復(fù)方沙棘籽油加速大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)的作用機(jī)制研究

邵書(shū)先，王 東，楊關(guān)根，裘建明，袁玥旻，何 瑾

肛門(mén)直腸周圍軟組織或其間隙發(fā)生急、慢性化膿性感染形成膿腫，稱為肛周膿腫，其臨床表現(xiàn)為不同程度的肛周局部紅腫、灼熱、疼痛等[1-2]。目前，肛周膿腫的主要治療手段為膿腫切開(kāi)引流術(shù)，但術(shù)后創(chuàng)面愈合緩慢，傷口疼痛，病程較長(zhǎng)，容易形成肛瘺，給患者帶來(lái)巨大的困擾和壓力[3-4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程存在一個(gè)極其復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，涉及組織、細(xì)胞、分子、基因等多個(gè)層面，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的失控將會(huì)導(dǎo)致自身調(diào)節(jié)的紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-8（IL-8）、前列腺素E2（PGE2）對(duì)術(shù)后創(chuàng)面炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）是目前公認(rèn)的與創(chuàng)傷愈合關(guān)系密切的細(xì)胞因子[5]。但其促進(jìn)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的效果及作用機(jī)制是否與EGF-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路相關(guān)尚不明確。在長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用中，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)復(fù)方沙棘籽油對(duì)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面有其獨(dú)特的療效，可促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)，效果顯著，但其具體作用機(jī)制目前還沒(méi)明確。本研究通過(guò)建立肛周膿腫大鼠術(shù)后創(chuàng)面模型，探討復(fù)方沙棘籽油促進(jìn)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的效果及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 65 只SD 大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，在SPF 條件下飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要的藥品及試劑 沙棘籽油（甘肅省格瑞斯生物科技有限公司），冰片（浙江華東醫(yī)藥有限公司），EGF、磷酸化ERK1/2 抗體、過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗及即用型SABC 免疫組化試劑盒（中國(guó)武漢博士德公司）；檢測(cè)試劑：抗EGF 抗體（ab217366），抗ERK1+ERK2 抗體（ab17942）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)方沙棘籽油納米乳化液制備 低劑量組制備方法：取冰片2.5 g，研細(xì)，加入沙棘籽油10 g，攪拌使溶解，再加入乳化劑16 g，攪勻，再加入蒸餾水，邊加邊攪拌，直至變成黏稠凝膠狀，繼續(xù)加入蒸餾水，使之呈透明或半透明狀，并帶淡藍(lán)色乳光，最后加蒸餾水至1 000 mL，攪勻，濾過(guò)，灌封，于115.5℃滅菌30 min。高劑量組制備方法同上，最后加蒸餾水稀釋至500 mL。中劑量組介于二者之間。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立 常規(guī)用碘伏消毒大鼠肛周皮膚，將75%冰醋酸0.05 mL 注射于大鼠肛門(mén)外周皮下，24 h 后肛門(mén)局部形成潰瘍，伴有紅腫、炎性滲出。參照局部癥狀四級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（表1）進(jìn)行評(píng)分，4 分以下的大鼠剔出實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物模型的建立共選取65 只SD 大鼠進(jìn)行造模，實(shí)驗(yàn)結(jié)束按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，總分值在4 分以上的大鼠共53 只，為保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中干預(yù)措施的均衡性，最終選取50 只模型SD 大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 將50 只模型大鼠稱重后隨機(jī)分為5 組。從造模后第1 天開(kāi)始，各組涂抹相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)藥物，2 次/d，兩次用藥間隔4 h，連續(xù)14 d。按大鼠與人的體表面積換算關(guān)系及中藥藥理劑量設(shè)計(jì)1∶2∶4 的方法換算大鼠用藥劑量，見(jiàn)表2。

表2 各組給藥情況

1.4 觀察指標(biāo) 1）創(chuàng)面愈合率：每天觀察創(chuàng)面愈合情況，于術(shù)后5、8、14 d 采用透明膠片描記測(cè)定局部創(chuàng)面面積，評(píng)價(jià)記錄各組創(chuàng)面動(dòng)態(tài)愈合率。2）術(shù)后14 d 創(chuàng)面EGF、ERK1/2 表達(dá)情況：應(yīng)用免疫組化S-P 法、通過(guò)MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)分析EGF、ERK1/2 表達(dá)情況。3）術(shù)后14 d 創(chuàng)面IL-8、PGE2 表達(dá)情況：應(yīng)用上述同樣的方法檢測(cè)各組創(chuàng)面磷酸化IL-8、PGE2 表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，正態(tài)分布計(jì)量資料用±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合率 創(chuàng)面處理后5、8、14 d，5 組大鼠的創(chuàng)面愈合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中5 組大鼠創(chuàng)面愈合率由低到高為G1 組＜G2 組＜G3 組＜G4 組＜G5 組，見(jiàn)表3。

表3 5 組大鼠的創(chuàng)面愈合率比較

2.2 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織學(xué)變化 HE染色結(jié)果提示: 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織表皮生長(zhǎng)狀態(tài)隨時(shí)間逐步改善，表皮厚度逐漸增加;同一時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組表皮生長(zhǎng)狀態(tài)最差，表皮厚度最薄; 復(fù)方沙棘籽油組術(shù)后創(chuàng)面組織表皮厚度明顯增加，表皮組織形態(tài)明顯完善，而復(fù)方沙棘籽油高劑量組更甚。術(shù)后5、8、14 d，5 組大鼠創(chuàng)面組織HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后14 d 創(chuàng)面組織中IL-8及PEG2 表達(dá)水平的比較 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后14 d 創(chuàng)面IL-8 及PEG2 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中，大鼠創(chuàng)面IL-8 表達(dá)G2組＜G5 組＜G4 組＜G3 組＜G1 組（P＜0.05）；PEG2 表達(dá)G5 組＜G2 組＜G4 組＜G3 組＜G1 組（P＜0.05）,見(jiàn)表4，圖2、3。

圖2 5 組大鼠術(shù)后14d 創(chuàng)面組織IL-8 免疫組化表達(dá)（×100）

圖3 5 組大鼠術(shù)后14d 創(chuàng)面組織PEG2 免疫組化表達(dá)（×100）

表4 5 組大鼠肛膿腫術(shù)后14 d 創(chuàng)面組織IL-8及PEG2 表達(dá)水平比較

2.4 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后14 d 創(chuàng)面組織EGF 及ERK1/2 表達(dá)水平的比較 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后14 d 創(chuàng)面EGF 及ERK1/2 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中，大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面EGF 及ERK1/2 表達(dá)水平G5 組> G4 組> G3 組>G2 組> G1 組（均P＜0.05），見(jiàn)表5，圖4、5。

圖4 5 組大鼠術(shù)后14d 創(chuàng)面組織EGF 免疫組化表達(dá)（×100）

圖5 5 組大鼠術(shù)后14d 創(chuàng)面組織ERK1/2 免疫組化表達(dá)（×100）

表5 5 組大鼠肛周膿腫術(shù)后14 d 創(chuàng)面組織EGF 及ERK1/2 表達(dá)水平比較

3 討論

肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面恢復(fù)緩慢、傷口疼痛，病程長(zhǎng)。如何加速術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)及減輕痛苦是臨床醫(yī)師最需要解決的難題[6-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究多側(cè)重于新型高科技抗菌輔料、創(chuàng)面生長(zhǎng)因子等，從生物細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域?qū)で髣?chuàng)面修復(fù)的突破[8-10]。同時(shí)運(yùn)用外敷藥物改善局部微循環(huán)并發(fā)揮抗菌抗炎作用，以達(dá)到術(shù)后創(chuàng)面愈合的目的[11-12]。但新型輔料在促進(jìn)創(chuàng)面愈合及抗炎作用同時(shí)并不能減輕傷口疼痛，而創(chuàng)面生長(zhǎng)因子也不具備抗炎及減輕疼痛的功效，因此尋求一種藥物來(lái)促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)，同時(shí)減輕疼痛，提高愈合質(zhì)量，成為臨床醫(yī)生及患者共同關(guān)注的問(wèn)題。多項(xiàng)研究表明沙棘籽油含有豐富的維生素A、維生素E、氨基酸、黃酮、多酚等抗氧化成分，為組織重建提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)具有明顯的生物活性作用，其抗感染能力強(qiáng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合快[13-14]。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)冰片有散血止痛功效，能夠改善術(shù)后疼痛及精神緊張焦慮導(dǎo)致的肛門(mén)括約肌痙攣。因此，本研究將兩種藥物組合成復(fù)方沙棘籽油，并通過(guò)納米乳化技術(shù)，提高藥物滲透、增大藥物透皮速率和透皮量，維持恒定血藥濃度。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方沙棘籽油納米乳化液治療組術(shù)后創(chuàng)面愈合率高于其余各組，提示復(fù)方沙棘籽油對(duì)術(shù)后創(chuàng)面愈合具有促進(jìn)作用。免疫組化結(jié)果顯示，復(fù)方沙棘籽油納米乳化液治療組大鼠創(chuàng)面組織中表皮生長(zhǎng)速率均優(yōu)于其他組，表明復(fù)方沙棘籽油有助于術(shù)后創(chuàng)面生長(zhǎng)及愈合[15]。

IL-8 可通過(guò)結(jié)合趨化因子受體IL-8 受體α 和IL-8 受體β 對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[16-17]。PGE2 是重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)因子，也是重要的疼痛遞質(zhì)，主要作用是擴(kuò)張血管，同時(shí)具有免疫抑制和抗炎作用[18-19]。本研究顯示：5 組大鼠術(shù)后14 d 創(chuàng)面IL-8 及PEG2 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明其可能通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)釋放而改善創(chuàng)面疼痛。同時(shí)，EGF 是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的主要影響因素之一，對(duì)多種組織來(lái)源的上皮細(xì)胞有很強(qiáng)的促分裂活性，可促進(jìn)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞遷移[20-21]。EGF 還可促進(jìn)肉芽組織形成，增加肉芽組織中DNA、RNA、蛋白質(zhì)及膠原合成，可促進(jìn)血管形成及上皮再生，對(duì)皮膚損傷有較好的促愈合作用，是一類對(duì)創(chuàng)面修復(fù)有重要調(diào)控作用的多功能細(xì)胞因子。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族的一員，它的信號(hào)傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心，ERK 與EGF 在組織修復(fù)中的作用密切相關(guān)[22]。本研究顯示：5 組大鼠術(shù)后14 d 創(chuàng)面EGF 及ERK1/2 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，G5、G4、G3、G2、G1 組大鼠術(shù)后創(chuàng)面EGF 及ERK1/2 表達(dá)水平依次降低（均P<0.05），說(shuō)明復(fù)方沙棘籽油納米乳化液具有加速肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)作用，其可以通過(guò)促進(jìn)創(chuàng)面EGF 的表達(dá)→EGF 激活MAPK 途徑→ERK 磷酸化→ERK 通路被激活→促進(jìn)創(chuàng)面角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化→促進(jìn)創(chuàng)面愈合，此通路通過(guò)介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖與遷移活動(dòng)促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，最終可導(dǎo)致迅速上皮化從而使創(chuàng)面愈合[23]。

綜上所述，復(fù)方沙棘籽油納米乳化液可能通過(guò)IL-8 及PEG2 抑制炎癥介質(zhì)釋放，通過(guò)EGF-ERK通路的調(diào)控達(dá)到促進(jìn)患者術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)的作用，這表明復(fù)方沙棘籽油納米乳化液對(duì)肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面具有潛在的治療價(jià)值。