(shuō)明在靚竹葉色變異中，葉綠素的含量更具有決定性，而非類胡蘿卜素。

4 結(jié)論

靚竹葉片發(fā)育過(guò)程中，葉片厚度逐漸增大，葉片表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、葉脈均不斷增大。光合色素含量逐漸積累，UrogenIII 和CoprogenIII 是靚竹葉片發(fā)育過(guò)程中葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵物質(zhì)。黃區(qū)葉片葉肉細(xì)胞空腔大且葉綠體發(fā)育異常，指狀臂細(xì)胞層數(shù)少，綠區(qū)葉片隨發(fā)育程度葉綠體數(shù)量逐漸增加，葉綠素含量積累。靚竹條紋葉色的出現(xiàn)與指狀臂細(xì)胞分化程度低、葉綠體發(fā)育異常以及葉綠素合成受阻有關(guān)。