不同枸杞品種嫩莖游離氨基酸的區(qū)域化差異

熊武來,李佳佳,國靖,郭起榮,汪貴斌

(南京林業(yè)大學,南方現代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京,210037)

枸杞為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium),多年生落葉灌木,原產于我國。果、葉、莖、花均可利用,藥用和營養(yǎng)保健價值高,是傳統(tǒng)的藥食同源植物,在我國和東南亞等地區(qū)大規(guī)模種植[1]。目前關于枸杞的研究主要集中在枸杞果實和葉的功能成分提取與分析、產品開發(fā)利用等方面[2-3]。枸杞嫩莖可作為綠色無公害蔬菜,以及茶葉和功能性食品等的原料,其具有枸杞葉和果的部分功效,有很好的消費市場[4],但目前對枸杞嫩莖營養(yǎng)價值的研究較少[5]。

氨基酸是蛋白質的構建模塊,而蛋白質是人體中肌肉、器官、酶等的組成部分[6]。氨基酸可以幫助修復、恢復和建立人體組織,人體不能像儲存脂肪一樣存儲氨基酸,且人體本身不能合成必需氨基酸(essential amino acid,EAA),因此,需要從食物獲得氨基酸,這使得氨基酸的地位至關重要。游離氨基酸(free amino acid,FAA)是枸杞嫩莖的主要營養(yǎng)成分,可被人體直接吸收利用,參與體內的生理活動。FAA也是一種呈味物質,普遍存在于植物中,其組成及含量的差異會導致食用時出現酸、甜、苦等多樣的味感,可能是茶的風味和保健功能的主要貢獻者[7-8]。FAA及其組成成分含量是評價食品質量及營養(yǎng)價值的重要指標,充分了解食品原料的氨基酸組成,對于產品開發(fā)具有指導意義[9-10],聯(lián)合國糧農組織建議將可消化或生物可利用氨基酸的數據列入食物表[11]。目前,關于枸杞嫩莖中氨基酸組成的信息研究很少[5]。本研究以3個種植地的4個枸杞品種為研究對象,測定分析枸杞嫩莖中FAA組分及其含量的差異,并對其進行綜合評價,以期為進一步認識枸杞嫩莖的營養(yǎng)和藥用價值及其開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020年,以4個優(yōu)良枸杞品種的1年生扦插苗為造林材料,分別種植于江蘇鹽城、青海德令哈和甘肅玉門。4個品種分別是寧夏神杞農林科技有限責任公司培育的‘寧杞1號’,青海海西州農業(yè)科學研究所培育的‘柴杞1號’、‘柴杞2號’和‘柴杞3號’。采取隨機區(qū)組試驗設計,3個重復,每重復40株扦插苗。扦插苗長勢基本一致,主干粗為(3.0±0.5) mm,株高為(40±10) cm,株行距為1 m×2 m。2021年9月,每個區(qū)組選擇30株樹,每株從東、南、西、北、中5個方向采摘健壯、無病蟲害的嫩莖,將嫩莖于50 ℃烘箱中烘干,磨碎后過200目篩備用[3]。

氣象數據來源于中國氣象數據網(http://data.cma.cn/),試驗地氣候條件見表1。

1.2 儀器與試劑

S-443D全自動氨基酸分析儀,德國Sykam公司;FD5型冷凍干燥儀,美國SIM公司;Milli-Q超純水一體機,美國Millipore公司;氨基酸標準溶液、稀釋緩沖液(12 g/L檸檬酸,pH 2.20的檸檬酸鈉緩沖液)。

1.3 試驗方法

1.3.1 FAA測定

參考GB/T 30987—2014《植物中游離氨基酸的測定》,略有改動。精確稱取樣品粉末0.2 g,加入燒杯中用10 mL的沸水沖泡,95 ℃水浴加熱振蕩,每隔5 min搖勻一次,提取10 min后取出,利用布氏漏斗和濾紙趁熱抽濾,將濾液進行真空冷凍干燥[12]。再加入稀釋緩沖液溶解,過0.45 μm濾膜得待測液,置于全自動氨基酸分析儀自動進樣器上進樣分析,對17種FAA進行上機檢測。分析條件如下:色譜柱LCAK06/Na;流動相A(0.012%檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH 3.45),B(0.02%檸檬酸-檸檬酸鈉,pH 10.85);58～74 ℃梯度控溫;流速洗脫泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min;壓力3～4 MPa;紫外檢測波長570和440 nm[12]。

1.3.2 氨基酸營養(yǎng)評價

氨基酸評分(amino acid score,AAS)是將所有EAA分別與聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織提出的人體EAA模式進行比對,用于簡單地評價食物蛋白質營養(yǎng)價值[12]。必需氨基酸指數(essential amino acid index,EAAI)是將蛋白質中所有EAA的含量作為一個整體,對蛋白質質量進行營養(yǎng)評價的指標,能夠反映EAA組成結構的總體營養(yǎng)價值。通常EAAI≥0.90時認定為優(yōu)質高效的蛋白質,0.70≤EAAI<0.90為中等營養(yǎng)價值,當EAAI<0.70時為低品質。AAS和EAAI計算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:a,EAA含量;p,待測氨基酸;s,參考評分模式氨基酸,依次為Phe+Tyr:3.8,Met+Cys:2.7,Lys:4.5,Thr:2.3,Val:3.9,Ile:3.0,Leu:5.9,His:1.5;n,參與計算EAA數量[12]。

1.3.3 味道強度值(taste active value,TAV)的計算

按照氨基酸呈味差異,可以大致把氨基酸分為鮮味氨基酸(Glu、Asp、Lys)、甜味氨基酸(Thr、Gly、His、Ala、Pro、Ser)、苦味氨基酸(Met、Arg、Val、Leu、Ile)和芳香族氨基酸(Phe、Tyr),TAV指呈現味道的物質含量值與呈現味道物質味覺閾值的比值[12-14]。TAV與其呈味物質呈正相關,當TAV>1時,表示該物質對整體風味有貢獻,TAV<1時則貢獻較小[12]。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用Excel 2010進行數據統(tǒng)計分析,計算氨基酸平均值、標準差及變異系數,SPSS 22進行方差分析,Duncan多重比較,P<0.05差異顯著,有統(tǒng)計學意義,Origin 2021作圖。枸杞嫩莖各氨基酸含量存在差異,根據各氨基酸含量相關性大小,通過SPSS 22將17種氨基酸降維成3個綜合指標,以3個主成分指標進行綜合指標評價。

2 結果與分析

2.1 種植地和品種對枸杞嫩莖FAA組分和總量的影響

不同品種及種植地枸杞嫩莖的FAA組分和總量均存在顯著差異(P<0.05)(表2、表3)。3個種植地的4個枸杞品種嫩莖均含有17種FAA,平均含量從高到低依次為脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、異亮氨酸(Ile)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)。整體上,種植地和品種中,Pro含量最高,其次為Ser和Thr,Gly含量最低。

青海德令哈‘柴杞1號’的游離氨基酸總量(total free amino acids,TFAAs)含量最高,江蘇鹽城‘寧杞1號’最低(圖1)。種植地和品種中,青海德令哈和‘柴杞1號’的TFAAs含量分別顯著較高。其中青海德令哈枸杞嫩莖的Pro含量,顯著高出江蘇鹽城和甘肅玉門(表2)。各種植地中,枸杞嫩莖TFAAs含量變異程度最大的是江蘇鹽城,青海德令哈變異程度最小(表3)。枸杞品種中嫩莖TFAAs變異程度最大的是‘寧杞1號’,‘柴杞3號’變異程度最小。以上結果說明,不同種植地和品種枸杞嫩莖的氨基酸總量變幅大,種植地和品種差異能夠影響Pro等FAA的含量,從而影響TFAA。

2.2 種植地和品種對枸杞嫩莖EAA含量的影響

品種及種植地對枸杞嫩莖EAA的含量產生了顯著影響(圖2)。江蘇鹽城‘柴杞3號’的EAAs

圖2 不同種植地和不同品種枸杞嫩莖中EAA含量Fig.2 Content of EAAs in tender stems of L. barbarumin different planted places and varieties

含量最高,高出甘肅玉門‘寧杞1號’271%。江蘇鹽城‘柴杞1號’、‘柴杞2號’和‘柴杞3號’的EAAs含量顯著高于青海德令哈和甘肅玉門?！畬庤?號’在各品種中EAAs含量較低。江蘇鹽城的Cys、Val、Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys這8種EAA含量均顯著高于其他種植地,且這8種氨基酸占江蘇鹽城TFAAs含量的31.62%,顯著高于青海德令哈的9.46%和甘肅玉門的10.41%,其絕對含量也是其他兩地的2倍(表2)。種植地間變異系數最大的是玉門,為26.88%,最小的是青海,為5.95%。變異系數最大的品種是柴杞3號,為39.84%,變異系數最小的是柴杞1號,為19.92%(表4)。

表4 不同品種、不同種植地間EAA的方差分析及變異程度Table 4 Variance analysis and variation degree of EAAs among different varieties and planted places

2.3 種植地和品種對枸杞嫩莖藥用氨基酸含量的影響

如圖3所示,種植地對枸杞嫩莖的藥用氨基酸含量影響差異顯著(P<0.05)。江蘇鹽城‘柴杞3號’的藥用氨基酸含量最高,甘肅玉門‘寧杞1號’的藥用氨基酸含量最少。江蘇鹽城枸杞嫩莖的藥用氨基酸含量占TFAAs含量的38.60%,遠高于青海德令哈的9.36%和甘肅玉門的9.56%。不同品種枸杞的嫩莖中,‘柴杞1號’藥用氨基酸含量最高,‘寧杞1號’最低。除‘寧杞1號’品種外,江蘇鹽城中Met、Leu、Tyr、Phe、Lys、Arg、Asp這7種藥用氨基酸的含量顯著高于其他種植地(P<0.05)(表2)。變異系數最高的種植地是玉門,為27.97%,最低是青海(12.20%)。變異系數最大的品種是‘柴杞3號’,為60.04%,‘柴杞1號’最小,為43.59%(表5)。

圖3 不同種植地和不同品種枸杞嫩莖中藥用氨基酸含量Fig.3 Contents of medicinal amino acids in tender stems ofL. barbarum in different planted places and varieties

表5 不同種植地和品種間藥用氨基酸含量的方差分析及變異程度Table 5 Variance analysis and variation degree of medicinal amino acid content between different planted places and varieties

2.4 枸杞嫩莖氨基酸營養(yǎng)評價

2.4.1 AAS和EAAI

江蘇鹽城枸杞嫩莖的AAS>1,符合營養(yǎng)模式標準(圖4)?？傮w上江蘇鹽城的枸杞EAA組成優(yōu)于青海和玉門。Thr和His是AAS指數中最高的氨基酸,而Ile的AAS<1,比其他氨基酸AAS值均小,說明其含量較低,屬于第一限制性氨基酸[12]。江蘇鹽城枸杞品種的嫩莖EAAI得分最高,分別為141.47%、133.30%、138.97%、141.18%,原因在于其Thr和Leu的比例較高(圖5)。青海和玉門的EAAI都低于70%,屬于低營養(yǎng)值。

圖4 三個種植地不同枸杞品種嫩莖AAS Fig.4 AAS of tender stems of different L. barbarum varieties in three planted places

圖5 三個種植地不同枸杞品種EAAI Fig.5 EAAI of tender stems of different L.barbarumvarieties in three planted places

2.4.2 呈味特征和TAV分析

枸杞嫩莖的呈味氨基酸組成模式相似,貢獻較大的是甜味氨基酸和鮮味氨基酸,苦味氨基酸含量較少,芳香族氨基酸最少(圖6)。其中,青海種植的枸杞甜味氨基酸含量最高,其中最高的品種是‘柴杞1號’。

圖6 呈味氨基酸含量Fig.6 Contents of flavor amino acids

經TAV轉換后,大部分氨基酸TAV<1,對枸杞嫩莖風味無貢獻(表6)。除玉門‘寧杞1’號外,甜味氨基酸His在不同地點和品種都對味覺有影響,貢獻甜滋味。另外,江蘇鹽城的‘柴杞1號’‘柴杞2號’‘柴杞3號’的Asp、Ser、Val分別貢獻了鮮味、甜味、苦味,青海 ‘柴杞1號’‘柴杞2號’‘柴杞3號’的Ser>1,青海和玉門枸杞嫩莖的Pro都貢獻了甜滋味。

表6 不同品種和種植地枸杞呈味氨基酸TAV Table 6 Taste activity values of avor amino acids in different L. barbarum varieties of three planted places

分類氨基酸TAVYCC1YCC2YCC3YCN1QHC1QHC2QHC3QHN1YMC1YMC2YMC3YMN1均值味道閾值/(mg/g)鮮味Glu0.280.340.341.300.920.860.840.730.510.480.450.480.630.30Asp1.381.101.140.600.170.150.130.060.070.070.130.080.421.00Lys0.860.881.120.610.600.680.550.520.690.430.450.300.640.50甜味Thr0.240.230.260.160.400.300.360.350.240.290.220.130.262.60Gly0.040.040.050.020.040.040.030.040.040.020.020.020.041.30His2.012.222.741.731.691.661.471.351.611.141.190.771.630.20Ala0.580.480.680.310.550.510.421.040.460.390.370.230.500.60Pro0.460.550.550.234.123.653.443.843.093.073.221.732.333.00Ser1.171.551.690.801.401.241.100.670.720.740.620.451.011.50苦味Met0.330.310.440.230.240.220.200.130.270.130.170.090.230.30Arg0.600.540.740.320.420.370.350.240.330.200.210.120.370.50Val1.171.051.250.860.520.630.520.540.620.430.430.280.690.40Leu0.300.260.340.170.180.200.160.130.200.110.120.080.191.90Ile0.320.270.320.140.110.130.100.130.140.090.090.050.160.90芳香族Phe0.570.550.670.330.220.250.180.230.230.150.160.110.630.30Tyr0.220.830.250.110.080.090.070.100.130.070.070.040.421.00

2.4.3 枸杞嫩莖FAA主成分分析

對3個種植地4個品種枸杞嫩莖的17種氨基酸進行主成分分析,前3個主成分對應特征值均大于1,累計方差貢獻率為85.09%,基本上包括了17種氨基酸的大部分信息,因此選擇前3個主成分作為綜合指標對其品質進行綜合評價[3]。如表7所示,PC1貢獻率63.20%,變量Phe、Val、Ile、Leu、Arg、Lys、His、Cys、Met、Asp、Ser有較高載荷。PC2貢獻率為15.58%,Thr、Pro、Ala、Gly具有較高載荷量。PC3貢獻率為6.31%,Ala、Glu有較高的載荷,其中Ala符號為負,說明Ala與之呈顯著負相關(表7)。

根據表7計算出特征向量,再以特征向量構建3個主成分的表達函數式[3]:

F1=0.283X1+0.001X2+0.244X3-0.106X4+0.028X5+0.09X6+0.29X7+0.299X8+0.288X9+0.299X10+0.297X11+0.14X12+0.302X13+0.29X14+0.294X15+0.294X16-0.199X17

F2=-0.162X1+0.574X2+0.233X3+0.200X4+0.328X5+0.383X6-0.157X7-0.034X8+0.083X9-0.031X10+0.084X11-0.189X12-0.041X13+0.132X14+0.098X15+0.129X16+0.417X17

F3=0.013X1-0.167X2+0.127X3+0.684X4+0.296X5-0.471X6-0.046X7+0.072X8+0.139X9-0.111X10+0.014X11-0.282X12-0.016X13+0.12X14+0.011X15+0.065X16-0.204X17

式中:X1、X2……X17分別表示Phe、Val…Glu等原始數據的標準化值。

3個主成分從不同方面體現了不同品種及地點枸杞嫩莖中氨基酸總體水平,單獨使用1個主成分并不能對不同品種及地點枸杞嫩莖中氨基酸的質量作出綜合性評價,因此根據主成分分析結果,以3個主成分對應的方差相對貢獻率作為權重建立綜合評價模型[14]:

F=0.743F1+0.183F2+0.074F3

根據主成分綜合得分模型,計算出3個地點枸杞品種的綜合得分值和排序結果(表8)。綜合得分由大到小依次為柴杞3號(鹽城)、柴杞1號(鹽城)、柴杞2號(鹽城)、柴杞1號(青海)、寧杞1號(鹽城)、柴杞2號(青海)、柴杞1號(玉門)、柴杞3號(青海)、寧杞1號(青海)、柴杞3號(玉門)、柴杞2號(玉門)、寧杞1號(玉門)。

表8 三個地點不同品種枸杞嫩莖綜合得分Table 8 The comprehensive score of tender stems of different L. barbarum varieties in three places

3 討論與結論

3.1 種植地對枸杞嫩莖氨基酸含量的影響

不同種植地氨基酸含量和營養(yǎng)品質具有較大差異[3]。這與不同產地枸杞葉、果的氨基酸成分種類差異不大,但含量差異較大[15-16],枸杞產量和品質受到種植地溫度、光照、降雨等生態(tài)環(huán)境影響[17]的報道相一致。種植地的氣候因子充當植物生長、發(fā)育、代謝的信號分子,起著綜合性調節(jié)作用,參與了多種生理過程,包括氨基酸的積累和消耗利用[18]。相關研究表明,氨基酸及其衍生物可調節(jié)植物細胞的滲透壓,保持細胞水分,提高植物的抗旱性和耐寒性[19]。因此,低溫干旱脅迫可以促進植物體內FAA積累[20]。本研究也得到了相似結果,即在高海拔、年均氣溫低和年降雨量少的青海德令哈和甘肅玉門兩地的TFAA明顯高于江蘇鹽城。劉建兵[21]發(fā)現干旱脅迫下,馬尾松通過調節(jié)次生代謝產物脯氨酸及FAA含量響應環(huán)境中的水分缺乏,使苗木適應干旱環(huán)境而繼續(xù)生長。胡立群等[22]研究發(fā)現,植物中氨基酸含量在低溫和干旱脅迫下迅速積累。脯氨酸等氨基酸組分含量的差異已被證明是植物對種植地氣候等非生物脅迫的適應性反應。植物中脯氨酸含量隨著所需水分減小而升高,這與干旱脅迫下脯氨酸合成增加,降解減少有關[23]。脯氨酸是中性氨基酸,具有高溶解度,在細胞中大量積累時,既不引起細胞內酸堿度變化,又能降低細胞水勢,可有效緩解干旱脅迫對植物的傷害[23]。因此,種植地的干旱環(huán)境可能會使枸杞中脯氨酸含量增加。本研究中,青海德令哈和甘肅玉門的枸杞嫩莖脯氨酸含量均比鹽城的高出數倍。

除了氨基酸含量和組分與產地有關,植物中氨基酸營養(yǎng)價值和藥用價值的差異可能與產地有關[24]。徐丹萍[25]的研究表明,氣候特點對花椒品質優(yōu)劣具有決定性作用,適宜的氣候環(huán)境條件對花椒的生長、發(fā)育、品質具有重要影響。降水量豐富且集中、年蒸發(fā)量相對較低有助于植物土壤中儲存更多的雨水,而雨水中溶有充足的氧氣,沖洗掉土壤中更多的鹽分,且雨水中的氮元素增加了土壤中水解氮含量,有利于植物根、葉吸收,同時促進部分藥用氨基酸的合成[26]。本研究中鹽城枸杞嫩莖藥用氨基酸含量占總氨基酸的38%左右,高于部分中藥中的藥用氨基酸含量[13]。這與其高溫、高降雨量、雨熱同季等氣候條件相關。

3.2 枸杞嫩莖品種間氨基酸含量的差異

同一地區(qū)不同枸杞品種氨基酸含量和營養(yǎng)品質差異較大,品種間理化性質和FAA譜存在較大差異[27]。王益民等[28]對10個枸杞品種果實進行氨基酸含量分析,認為不同品種間氨基酸的差異反映出不同種質間的積累特征。劉偉等[14]的研究表明,不同黃花菜品種之間氨基酸總量、人體EAA、呈味氨基酸及限制氨基酸的含量均存在較大差異。這些研究無疑表明植物氨基酸的合成與代謝規(guī)律與植物種質資源多樣、遺傳背景復雜,各個品種賦予特有的種質屬性有關[27]。與前人在品種間氨基酸差異的研究結果相似[29-30],本研究發(fā)現4個枸杞品種種植于同一種植地,且栽培管理措施和立地環(huán)境基本一致時,品種間氨基酸組分和總量、EAA呈味氨基酸存在較大差異性,推測不同品種間氨基酸含量的差異可能主要是由于其自身的遺傳特性所致[29]。

不同品種的氨基酸含量不同,會導致其營養(yǎng)價值和食藥用功效的差異,在開發(fā)和利用時可根據不同的目的選擇不同品種,以充分發(fā)揮其品種優(yōu)勢功效[30-31]。王馨雨等[32]研究表明蘭州百合甜味氨基酸含量豐富,適合于百合休閑食品開發(fā),豐富市場,而卷丹百合品種EAAs和藥用氨基酸均較高,可對品種進一步改良,發(fā)揚藥用品種優(yōu)勢。本研究中,‘柴杞1號’的呈味氨基酸含量和藥用氨基酸含量均為所有品種中最高,說明其在食藥用開發(fā)上可能具有遺傳學上的優(yōu)勢。

3.3 枸杞嫩莖氨基酸含量的種植地和品種交互效應

趙瓊玲等[33]研究表明影響余甘子果實氨基酸組成和總量的主要因素為品種和環(huán)境。本研究中也發(fā)現,枸杞嫩莖氨基酸組分、總量、EAA含量、藥用氨基酸含量在3個種植地4個品種差異顯著。根據主成分分析從17種FAA中提取到3個主成分綜合評價,其累計方差貢獻率為85.09%,較好地反映枸杞嫩莖FAA品質的綜合信息。綜合排名上,江蘇鹽城總體上得分較高,這可能是與鹽城適宜的氣候有關?！耔?號’在3個地點的排名整體上都高于另外3個品種,說明‘柴杞1號’枸杞9月份嫩莖比‘柴杞2號’‘柴杞3號’‘寧杞1號’嫩莖綜合營養(yǎng)品質高。由于本實驗選擇的枸杞樣品和種植地僅有4個品種和3個種植地,并未包括我國所有枸杞品種和不同氣候條件的種植地,因此還需擴大種植品種和地方范圍,詳細調查氣候條件和管理方式,設計實驗,明確品種和氣候因素對枸杞嫩莖氨基酸營養(yǎng)品種的影響,為枸杞嫩莖的營養(yǎng)與特征風味研究等開發(fā)利用提供更多理論依據。