原核生物HipBST毒素-抗毒素系統(tǒng)

黃志杰, 歐陽松應(yīng), 甄向凱

(1)福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心, 福州 350117;2)福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350117)

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin system,TA)系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的染色體及質(zhì)粒上[1],通常由抑制細(xì)菌生長的毒素和能夠中和其毒性的抗毒素所組成,TA廣泛參與到細(xì)胞的生命活動中,在維持基因組穩(wěn)定性[2, 3]和抵御噬菌體感染[4-7]等方面發(fā)揮重要功能。TA目前被分為I-VIII型[2, 8],通常包含2個組分(毒素和抗毒素)。最近一些非經(jīng)典TA被報道,包括毒素和抗毒素融合在一起的單順反子TA系統(tǒng)[9, 10]和3組分TA系統(tǒng)[11-13],豐富了我們對于TA的認(rèn)識。例如在單順反子CapRelSJ46TA中,其N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域分別充當(dāng)毒素和抗毒素功能[9, 10]。3組分TA則大多數(shù)為II型TA的衍生物[14-17],例如,在人類病原菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中發(fā)現(xiàn)的TAC系統(tǒng),它由3個基因Rv1955-Rv1956-Rv1957組成,分別編碼1個抗毒素HigA和1個毒素HigB,以及發(fā)揮分子伴侶功能的MtbSecB,其中HigBA是一個典型的II型TA[18]。

HipBST是近期由多個研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于原核生物的新穎的3組分非經(jīng)典TA[12, 14],與大腸桿菌HipBA具有較高的同源性[13]。其中毒素HipT與HipA的C端相似,同樣有1個保守的激酶結(jié)構(gòu)域,能夠?qū)Υ竽c桿菌產(chǎn)生毒性,抑制大腸桿菌的生長[11-13]?？苟舅豀ipS位于毒素HipT上游,與大腸桿菌毒素HipA的N端具有20%相似性,能夠直接中和HipT的毒性[11-13]。在hipS上游還編碼1個與大腸桿菌抗毒素HipB相似的HTH結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合因子HipB,但HipB并不能直接中和毒素HipT的毒性,卻可以調(diào)節(jié)hipBST操縱子的轉(zhuǎn)錄水平[11-13]。本文對最近發(fā)現(xiàn)的幾種非經(jīng)典TA進(jìn)行總結(jié),包括單順反子的TA系統(tǒng)和3組分TA系統(tǒng),特別是對這一廣泛存在于原核生物的HipBST的中和機(jī)制進(jìn)行概述。

1 毒素-抗毒素的分類及功能

1.1 TA的分類

據(jù)抗毒素的性質(zhì)(蛋白質(zhì)或RNA)及毒素被中和的方式,TA可以分為I～Ⅷ型(Fig.1)[8]。其中,I型、III型和VIII型TA中的抗毒素是RNA,而其余TA系統(tǒng)中抗毒素都是蛋白質(zhì)。I型TA中的毒素一般是小的(一般小于60個氨基酸)疏水性的膜蛋白質(zhì),會造成細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞分裂缺陷,抗毒素是短的反義RNA,通過與編碼毒素的mRNA結(jié)合,抑制毒素的轉(zhuǎn)錄來中和毒性[15-17];III型TA中,毒素一般為核酸內(nèi)切酶,抗毒素通過與毒素形成蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物從而抑制毒素的活性[18-21]。II型、Ⅳ型、V型、VI型和VII型TA中抗毒素和毒素都是蛋白質(zhì)。II型TA中的毒素一般為酶,主要抑制DNA復(fù)制和翻譯過程,例如含RES結(jié)構(gòu)域的毒素ParT通過水解細(xì)胞內(nèi)的NAD使細(xì)菌死亡,抗毒素ParS可以直接抑制毒素的酶活[3, 22-25]。在Ⅳ型TA中,抗毒素能夠通過干擾毒素與底物的結(jié)合,而并不是通過直接與毒素的結(jié)合調(diào)節(jié)毒素的毒性,IV型TA YeeU-CbtA,毒素CbtA靶向結(jié)合MreB和FtsZ來影響細(xì)胞形態(tài)和分裂,抗毒素YeeU與FtsZ結(jié)合,通過維持它的穩(wěn)定性抑制毒素CbtA的活性[26]。V型TA中的抗毒素則是一種RNA酶,通過切割對應(yīng)毒素的mRNA來阻止毒素的積累,GhoT-GhoS首個被發(fā)現(xiàn)的V型TA,其中毒素GhoT通過破壞細(xì)胞膜來發(fā)揮毒性,抗毒素GhoS能夠靶向GhoT的mRNA并切割[27-29]。VI型TA中毒素SocB通過抑制DNA復(fù)制延伸來抑制細(xì)胞活性,抗毒素SocA促使毒素SocB被蛋白酶ClpXP降解[30]。VII型TA中毒素的活性主要是影響細(xì)胞膜的形成和核酸酶活性,而抗毒素同樣具有酶的功能,通過對毒素進(jìn)行翻譯后修飾,例如磷酸化、腺苷酸化修飾等從而中和毒性[31-37]。而VIII型TA中毒素與抗毒素同為RNA,毒素活性主要是隔絕tRNA或抑制mRNA靶標(biāo),抗毒素則通過抑制毒素的轉(zhuǎn)錄來中和毒性[38]。

Fig.1 Schematic diagram of toxin and antitoxin effect of type I-VIII TA The antitoxin of type I and III TA system is RNA. The antitoxin of type I TA neutralizes the toxicity by binding to the mRNA encoding the membrane protein toxin and inhibiting its transcription, while the antitoxin of type III TA neutralizes the toxicity by binding to the toxin forming protein-RNA complex. The antitoxin and toxin of type II, IV, V, VI and VII TA systems are all proteins. The antitoxin of type II TA system binds directly to the toxin, inhibits the enzyme activity of the toxin or regulates the activity of the toxin through allosteric effect. The antitoxin of type IV TA system can interfere with the binding of toxin to substrate, and the antitoxin of type V TA system prevents the accumulation of toxin by cutting the mRNA of the toxin. The antitoxin in type VI TA system promotes the toxin to be degraded by protease, and the antitoxin in type VII TA system neutralizes the toxicity by post-translational modification. In type VIII TA system, the toxin and antitoxin are both RNA and the antitoxin neutralizes toxicity by inhibiting the transcription of toxin (modified from references[8])

1.2 TA的生物學(xué)功能

雖然TA在微生物中普遍存在,但是絕大多數(shù)TA的生物學(xué)功能仍然未知。研究表明,TA在促進(jìn)微生物抗逆性[22, 39, 40]、維持基因組穩(wěn)定性[2, 3]、促進(jìn)持留菌形成[22, 39, 40]、抵抗噬菌體感染[4-7]和促進(jìn)細(xì)菌程序性死亡[41]等方面發(fā)揮功能,但一些功能尚有爭議。目前TA被廣泛接受的功能如下。

1.2.1 維持質(zhì)粒穩(wěn)定性 F質(zhì)粒上的CcdA/CcdB是首個被鑒定的TA[2],它能夠穩(wěn)定質(zhì)粒,毒素CcdB是一個解旋酶,通過抑制促旋酶Gyrase的活性影響DNA復(fù)制,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡,而抗毒素CcdA不穩(wěn)定,必須持續(xù)不斷的合成才能阻止毒素CcdB的釋放[3]。如果攜帶ccdAB的質(zhì)粒丟失,由于抗毒素不能得到補(bǔ)充,導(dǎo)致毒素CcdB從細(xì)胞中存在的CcdAB蛋白質(zhì)復(fù)合體脫離,從而對細(xì)菌產(chǎn)生毒性[3]。

1.2.2 TA在抵御噬菌體中的作用 在長期的進(jìn)化過程中,細(xì)菌進(jìn)化出多種策略抵御噬菌體的侵染,例如CRIPSR系統(tǒng)和限制-修飾系統(tǒng)等[42, 43]。TA自1996年首次報道可以抗噬菌體[44]。目前,TA在抵御噬菌體中的作用得到了廣泛認(rèn)可。細(xì)菌的其他防御系統(tǒng)通常能夠區(qū)分非己和自己,而TA則不能,因此,細(xì)菌中的TA必須在被噬菌體感染前保持沉默[4-7],一旦被噬菌體感染,TA就會快速激活,毒素可以干擾噬菌體感染的各個階段而不僅僅是CRISPR和限制-修飾系統(tǒng)主要針對噬菌體DNA或者RNA[42, 43],例如毒素可以通過抑制噬菌體的復(fù)制,阻止子代噬菌體的成熟[45],也可以靶向宿主關(guān)鍵蛋白質(zhì),導(dǎo)致被噬菌體感染的細(xì)菌的死亡,防止噬菌體擴(kuò)散感染[46]。

大腸桿菌RnlAB 是研究比較清楚的具有抗噬菌體功能的TA,RnlA作為毒素,是1個HEPN家族核酸內(nèi)切酶,可以降解大腸桿菌的mRNA,抑制其生長,RnlB是抗毒素,通過結(jié)合在HEPN二聚體界面,阻止底物接近其RX4H酶活中心[4, 5]。它對缺乏dmd基因的T4噬菌體表現(xiàn)出極強(qiáng)的抵御能力[5, 7],Dmd對于T4噬菌體發(fā)育晚期穩(wěn)定mRNA至關(guān)重要[6]。

DarTG TA是最近被鑒定的具有抗噬菌體功能的TA,DarTG可以賦予大腸桿菌抵抗T5和RB69噬菌體的能力[45],毒素DarT是一個具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶功能的酶,能利用NAD將單鏈DNA的胸腺嘧啶上的堿基進(jìn)行ADP-核糖基化修飾,抑制DNA的合成,而抗毒素DarG具有ADP-水解酶功能,可以逆轉(zhuǎn)毒素DarT對底物的修飾。在噬菌體感染過程中,毒素DarT可以將噬菌體DNA進(jìn)行ADP-核糖基化修飾,導(dǎo)致噬菌體DNA合成被抑制,阻止噬菌體產(chǎn)生子代[45]。

1.2.3 促進(jìn)持留菌的形成 持留菌(persister)是微生物群體在抗生素或者其他環(huán)境條件脅迫下,進(jìn)入“停止生長但保留一定代謝活性”的極小部分成員。這些細(xì)胞處于休眠狀態(tài),能夠幫助微生物群體度過極端環(huán)境,是臨床上一些由致病菌感染所導(dǎo)致的疾病反復(fù)發(fā)作的重要原因[47]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),TA系統(tǒng)與持留菌的形成密切相關(guān),其中大腸桿菌HipBA是最早發(fā)現(xiàn)與促進(jìn)持留菌形成的TA系統(tǒng)。在應(yīng)激環(huán)境中,抗毒素HipB被活化的Lon蛋白酶降解,HipA毒素從HipB-HipA復(fù)合物中釋放出來,游離在細(xì)胞內(nèi)。游離的HipA磷酸化谷氨酰-tRNA合成酶(GltX),導(dǎo)致無電荷的tRNAGlu累積,從而抑制蛋白質(zhì)翻譯過程,最終抑制細(xì)菌生長并形成持留菌[48, 49]。除了HipBA,Ccd、PasTI和RelBE等TA也被認(rèn)為與持留菌形成相關(guān)[50]。

2 非經(jīng)典的毒素-抗毒素系統(tǒng)

經(jīng)典的TA系統(tǒng)通常只包含一個毒素和對應(yīng)的抗毒素,隨著研究的深入,越來越多的非經(jīng)典TA系統(tǒng)被鑒定出來,主要包括單順反子TA系統(tǒng)和3組分TA系統(tǒng)(Table 1)。

Table 1 Types of TA with three components

2.1 單順反子TA系統(tǒng)

有些TA的毒素和抗毒素融合在一起,被稱為單順反子TA系統(tǒng)[9, 35, 36],例如最近研究發(fā)現(xiàn)的CapRelSJ46TA[10]。CapRelSJ46是N端與細(xì)菌信號素分子(alarmone)合成酶同源,可以合成腺苷四磷酸(ppApp),累積的ppApp以及細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)和三磷酸鳥苷(GTP)的消耗會導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的抑制和細(xì)菌生長的停滯;其C端的結(jié)構(gòu)域充當(dāng)抗毒素的功能,對N端的毒素發(fā)揮調(diào)控作用[9]。此外,其他類型的單順反子TA系統(tǒng)也有報道,例如MNT-HEPN TA中抗毒素和毒素融合在一起[35, 36, 62],但其如何發(fā)揮功能還不清楚。

2.2 3組分TA及作用機(jī)制

2.2.1 ω-ε-ζTA ω-ε-ζ 是在pSM19035質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的一種3組分TA,在枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、以及釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)中都有被發(fā)現(xiàn)[51-53]。其中,ε-ζ是一個典型的Ⅱ型TA,毒素ζ為激酶,在結(jié)構(gòu)上與單核苷酸或多核苷酸酶相似度較高[63]。尿苷二磷酸N-乙?；?D-葡糖胺(UDP-N-acetylglucosamine, UNAG)為細(xì)胞壁合成的前體,毒素ζ特異性磷酸化UNAG,生成UNAG-3P,作為肽聚糖前體關(guān)鍵合成酶MurA的競爭性抑制劑,從而干擾肽聚糖的生物合成[64, 65]。此外,UNAG同樣是革蘭氏陽性菌中磷壁酸合成的重要前體,所以毒素ζ也能夠抑制磷壁酸的生成[64]?？苟舅卅趴梢詫彼岷捅奖彼岬膫?cè)鏈伸入毒素ζ的ATP/GTP結(jié)合口袋,通過阻止ATP的結(jié)合抑制ζ活性[63]。而ω并不直接參與對細(xì)胞毒性與毒性中和作用過程,而是對ω -ε-ζ操縱子整體的調(diào)節(jié)[51]。

2.2.2 大腸桿菌paaR2-paaA2-parE2TA 在大腸桿菌O157:H7中發(fā)現(xiàn),由PaaR2-PaaA2-ParE2組成的3組分TA[54-56],毒素ParE2定位在擬核上,與CcdA/CcdBTA相似,能夠與DNA促旋酶結(jié)合產(chǎn)生毒性,而PaaA2則作為抗毒素直接與毒素ParE2結(jié)合形成PaaA2-ParE2異二聚的八聚體,使得ParE2遠(yuǎn)離作用底物[54]。第3個組分PaaR2能夠抑制paaR2-paaA2-parE2操縱子的轉(zhuǎn)錄,對整個TA系統(tǒng)至關(guān)重要[55, 56]。

2.2.3 TA-chaperone(TAC)系統(tǒng) TAC包含一個II型TA和SecB樣分子伴侶(SecB-like chaperone),3個組分處于同一操縱子。TAC能夠幫助維持抗毒素的穩(wěn)定性從而阻止抗毒素的降解,協(xié)助抗毒素中和毒素的毒性[61, 66-68]。迄今為止,人們對于人類病原菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的TAC理解最為清楚,它由3個基因Rv1955-Rv1956-Rv1957組成,分別編碼1個抗毒素HigA和毒素HigB以及分子伴侶MtbSecB[61]。MtbSecB專一性地調(diào)控HigBA TA,研究發(fā)現(xiàn),抗毒素C-端具有1個額外的羧基端,延伸區(qū)域富含芳香族氨基酸和堿性氨基酸,它們在一級序列是高度可變的,分子伴侶特異性地結(jié)合在抗毒素的C端,穩(wěn)定抗毒素從而阻止其被降解,進(jìn)而抑制毒素的毒性[61]。

2.2.4 FaRel-ToxSAS-antiToxSASTA Jimmy等人發(fā)現(xiàn),在厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)的多個物種中發(fā)現(xiàn)一個含有信號素分子合成酶的3組分TA。該系統(tǒng)中的毒素單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(single-domain small alarmonesynthetases, SASs)通過消耗ATP和GTP,產(chǎn)生ppApp和pppGpp之類的信號素分子[28],導(dǎo)致細(xì)胞活性降低甚至死亡。在FaRel-ToxSAS-antiToxSAS TA中,毒素toxSAS周圍有2個具有抗毒素功能的蛋白質(zhì),有趣的是它們分別以II型 TA 和IV 型TA的機(jī)制發(fā)揮中和toxSAS毒性的功能,一個可以通過直接與ToxSAS相互作用,抑制信號素分子的產(chǎn)生,另一個則直接將信號素分子降解[28]。

3 HipBST是一類廣泛存在的新型3組分毒素-抗毒素

關(guān)于II型TA HipBA的研究比較清楚,人們發(fā)現(xiàn),很多微生物中存在編碼大腸桿菌毒素HipA_C端結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因hipA_C[69],但是缺乏對它們的深入研究。最近發(fā)現(xiàn),hipA_C、hipA_N和hipB共同組成1個3組分TA-HipBST[11, 14],并且它們在細(xì)菌的底物以及毒素被中和的方式與大腸桿菌的HipBA明顯不同。

3.1 HipBA的組成及中和機(jī)制

經(jīng)典的II型TA HipBA廣泛存在于細(xì)菌中,由毒素HipA和抗毒素HipB組成,2個基因處于同一個操縱子并可以共轉(zhuǎn)錄[48, 49, 70, 71]。大腸桿菌中HipA是一種由440個氨基酸組成的絲氨酸/蘇氨酸激酶,具有保守的負(fù)責(zé)結(jié)合ATP的P-環(huán)(P-loop)和對催化發(fā)揮關(guān)鍵作用的天冬氨酸[48, 72]。HipA通過磷酸化谷氨酰-tRNA合成酶(GltX)第239位的絲氨酸,阻止GltX結(jié)合ATP,導(dǎo)致無電荷tRNAGlu的累積,從而抑制蛋白質(zhì)翻譯[39, 73, 74]。除了磷酸化GltX,在新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)編碼的3個HipBA中,HipA1和HipA2可以分別磷酸化賴氨酰tRNA合成酶LysS和色氨酰tRNA合成酶TrpS[71]。HipA對蛋白質(zhì)翻譯的抑制可以被抗毒素HipB中和,HipB是一個具有典型螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 (helix-turn-helix,HTH)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,它可以結(jié)合在hipBA操縱子上游的TATCCN8GGATA基序,HipB與HipA形成HipBA復(fù)合物后也可以結(jié)合在hipBA操縱子的啟動子區(qū),通過抑制hipBA的轉(zhuǎn)錄從而中和HipA的毒性[75]。目前,關(guān)于HipB中和HipA的分子機(jī)制仍不清楚,根據(jù)已經(jīng)解析的HipB-HipA復(fù)合體的結(jié)構(gòu),HipB和HipA形成(HipA)2-(HipB)2異源四聚體,HipB二聚體被2個HipA夾在中央,通過與HipA的N-端特異性結(jié)合,形成一個三明治樣結(jié)構(gòu)[39, 49, 76]。與其他II型TA不同的是,抗毒素直接和毒素的酶活中心結(jié)合,抑制毒素的毒性;而HipB遠(yuǎn)離HipA的激酶活性中心,推測HipB的C端結(jié)合在HipA的一個口袋,可以調(diào)控它的激酶活性[76]。此外,HipA毒性的調(diào)節(jié)也受其P-環(huán)自磷酸化的影響,位于P-環(huán)中保守的S150的磷酸化,使P-環(huán)處于向外狀態(tài),阻止ATP的結(jié)合,導(dǎo)致其激酶活性的喪失[48, 72]。

3.2 HipBST組成一個3組分TA

最近,研究人員通過在微生物基因組中用大腸桿菌HipA進(jìn)行相似性搜索,意外發(fā)現(xiàn)了廣泛存在于微生物中的短的HipA樣蛋白質(zhì)(HipA-like protein)HipT[12, 13],長度約310個氨基酸,與大腸桿菌HipA相比,HipT缺乏HipA_N端的大約100個氨基酸,這些大量存在的高度保守的HipA樣蛋白質(zhì)在NCBI數(shù)據(jù)庫中被標(biāo)注為包含HipA_C蛋白質(zhì)家族[12, 13],它們都具有HipA保守的P-環(huán)以及對激酶活性關(guān)鍵的天冬氨酸[11, 13, 77]。有趣的是在這些短的HipA樣蛋白質(zhì)家族中,其上游開放閱讀框編碼一個100個氨基酸左右的小蛋白質(zhì)HipS,巧合的是,HipS與大腸桿菌HipA的N端具有20%的相似性,從一級序列看,HipT和HipS就像HipA斷裂產(chǎn)生的,而HipS的上游基因編碼一個與HipB具有同源性的HTH型DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子[11-13]。在大腸桿菌中過表達(dá)具有激酶結(jié)構(gòu)域的HipT對細(xì)菌的生長表現(xiàn)出嚴(yán)重的毒性,HipT可以磷酸化色氨酰tRNA合成酶TrpS197位保守的色氨酸,而HipT和HipS的共表達(dá)則可完全緩解HipT對細(xì)菌的生長抑制,而共表達(dá)HipT和HipB則不能緩解HipT對大腸桿菌的毒性,這說明由HipA“斷裂”而來的HipT和HipS分別作為毒素和抗毒素(Fig.2)[11-13]。隨后,研究人員在細(xì)菌和古菌中進(jìn)行hip基因的進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)了10種新的不同于HipBA的TA,例如單順反子編碼的HipL具有一個激酶核心、HipS結(jié)合于和一個結(jié)合單鏈DNA的HIRAN結(jié)構(gòu)域,這說明了hip相關(guān)基因在微生物基因組中分布的廣泛性和多樣性(Fig.3)[12]。

Fig.2 Comparative schematic diagram of the action mechanism of HipBST and HipBA HipT inactivates TrpS by phosphorylation, and the inactivation of TrpS increases the level of uncharged tRNATrp, which binds to RelA and enters the ribosomal A site. Binding to RelA-tRNATrp complex at site A can activate RelA synthesis of (p) ppGpp. The function of HipT autophosphorylation is unclear. In addition, HipBST proteins form one or more complexes, and HipT is inactivated by HipS. HipB contains a HTHDNA binding motif and may automatically adjust the hipBST operon; HipA inactivates GltX(LysS/TrpS) by phosphorylation, and the inactivation of GltX increases the level of uncharged tRNAGlt, which binds to RelA and enters the ribosomal A site. Binding to RelA-tRNAGlt complex at site A can activate RelA synthesis of (p) ppGpp. Autophosphorylation of HipA inhibits its self-activity. In addition, HipBA protein forms a complex and HipA is inactivated by HipB. HipB contains a HTHDNA binding motif and may automatically adjust the hipBA operon (modified from reference[13])

Fig.3 Distribution of HipA_C-terminal domain like proteins in bacteria HipA_C-terminal domain like proteins were widespread in bacteria, the phylogenetic tree of these proteins was drawn according to maximum likelihood and stained according to the classification in the lower left corner

近期,我們實驗室在研究嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)效應(yīng)蛋白質(zhì)時發(fā)現(xiàn),最初被鑒定為RING型泛素連接酶的效應(yīng)蛋白Lpg2370與大腸桿菌HipA具有約20%同源性,特別是具有HipA保守的絲氨酸-蘇氨酸的P-環(huán)以及激酶催化活性依賴的天冬氨酸,并且通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),Lpg2370 P-環(huán)上第54位保守的Ser存在自磷酸化,表明Lpg2370可能是一個絲/蘇氨酸激酶[14]。隨后,通過X-射線晶體學(xué)解析了Lpg2370的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Lpg2370的確具有一個典型的激酶結(jié)構(gòu)域,并且其P-環(huán)以及被磷酸化的Ser54上的磷酸基團(tuán)清晰可見,而并未發(fā)現(xiàn)Lpg2370與經(jīng)典的E3泛素連接酶結(jié)構(gòu)有任何形似性[14]。通過Dali search分析發(fā)現(xiàn),Lpg2370確實與大腸桿菌的HipA結(jié)構(gòu)最為相似[14, 78]。分析Lpg2370在基因組中的位置,發(fā)現(xiàn)與Lpg2370處于相同操縱子編碼的Lpg2368和Lpg2369分別與HipB以及HipA的N端具有約20%的同源性,這表明Lpg2368～2370可能是嗜肺軍團(tuán)菌中潛在的HipBST。進(jìn)一步的研究表明,在嗜肺軍團(tuán)菌中過表達(dá)Lpg2370可以顯著抑制嗜肺軍團(tuán)菌的生長,并且Lpg2370對嗜肺軍團(tuán)菌生長的抑制依賴于其激酶活性,這說明Lpg2370對嗜肺軍團(tuán)菌具有毒性,并且其底物具有種屬特異性[14, 78]。與E.coliHipBST類似,Lpg2370對嗜肺軍團(tuán)菌的菌毒性可以直接被Lpg2369完全中和,而Lpg2368對Lpg2370的毒性無顯著直接影響,體外生物化學(xué)研究證據(jù)表明,Lpg2370可以與Lpg2369形成2元復(fù)合物,并能進(jìn)一步與Lpg2368形成3元復(fù)合物,這與之前在大腸桿菌E.coliO127的HipBST現(xiàn)象一致[11-14]。

3.3 HipBST中和機(jī)制

HipBST中的毒素和抗毒素分別與大腸桿菌毒素HipA的激酶結(jié)構(gòu)域和N端有同源性,而不直接依賴于HipB,這說明HipBST的中和機(jī)制完全不同于HipBA[78];此外,自磷酸化的HipT的P-環(huán)的構(gòu)象與HipA未被磷酸化的構(gòu)象一樣,說明磷酸化的HipT處于一個激活狀態(tài)[11-13]。等溫滴定量熱法證實,HipT磷酸化后仍可結(jié)合ATP,這進(jìn)一步被HipT-AMP-PNP的結(jié)構(gòu)證實,發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合在HipT被P-環(huán)包裹的一個腔中(Fig. 4C)[11-14, 78]。為了闡明HipBST的中和機(jī)制,研究人員又進(jìn)一步解析了嗜肺軍團(tuán)菌HipBST中毒素HipT與抗毒素HipS的復(fù)合物。HipT-HipS的整體結(jié)構(gòu)與HipA結(jié)構(gòu)較為相似,抗毒素HipS結(jié)合的位置基本在HipA缺失的N端[11-14]。為了解釋HipS的結(jié)合如何導(dǎo)致HipT毒性的喪失,通過比較解析HipBST的一系列結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)HipS的結(jié)合導(dǎo)致了HipT的P-環(huán)的構(gòu)象發(fā)生了構(gòu)象變化,由環(huán)變成了一個短的α螺旋(Fig.4A、B)[14, 78]。進(jìn)一步比較HipT與HipT-AMP-PNP的結(jié)構(gòu),證實HipT P-環(huán)的別構(gòu)效應(yīng)產(chǎn)生的螺旋,與ATP之間存在空間位阻,阻止了HipT與ATP的結(jié)合(Fig.4A、B、C)[14, 78]。

Fig.4 The toxicity neutralization mechanism of the HipBST TA The structures of apoHipT (PDB: 7VKC), HipT-HipS (PDB: 7VKB) and HipT-AMP-PNP(PDB: 7WCF), the conformation change of the p-Loop of the toxin induced by the binding of antitoxin are highlighted in figure A (bottom panel) and figure B (bottom panel), which prevents the ATP binding when compared to the structure of HipT-AMP-PNP (Fig. 4C)pLpg2370(pHipT)Lpg2370-Lpg2369(HipT-HipS) Lpg2370-AMP-PNP(HipT-AMP-PNP)

大腸桿菌HipBST的三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)最近也被解析[11]。結(jié)果顯示,該復(fù)合體是形成由二聚化HipB介導(dǎo)的異源6聚體,并且HipB只與HipT存在相互作用,而不與HipS結(jié)合。與軍團(tuán)菌HipBST不同的是,E.coliHipBST的HipT的P-環(huán)存在2個絲氨酸,這2個絲氨酸S57和S59都被磷酸化,然而S57和S59的磷酸化有不同的功能,這說明HipT存在復(fù)雜的自我調(diào)控能力[11, 14]。

HipBST中HipB雖然不能直接中和HipT的毒性,卻是HipBST不可缺少的,作為具有結(jié)合DNA能力的轉(zhuǎn)錄因子,HipB可以結(jié)合在hipBST操縱子的啟動子區(qū),能夠有效的抑制hipBST的轉(zhuǎn)錄[11-13],因此,不同于II型TA中抗毒素具有中和毒素和對TA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能,而HipBST中這一功能由HipS和HipB分別執(zhí)行[11, 14]。然而,關(guān)于HipB的具體功能,仍然需要進(jìn)一步研究。

4 問題與展望

雖然TA廣泛存在于原核生物基因組,然而目前對于TA的生物學(xué)功能知道的非常有限。HipBA作為一個研究相對較為清楚的II型TA,最近HipA同源蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)大量存在于微生物基因組中[12, 13],這說明了HipBA的多樣性,然而僅有HipBST已被研究證實,其他HipBA樣的TA有待進(jìn)一步深入研究。雖然目前HipBST的中和機(jī)制被揭示,但是HipBST的生物學(xué)功能仍不清楚,仍需要繼續(xù)研究,特別是嗜肺軍團(tuán)菌HipBST中的毒素兼具效應(yīng)蛋白質(zhì)功能,除了在細(xì)菌體內(nèi)會發(fā)毒素功能外,它也可以通過VI型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主胞內(nèi),然而對于它在宿主內(nèi)的功能也需要進(jìn)一步研究。除了毒素HipT(Lpg2370),水稻條斑病毒(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)II型TAAvrRxo1ORF1-ORF2中,毒素AvrRxo1也被證實是一個III型效應(yīng)蛋白質(zhì)[14, 79, 80]?？傊?這些發(fā)現(xiàn)為效應(yīng)蛋白質(zhì)和TA中的毒素在進(jìn)化上提供了線索。

藥物耐受性是臨床上治療致病菌感染要面對的主要難題之一,而細(xì)菌的耐藥性主要依賴于持留態(tài)細(xì)菌的形成,TA系統(tǒng)被認(rèn)為與持留菌的形成有關(guān)[66, 81, 82],例如Shaleen B Korch等人發(fā)現(xiàn),大腸桿菌中的hipA7能夠使菌種對抗生素的耐受性提高100倍以上[83]。同時發(fā)現(xiàn),帶有hipA7的菌種對多種藥物的耐受性提高,例如,氟喹諾酮類藥物、β-內(nèi)酰胺類抗菌劑和氨基糖苷類抗生素[84],這為以TA為靶標(biāo)的微生物感染治療提供了理論基礎(chǔ)。噬菌體治療是解決耐藥微生物問題的一個重要替代策略[85],而HipBST經(jīng)常與其它具有抗噬菌體功能的基因出現(xiàn)在細(xì)菌的防御島,暗示著HipBST可能也具有抵御噬菌體侵染的功能[86]。因此,對于HipBST是否具有抗噬菌體的功能的研究,可能為噬菌體治療在相關(guān)病原菌的防控提供理論基礎(chǔ)。