• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-138-5p通過調(diào)控自噬影響乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬耐藥性的體外研究

    2023-10-18 07:14:14姚浩明
    中國臨床新醫(yī)學(xué) 2023年9期
    關(guān)鍵詞:抑制率耐藥性耐藥

    姚浩明, 李 英

    乳腺癌是影響婦女生命健康的最常見癌癥之一,在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率日益升高[1]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,乳腺癌治療已取得較大進(jìn)步,臨床對乳腺癌通常采用手術(shù)切除、放療、化療及藥物輔助治療等方法[2-3]。他莫昔芬(tamoxifen,TAM)是臨床治療乳腺癌的常用化療藥物,但多數(shù)患者在化療幾周后即出現(xiàn)耐藥,成為乳腺癌治療的主要障礙。因此,了解乳腺癌細(xì)胞對TAM耐藥的機(jī)制,探索降低機(jī)體耐藥性的方法是目前治療乳腺癌亟需解決的問題之一。微小RNA(micro ribonucleic acids,miRNAs)是動植物中廣泛存在的一類非編碼RNA,通過靶向mRNA降解或翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)[4]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、自噬等具有抑制作用[5]。然而,目前關(guān)于miR-138-5p對乳腺癌細(xì)胞TAM耐藥性影響的研究較少。本研究旨在探討miR-138-5p對乳腺癌細(xì)胞TAM耐藥性的影響及其機(jī)制,為改善乳腺癌患者治療預(yù)后提供參考。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和主要試劑 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自上海信裕生物科技有限公司。TAM耐藥MCF-7細(xì)胞株MCF-7/TAM由美國弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科岳微教授惠贈,已用1×10-7mol/L TAM維持耐藥1年。Trizol購自美國Sigma公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司;細(xì)胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)購自上海源葉生物科技有限公司。miR-138-5p mimics慢病毒、miR-138-5p NC慢病毒空載體由上海吉?jiǎng)P基因有限公司設(shè)計(jì)并合成。聚凝胺(polybrene)慢病毒轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物科技有限公司;兔抗人Beclin-1多克隆抗體、兔抗人LC3Ⅱ多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.2主要儀器 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司);128C酶標(biāo)儀(奧地利CliniBio公司);PowerPac Universal通用型電泳儀(美國Bio-Rad公司);Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司);DM4B熒光顯微鏡(德國徠卡公司)。

    1.3實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7和MCF-7/TAM細(xì)胞分別接種于無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶(含非必需氨基酸、10 μg/ml胰島素、10%胎牛血清、1%青/鏈霉素)中,培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2,每3 d換液,并觀察細(xì)胞形態(tài),待細(xì)胞融合率達(dá)80%~90%時(shí),收集細(xì)胞備用。

    1.3.2 分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期MCF-7、MCF-7/TAM細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml,以200 μl/孔接種于24孔板。設(shè)置正常對照組(MCF-7細(xì)胞)、耐藥對照組(MCF-7/TAM細(xì)胞)、LV-NC組(MCF-7/TAM細(xì)胞+miR-138-5p NC慢病毒空載體)和LV-miR-138-5p mimics組(MCF-7/TAM細(xì)胞+miR-138-5p mimics慢病毒)。慢病毒感染復(fù)數(shù)=30,培養(yǎng)12 h后更換完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h后向細(xì)胞中加入終濃度為2 μg/ml的嘌呤霉素篩選48 h。收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取方法1.3.2中獲取的細(xì)胞,每組均給予100 μl/孔終濃度為1×10-7mol/L的TAM進(jìn)行處理,在孵育24 h、48 h、72 h后分別加入MTT溶液20 μl,孵育4 h后依次加入DMSO 150 μl,10 min后使用酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔的OD值,計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=(對照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

    1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測miR-138-5p相對表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒及PCR儀進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系:10 μl SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)、0.8 μl正向引物、0.8 μl反向引物、2 μl cDNA(200 ng/μl)和6.4 μl ddH2O。所用引物序列見表1。反應(yīng)條件:95 ℃,30 s(預(yù)變性);95 ℃,5 s(變性),55 ℃,10 s(退火),72 ℃,15 s(延伸),共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計(jì)算miR-138-5p的相對表達(dá)量。

    表1 引物序列

    1.3.5 MDC染色法檢測各組細(xì)胞自噬小體數(shù)量 取各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min,然后接種至6孔板(1×106cells/ml)中。24 h后,棄去培養(yǎng)液,用1×Wash Buffer洗滌細(xì)胞2次,加入MDC染色液(100 μl/孔)室溫避光染色40 min,棄去染色液,用1×Wash Buffer洗滌細(xì)胞3次,加入封片劑以防熒光淬滅,最后在熒光顯微鏡下觀察并記錄自噬小體數(shù)量。

    1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 收集各組細(xì)胞用HEPES緩沖鹽溶液(pH=7.5)洗滌2次,然后用70%冰冷乙醇在4 ℃下固定細(xì)胞30 min。將細(xì)胞重新懸浮在結(jié)合緩沖液中,向細(xì)胞中加入5 μl Annexin V-FITC染色15 min,然后在室溫下避光,用5 μl PI(50 μg/ml)染色10 min,每管加入400 μl結(jié)合緩沖液。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

    1.3.7 Western blot法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞采用RIPA裂解液(含PMSF)提取總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度后,取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。將膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h后,用相應(yīng)的一抗Beclin-1(1∶500)、LC3Ⅱ(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日,洗去一抗,用HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)再孵育1 h,然后使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1四組細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)水平比較 耐藥對照組、LV-NC組miR-138-5p表達(dá)水平低于正常對照組,LV-miR-138-5p mimics組miR-138-5p表達(dá)水平高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    注:F=37.753,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖1 四組細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)水平比較圖

    2.2四組細(xì)胞增殖抑制率比較 耐藥對照組和LV-NC組增殖抑制率較正常對照組降低,LV-miR-138-5p mimics組抑制率較耐藥對照組、LV-NC組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LV-miR-138-5p mimics組抑制率與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

    注:各時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率比較:24 h:F=81.647,P<0.001;48 h:F=50.181,P<0.001;72 h:F=45.523,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖2 四組細(xì)胞增殖抑制率比較圖

    2.3四組細(xì)胞凋亡率比較 與正常對照組相比,耐藥對照組、LV-NC組細(xì)胞凋亡率降低,LV-miR-138-5p mimics組細(xì)胞凋亡率高于耐藥對照組、LV-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LV-miR-138-5p mimics組細(xì)胞凋亡率與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

    注:F=124.702,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖3 四組細(xì)胞凋亡率比較圖

    2.4四組細(xì)胞自噬小體數(shù)目比較 與正常對照組相比,耐藥對照組、LV-NC組、LV-miR-138-5p mimics組細(xì)胞中自噬小體數(shù)目顯著增多(P<0.05);LV-miR-138-5p mimics組自噬小體數(shù)目少于耐藥對照組、LV-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

    注:F=245.336,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖4 四組細(xì)胞自噬小體數(shù)目比較圖

    2.5四組細(xì)胞Beclin-1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與正常對照組相比,耐藥對照組、LV-NC組、LV-miR-138-5p mimics組LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LV-miR-138-5p mimics組LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)水平低于耐藥對照組和LV-NC組,Bcl-2表達(dá)水平高于耐藥對照組和LV-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

    注:四組LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量比較,F=129.214,P<0.001;四組Beclin-1蛋白相對表達(dá)量比較,F=140.340,P<0.001;四組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較,F=23.346,P<0.001;與正常對照組比較,*P<0.05;與耐藥對照組比較,#P<0.05;與LV-NC組比較,△P<0.05圖5 四組細(xì)胞Beclin-1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較圖

    3 討論

    3.1乳腺癌細(xì)胞耐藥性是影響治療效果的主要因素,也是乳腺癌治療過程中有待解決的難題[6]。TAM是臨床常用化療藥,在治療乳腺癌中具有較好的療效,且副作用相對較少。然而,乳腺癌細(xì)胞對TAM易產(chǎn)生耐藥性,嚴(yán)重影響療效。因此,研究乳腺癌細(xì)胞對TAM耐藥機(jī)制對提高療效具有重要意義。

    3.2miRNAs可通過與互補(bǔ)的靶基因mRNAs結(jié)合,導(dǎo)致mRNAs翻譯抑制或降解,在細(xì)胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用[7]。有不少研究表明,miRNAs功能失調(diào)與肺癌[8]、結(jié)腸癌[9]等疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-138-5p可通過抑制肺癌中Smad核相互作用蛋白1(Smad nuclear interacting protein 1,SNIP1)的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖與遷移[10]。在結(jié)直腸癌中,miR-138-5p呈低表達(dá),過表達(dá)miR-138-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,提示其具有應(yīng)用于結(jié)直腸癌診斷的前景[11-12]。此外,miR-138-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低,上調(diào)miR-138-5p表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力[5]。本研究結(jié)果顯示,耐藥對照組細(xì)胞miR-138-5p相對表達(dá)水平顯著降低。Yu等[13]研究表明,miR-138-5p可抑制胰腺癌惡性進(jìn)展,并增加其化療敏感性。Tang等[14]研究表明,miR-138在吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低,上調(diào)miR-138表達(dá)可增加肺癌細(xì)胞對吉非替尼敏感性,顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-138-5p能提高耐藥細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率,提示過表達(dá)miR-138-5p可增加MCF-7/TAM細(xì)胞對TAM敏感性。

    3.3自噬是指在饑餓、缺氧及能量應(yīng)激狀態(tài)下,細(xì)胞通過膜結(jié)構(gòu)降解胞質(zhì)細(xì)胞器和生物大分子的動態(tài)過程,可清除已受損或功能異常的細(xì)胞器,對機(jī)體穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)控,在營養(yǎng)和能量缺乏、細(xì)胞衰老、蛋白質(zhì)變性等多種病理、生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。自噬對腫瘤細(xì)胞的作用具有兩面性:在腫瘤發(fā)生早期,自噬可通過清除線粒體中活性氧產(chǎn)生非正常折疊蛋白,發(fā)揮抗腫瘤作用[16];對于成熟腫瘤細(xì)胞,自噬可對受損蛋白降解重新利用,為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和能量,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長,同時(shí),抗腫瘤藥會引起細(xì)胞損傷,而自噬可清除損傷的細(xì)胞器,從而降低腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性,增強(qiáng)腫瘤耐藥[17]。自噬泡膜的延伸由LC3-Ⅰ介導(dǎo),正常狀態(tài)下,LC3-Ⅰ存在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),當(dāng)發(fā)生自噬時(shí),LC3-Ⅰ經(jīng)過泛素樣蛋白系統(tǒng)加工修飾,與磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成LC3-Ⅱ,參與自噬體形成,LC3-Ⅱ蛋白為自噬體形成的標(biāo)志性蛋白[18]。Beclin-1在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中低表達(dá),其不僅是一種抑癌基因,而且還是自噬相關(guān)基因。Beclin-1通過與不同的分子結(jié)合,介導(dǎo)自噬與凋亡途徑發(fā)生[19]。Bcl-2在細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用,是一種抑制凋亡蛋白,可與Beclin-1結(jié)合,抑制Beclin-1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬功能[20]。研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p過表達(dá)可通過靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)抑制胰腺癌細(xì)胞自噬作用[21]。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-138-5p能夠明顯減少自噬小體數(shù)目,降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平,提高Bcl-2蛋白表達(dá)水平,抑制MCF-7/TAM細(xì)胞中自噬作用。

    綜上所述,過表達(dá)miR-138-5p可抑制MCF-7/TAM細(xì)胞自噬作用,提高細(xì)胞對TAM敏感性,降低耐藥性,可能為臨床改善乳腺癌TAM耐藥性提供新思路。但本研究未能對miR-138-5p抑制自噬的具體機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。后期將對miR-138-5p的靶基因進(jìn)行篩選、驗(yàn)證,以明確其調(diào)控MCF-7/TAM細(xì)胞自噬作用的具體機(jī)制。

    猜你喜歡
    抑制率耐藥性耐藥
    中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    如何判斷靶向治療耐藥
    miR-181a在卵巢癌細(xì)胞中對順鉑的耐藥作用
    血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    長絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機(jī)升級,普及耐藥性檢測意義重大
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    PDCA循環(huán)法在多重耐藥菌感染監(jiān)控中的應(yīng)用
    27株多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥譜和ERIC-PCR分型
    91久久精品国产一区二区三区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产视频内射| 久久久久久久大尺度免费视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产综合懂色| 亚洲av福利一区| 欧美97在线视频| 久久久久久久久久久免费av| 色哟哟·www| 麻豆成人av视频| 欧美成人a在线观看| 久久热精品热| 啦啦啦韩国在线观看视频| 麻豆成人午夜福利视频| 水蜜桃什么品种好| 欧美潮喷喷水| ponron亚洲| 最近最新中文字幕免费大全7| 天美传媒精品一区二区| 国产69精品久久久久777片| 青春草视频在线免费观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 男人舔奶头视频| 久久久久久久久大av| 国产黄片视频在线免费观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费av毛片视频| 久久99热这里只频精品6学生| 51国产日韩欧美| 国产成人a区在线观看| www.av在线官网国产| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲内射少妇av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 中文字幕制服av| 欧美+日韩+精品| 亚洲av二区三区四区| 亚洲不卡免费看| 成人漫画全彩无遮挡| 免费看光身美女| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜福利在线在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 特级一级黄色大片| 国模一区二区三区四区视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲精品第二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 深爱激情五月婷婷| 久久久久久久午夜电影| 午夜激情久久久久久久| 777米奇影视久久| 精品一区二区免费观看| 国产不卡一卡二| 日本午夜av视频| 黄片无遮挡物在线观看| 免费观看a级毛片全部| av免费观看日本| 国产精品福利在线免费观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产老妇伦熟女老妇高清| 高清毛片免费看| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 色网站视频免费| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲美女视频黄频| 免费av不卡在线播放| 久久久久久久国产电影| 成人午夜高清在线视频| 欧美bdsm另类| 看十八女毛片水多多多| 精品一区二区三卡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日本免费a在线| 久久精品久久久久久久性| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产一区二区三区av在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 在线a可以看的网站| 又大又黄又爽视频免费| 午夜免费激情av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 我的老师免费观看完整版| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产又色又爽无遮挡免| 午夜日本视频在线| 有码 亚洲区| 97精品久久久久久久久久精品| 波多野结衣巨乳人妻| 国产黄色免费在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 午夜福利成人在线免费观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 日本免费a在线| av卡一久久| 丝袜美腿在线中文| 男女下面进入的视频免费午夜| av福利片在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 能在线免费看毛片的网站| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产成人精品福利久久| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品久久久久久久电影| 成年版毛片免费区| 22中文网久久字幕| 嫩草影院精品99| a级毛色黄片| 国产午夜精品论理片| 国产真实伦视频高清在线观看| 观看美女的网站| 99久国产av精品| 女人久久www免费人成看片| 亚洲综合色惰| 春色校园在线视频观看| 少妇的逼水好多| 国产极品天堂在线| 午夜福利视频精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久亚洲精品成人影院| 精品一区在线观看国产| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品.久久久| 精品一区二区免费观看| 成人av在线播放网站| 联通29元200g的流量卡| 午夜福利高清视频| 看非洲黑人一级黄片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 听说在线观看完整版免费高清| 看十八女毛片水多多多| 中文字幕久久专区| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美变态另类bdsm刘玥| 在线观看一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久久久久久成人| 成人国产麻豆网| 午夜福利视频1000在线观看| 国产成人一区二区在线| 日韩伦理黄色片| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| av在线观看视频网站免费| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产av不卡久久| 成年免费大片在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 色哟哟·www| 婷婷色av中文字幕| 日本免费在线观看一区| 亚洲欧洲日产国产| 中文字幕制服av| 全区人妻精品视频| 色吧在线观看| 久久久国产一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 丰满乱子伦码专区| 最后的刺客免费高清国语| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产一区二区三区综合在线观看 | 日韩av免费高清视频| 最后的刺客免费高清国语| 久久精品久久久久久久性| 久久国内精品自在自线图片| 一级av片app| av女优亚洲男人天堂| 午夜影院在线不卡| 成人亚洲欧美一区二区av| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品,欧美精品| h视频一区二区三区| 蜜桃国产av成人99| 亚洲美女搞黄在线观看| 18禁观看日本| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩三级伦理在线观看| 超碰97精品在线观看| 青青草视频在线视频观看| 成年av动漫网址| 中文天堂在线官网| 激情五月婷婷亚洲| 久久久久久久大尺度免费视频| 天堂中文最新版在线下载| 国产高清国产精品国产三级| 少妇精品久久久久久久| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲欧美清纯卡通| 国产又色又爽无遮挡免| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品二区激情视频| 少妇人妻 视频| 丰满少妇做爰视频| 免费在线观看完整版高清| 精品国产一区二区久久| 老司机影院成人| 午夜福利,免费看| 国产一区二区在线观看av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 一级片'在线观看视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人毛片60女人毛片免费| 免费观看性生交大片5| 日本欧美视频一区| av免费观看日本| 久久国内精品自在自线图片| 国产毛片在线视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 国产激情久久老熟女| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久国产精品大桥未久av| 国产一区二区激情短视频 | 国产成人精品久久久久久| 国产精品国产三级专区第一集| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产1区2区3区精品| 九色亚洲精品在线播放| videos熟女内射| 永久网站在线| 国产激情久久老熟女| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲综合色惰| 国产精品久久久久成人av| 成年av动漫网址| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲av成人精品一二三区| av在线播放精品| 999久久久国产精品视频| 精品酒店卫生间| 日本av免费视频播放| 人人澡人人妻人| 中文字幕av电影在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 五月开心婷婷网| 亚洲av中文av极速乱| 色哟哟·www| 欧美日韩精品网址| 日韩在线高清观看一区二区三区| 男人操女人黄网站| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲av电影在线进入| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 中文字幕av电影在线播放| 婷婷色av中文字幕| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 十分钟在线观看高清视频www| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品日本国产第一区| 一区福利在线观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 男女边摸边吃奶| 又大又黄又爽视频免费| 欧美精品av麻豆av| 9热在线视频观看99| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲男人天堂网一区| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产激情久久老熟女| 国产精品久久久久成人av| 老汉色∧v一级毛片| 精品一品国产午夜福利视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| av.在线天堂| 色婷婷av一区二区三区视频| 99久国产av精品国产电影| 精品一区二区三卡| 国产毛片在线视频| 久久99精品国语久久久| 午夜激情久久久久久久| 一级毛片我不卡| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产野战对白在线观看| 99国产综合亚洲精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久久久人妻精品一区果冻| 日本欧美国产在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 久久鲁丝午夜福利片| 大香蕉久久成人网| 久久久久视频综合| 卡戴珊不雅视频在线播放| 蜜桃国产av成人99| 久久久久国产网址| av福利片在线| av国产精品久久久久影院| 黄网站色视频无遮挡免费观看| videos熟女内射| 大陆偷拍与自拍| 桃花免费在线播放| av卡一久久| 婷婷成人精品国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久亚洲国产成人精品v| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一级片'在线观看视频| 天美传媒精品一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 999精品在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲中文av在线| 99热国产这里只有精品6| 日日爽夜夜爽网站| 久久久精品区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 2022亚洲国产成人精品| 两个人看的免费小视频| 久久久精品区二区三区| 欧美+日韩+精品| 成人毛片60女人毛片免费| 日本wwww免费看| 两个人看的免费小视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 大片电影免费在线观看免费| 久久人人爽人人片av| a级片在线免费高清观看视频| 永久网站在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| av天堂久久9| 男人爽女人下面视频在线观看| 乱人伦中国视频| kizo精华| 精品国产乱码久久久久久男人| 这个男人来自地球电影免费观看 | 久久99蜜桃精品久久| 高清欧美精品videossex| 人妻 亚洲 视频| 国产 一区精品| 一本久久精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 性少妇av在线| 久久人人97超碰香蕉20202| 青草久久国产| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品久久久久久精品电影小说| 免费观看在线日韩| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99国产综合亚洲精品| 午夜福利视频精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 咕卡用的链子| 国产男女超爽视频在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 波野结衣二区三区在线| 精品少妇内射三级| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久久久久免费av| 一区二区三区乱码不卡18| 夫妻性生交免费视频一级片| 咕卡用的链子| 香蕉丝袜av| 99九九在线精品视频| 亚洲人成77777在线视频| 热re99久久国产66热| 伦理电影大哥的女人| 看免费av毛片| 看十八女毛片水多多多| 性色avwww在线观看| 国产成人精品在线电影| 国产精品久久久久久av不卡| 色94色欧美一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美激情极品国产一区二区三区| av在线播放精品| 看免费成人av毛片| 亚洲国产欧美网| 国产成人精品福利久久| 亚洲成人手机| 人体艺术视频欧美日本| 日韩欧美精品免费久久| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品国产av成人精品| 国产成人精品福利久久| 一区二区三区四区激情视频| 色网站视频免费| 大片免费播放器 马上看| 久久精品人人爽人人爽视色| 99久久综合免费| 女人久久www免费人成看片| 毛片一级片免费看久久久久| 国产有黄有色有爽视频| 高清欧美精品videossex| 日本-黄色视频高清免费观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美日韩精品网址| 麻豆av在线久日| 午夜激情av网站| 永久免费av网站大全| 久久久久网色| freevideosex欧美| 美女视频免费永久观看网站| 精品一区二区免费观看| 男女午夜视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产午夜精品一二区理论片| 综合色丁香网| 美女高潮到喷水免费观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产高清不卡午夜福利| 高清欧美精品videossex| 久久99一区二区三区| a 毛片基地| freevideosex欧美| 飞空精品影院首页| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩av免费高清视频| 久久久欧美国产精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲精品美女久久av网站| 免费观看性生交大片5| 精品酒店卫生间| 丝袜美足系列| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久亚洲精品成人影院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲第一av免费看| 国产人伦9x9x在线观看 | 午夜91福利影院| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 老司机亚洲免费影院| 男女免费视频国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久人人97超碰香蕉20202| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美97在线视频| 国产视频首页在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 咕卡用的链子| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 99热全是精品| 最黄视频免费看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 一级片'在线观看视频| 赤兔流量卡办理| 黄片播放在线免费| 90打野战视频偷拍视频| 美女国产高潮福利片在线看| 一区二区三区精品91| 欧美成人精品欧美一级黄| 日本wwww免费看| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品三级大全| 伦精品一区二区三区| av国产久精品久网站免费入址| 免费观看av网站的网址| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 少妇 在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 中国国产av一级| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美+日韩+精品| 精品久久蜜臀av无| 伊人久久国产一区二区| 亚洲人成电影观看| 人妻人人澡人人爽人人| a级片在线免费高清观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产综合精华液| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| av在线观看视频网站免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 纯流量卡能插随身wifi吗| 电影成人av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 在线观看国产h片| 伦精品一区二区三区| 我的亚洲天堂| 美女高潮到喷水免费观看| 日韩欧美精品免费久久| 免费观看在线日韩| 黄色视频在线播放观看不卡| 男女边摸边吃奶| 三级国产精品片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 日韩一区二区三区影片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 丁香六月天网| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 永久免费av网站大全| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99精国产麻豆久久婷婷| 男男h啪啪无遮挡| 国产熟女欧美一区二区| 精品久久久精品久久久| 亚洲精品一二三| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲av在线观看美女高潮| 男人操女人黄网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 在线观看人妻少妇| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 免费黄色在线免费观看| 在线看a的网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久青草综合色| 欧美+日韩+精品| 国产成人av激情在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 美女视频免费永久观看网站| 国产极品天堂在线| 水蜜桃什么品种好| 日韩一本色道免费dvd| 久久精品夜色国产| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 免费观看在线日韩| 中文字幕av电影在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久国产一区二区| 国产精品国产av在线观看| 在线观看三级黄色| 丁香六月天网| 一级毛片 在线播放| 久久久久久人妻| 七月丁香在线播放| 国产又爽黄色视频| 一本色道久久久久久精品综合| 国产在线一区二区三区精| 色婷婷av一区二区三区视频| 新久久久久国产一级毛片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线观看免费视频网站a站| 一区二区三区四区激情视频| 久久免费观看电影| 男女午夜视频在线观看| 我的亚洲天堂| 欧美精品一区二区大全| 国产在线一区二区三区精| 9色porny在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美国产精品一级二级三级| 99精国产麻豆久久婷婷| 成人二区视频| 亚洲欧洲日产国产| 最近中文字幕2019免费版| 成人二区视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲成人av在线免费| 亚洲成人一二三区av| 国产精品免费大片| 99精国产麻豆久久婷婷| 丝袜在线中文字幕| 欧美少妇被猛烈插入视频| 香蕉丝袜av| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产视频首页在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品一区二区在线不卡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 少妇人妻精品综合一区二区| 观看av在线不卡| 97在线人人人人妻| 久久久久久伊人网av| 国产日韩欧美在线精品| 9色porny在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久久久久人人人人人人| www日本在线高清视频| 欧美精品一区二区免费开放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产成人91sexporn| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美国产精品一级二级三级|