甘薯葉片綠原酸及其抗氧化活性的基因型差異

羅青青,陳培濤，宗繼錯(cuò)，傅玉凡，趙騰飛,徐元江,高紀(jì)龍,秦瑞華

1. 西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；2. 重慶市中藥研究院，重慶 400065

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]種植于世界上熱帶和亞熱帶地區(qū)的100多個(gè)國(guó)家, 是世界上最重要的糧食作物之一[1]． 已有研究表明甘薯莖葉中富含蛋白質(zhì)、 多酚、 黃酮、 花青素、 多糖和一些多功能營(yíng)養(yǎng)素[2-3], 有益于人體健康, 如抗癌、 保肝、 抑菌、 抗艾滋病病毒和提高人體免疫力、 預(yù)防糖尿病和心血管病等[4-5]． 甘薯種植主要收獲對(duì)象是塊根, 只有很少部分莖葉用于牲畜飼用和人類(lèi)食用, 絕大多數(shù)被丟棄, 造成了極大的資源浪費(fèi)[6]．

酚類(lèi)物質(zhì)是廣泛存在于植物中的膳食抗氧化劑, 甘薯葉中多酚化合物主要是綠原酸及其衍生物[7]． 綠原酸(Chlorogenic acid, CGA)是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎寧酸(Quinicacid)生成的縮酚酸, 是植物體內(nèi)有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物, 具有多種生物活性[8-9], 如抗氧化作用、 清除自由基、 抑菌作用、 抗病毒作用、 調(diào)節(jié)糖脂代謝、 免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用等[10-14]． 在甘薯葉中至少包括6種咖啡?？鼘幩嵫苌? 分別為單咖啡酰奎寧酸(CQA)的3種異構(gòu)體: 綠原酸(3-CQA)、 隱綠原酸(4-CQA)和新綠原酸(5-CQA), 以及3種二咖啡酰奎寧酸: 異綠原酸A(3,5-diCQA)、 異綠原酸B(3,4-diCQA)和異綠原酸C(4,5-diCQA)． 甘薯CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要取決于遺傳特性, 除此之外, 生育期對(duì)甘薯葉片中酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有較大的影響, 同一基因型葉片中的CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于塊根[15-17]．

甘薯莖葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力, 其抗氧化能力與莖葉中的CGA、 黃芪素和矢車(chē)菊素類(lèi)化合物相關(guān), 其中與CGA及其衍生物的相關(guān)性最高[16,18-19]． 如Xu等[20]通過(guò)對(duì)蒲薯53葉提取物進(jìn)行成分與抗氧化活性分析, 表明提取物抗氧化活性的主要生物活性化合物是多酚類(lèi), 尤其是CQA衍生物．

目前對(duì)于甘薯CGA的研究主要存在供試材料偏少的問(wèn)題, 且大多研究薯塊, 對(duì)于較多基因型間CGA組分分析更為少見(jiàn)． 因此, 本研究通過(guò)高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)對(duì)50個(gè)甘薯基因型葉片中CGA組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析, 以期為甘薯高綠原酸、 高抗氧化活性種質(zhì)資源的篩選及功能莖葉品種的選育、 甘薯莖葉營(yíng)養(yǎng)功能食品的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的50個(gè)甘薯基因型來(lái)自西南大學(xué)重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心合川農(nóng)場(chǎng)育種基地的育成品種或育成品系比較實(shí)驗(yàn)． 供試基因型的編號(hào)、 名稱(chēng)見(jiàn)表1．

表1 50個(gè)供試甘薯基因型的編號(hào)、 名稱(chēng)

1.2 方法

1.2.1 取樣及樣品的制備

供試材料大田移栽100 d時(shí), 取甘薯藤蔓自上而下第3～10片新鮮無(wú)病斑、 無(wú)腐爛的健康葉片, 用流水輕輕洗凈泥沙雜質(zhì)后, 自然晾干多余水分, 葉片于105 ℃殺青后, 60 ℃烘干至恒質(zhì)量, 粉碎, 過(guò)100目篩, -20 ℃密封保存?zhèn)溆茫?/p>

參照Z(yǔ)hang等[21]描述的方法, 略作修改． 精確稱(chēng)取甘薯葉粉末0.05 g, 按料液比1∶100(g/mL)與70%乙醇混合, 于60 ℃下超聲提取1 h, 提取2次, 每次的提取液4 000 r/min離心40 min, 合并上清液, 經(jīng)0.22 μm醋酸纖維膜過(guò)濾, 濾液用于CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與組分測(cè)定及抗氧化能力研究．

1.2.2 CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與組分HPLC方法的建立

1.2.2.1 色譜條件: Agilent色譜柱(型號(hào)TC-C18, 250 mm×4.6 mm, 5 μm), 0.2%的甲酸(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相, 線(xiàn)性梯度洗脫: 0～5 min 為95%～90%B, 5～45 min為 90%～55%B, 45～50 min為95%B; 流速1 mL/min, 柱溫40 ℃, 進(jìn)樣體積10 μL, 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm．

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備: 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,5-diCQA, 3,4-diCQA, 4,5-diCQA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司, 分別稱(chēng)定1.000 mg, 以70%乙醇溶解定容后進(jìn)行系列稀釋, 分別配成5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液．

1.2.2.3 系統(tǒng)性檢驗(yàn): 分別取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試提取液, 按照1.2.2.1色譜條件各進(jìn)樣10 μL, 記錄色譜圖, 分析各峰分離度, 記錄峰面積和保留時(shí)間, 計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation, RSD)值以進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)、 精密度實(shí)驗(yàn)、 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)． 以濃度為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo), 進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系考察．

1.2.3 供試基因型的測(cè)定

將樣品提取液進(jìn)樣10 μL, 按照1.2.2.1色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析, 得到峰面積, 計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)．

1.2.4 抗氧化能力的測(cè)定

1.2.4.1 ABTS自由基(SBTS+)清除能力測(cè)定: ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)參考Re等[22]描述的方法, 將7 mmoL/L ABTS+溶液與2.45 mmoL/L的K2S2O8溶液1∶1混合過(guò)夜反應(yīng)得到ABTS+儲(chǔ)備液． 將儲(chǔ)備液稀釋至在734 nm處達(dá)到0.7±0.02的吸光度以得到ABTS+工作液． 取0.4 mL提取液與3.6 mL ABTS+溶液混合, 室溫反應(yīng)20 min, 于734 nm波長(zhǎng)下在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光值, 并根據(jù)水溶性維生素E(Trolox)制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Y=0.226 4X+0.531 6,R2=0.999 1)計(jì)算清除能力．

1.2.4.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定: DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)參照Yamaguchi等[23]實(shí)驗(yàn)方法, 取提取液2 mL與2 mL 0.2 mmoL/L 的DPPH 溶液混合, 室溫避光反應(yīng) 30 min, 于 517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光值, 并根據(jù)Trolox制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Y=0.121X+5.684 4,R2=0.999 9)計(jì)算清除能力．

1.2.4.3 FRAP鐵離子還原能力測(cè)定: 鐵離子還原能力的測(cè)定參考Thaipong 等[24]描述的方法, 配制0.3 mol/L的醋酸緩沖液(pH值為3.6), 10 mmoL/L TPTZ, 20 mmoL/L FeCl3, 按 10∶1∶1 的比例混合配制 FRAP試劑． 取提取液 0.4 mL 與 3.0 mL FRAP 試劑混合, 室溫反應(yīng) 10 min, 于 593 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值, 并根據(jù)Trolox制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Y=0.002 5X+0.105 2,R2=0.999)計(jì)算鐵離子還原能力．

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次． 采用Microsoft Excel 2021軟件整理數(shù)據(jù), 采用SPSS 26.0軟件、 Origin 2021軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理．

2 結(jié)果與分析

2.1 CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與組分的HPLC方法建立

2.1.1 適用性檢驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品提取液色譜條件進(jìn)樣分析結(jié)果顯示, 在該色譜條件下, 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,5-diCQA, 3,4-diCQA和4,5-diCQA的組分間的分離和各個(gè)組分的基線(xiàn)分離均良好, 供試品色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間一致, 說(shuō)明本方法專(zhuān)屬性良好． 圖1為CGA標(biāo)準(zhǔn)品混合液和代表性基因型的HPLC圖譜．

圖1 CGA標(biāo)準(zhǔn)品混合液及代表性基因型的HPLC圖譜

2.1.2 線(xiàn)性關(guān)系

以濃度為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系擬合, 結(jié)果顯示6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在5～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(表2)．

表2 6個(gè)供試CGA標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性關(guān)系擬合

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 按照1.2.2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次, 6種標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD值分別為0.08%, 0.23%, 0.46%, 0.39%, 0.14%, 0.31%, 表明儀器精密度良好．

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 分別于0, 2, 4, 6, 8, 12, 24 h進(jìn)樣10 μL, 6種標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD值分別為0.09%, 0.31%, 0.48%, 0.41%, 0.12%, 0.28%, 表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好．

2.2 甘薯葉片中的CGA各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與占比分析

供試基因型葉片中5-CQA, 3-CQA, 4-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA組分和總CGA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明, 50個(gè)基因型葉片均有6種CGA組分, 每100 g干物質(zhì)中CGA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于310.34～5 033.86 mg之間, 變異系數(shù)為50.17%, 平均值為2 398.48 mg, 基因型間差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)． 以基因型S1(18-11-4), S2(18-11-5)和S3(161837)最高, 每100 g干物質(zhì)中CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5 033.86 mg, 4 949.57 mg, 4 941.80 mg, S49(福薯7-6)和S50(2019-1-15)最低, 分別為504.65 mg, 310.34 mg．

表3 50個(gè)甘薯基因型葉片CGA各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計(jì)分析

各CGA組分在總質(zhì)量分?jǐn)?shù)中占比的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明, 3,5-diCQA, 3,4-diCQA和3-CQA共3種CGA組分是50個(gè)基因型葉片綠原酸的主要成分, 其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在總質(zhì)量分?jǐn)?shù)中的占比平均值分別為35.36%, 22.98%和21.54%, 三者總占比為79.88%． 其次為4,5-diCQA, 4-CQA和5-CQA占比較小, 后兩者不足10%(表4)．

表4 50個(gè)甘薯基因型葉片CGA組分占比的統(tǒng)計(jì)分析

2.3 抗氧化活性的測(cè)定

CGA標(biāo)準(zhǔn)品不同單體的抗氧化能力測(cè)定結(jié)果表明, 6種CGA單體的3種綜合抗氧化能力由高到低依次為4,5-diCQA, 3,5-diCQA, 3,4-diCQA, 3-CQA, 4-CQA, 5-CQA(表5)．

表5 CGA不同單體的抗氧化能力統(tǒng)計(jì)分析

50個(gè)甘薯基因型葉片提取物抗氧化能力測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表明, 葉片提取物的ABTS, DPPH自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力在50個(gè)基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, ABTS, DPPH自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力最高基因型分別為最低基因型的5.06, 7.08和9.75倍(表6)．

表6 50個(gè)甘薯基因型葉片抗氧化能力的統(tǒng)計(jì)分析

3種抗氧化指標(biāo)排名前5的基因型及其Trolox當(dāng)量(TE)見(jiàn)表7, 綜合顯示基因型S8, S10, S3和S1的綜合抗氧化能力較強(qiáng)．

表7 抗氧化能力排名前5基因型及其Trolox當(dāng)量(TE)

2.4 主成分分析及相關(guān)性分析

對(duì)50個(gè)基因型甘薯CGA各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及在總質(zhì)量分?jǐn)?shù)中的占比, 3種抗氧化能力共計(jì)15個(gè)指標(biāo)進(jìn)行的主成分分析(Principal components analysis, PCA)表明, 6個(gè)CGA組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在總方差中貢獻(xiàn)率達(dá)到95.48%, 其中5-CQA特征值為7.86, 方差貢獻(xiàn)率達(dá)到52.39%． 15個(gè)指標(biāo)可簡(jiǎn)化為特征值大于1的4個(gè)獨(dú)立成分, 方差貢獻(xiàn)率分別為51.33%, 18.68%, 10.09%和8.15%, 累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.25%． 主成分1主要是6種CGA組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)指標(biāo), 載荷均高于0.90, 其次是ABTS, DPPH自由基清除能力和FARP鐵離子還原能力指標(biāo), 載荷值分別為0.84, 0.81和0.95; 主成分2主要是5-CQA, 3-CQA, 4-CAQ共3種CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)占比的正向載荷和3,5-diCQA的負(fù)向載荷, 主成分3和主成分4分別是3,4-diCQA質(zhì)量分?jǐn)?shù)占比和4,5-diCQA質(zhì)量分?jǐn)?shù)占比的正向載荷． 50個(gè)基因型在這4個(gè)主成分上綜合得分值介于0.10～3.13之間, 排名前10的基因型由大到小依次為S1, S3, S4, S8, S5, S10, S7, S2, S9, S11, 其分值介于1.27～3.13之間． 指標(biāo)間相關(guān)性分析表明, 抗氧化活性與CGA各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的占比不相關(guān), 而與CGA各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)(數(shù)據(jù)略)．

3 討論與結(jié)論

酚類(lèi)物質(zhì)是植物界廣泛存在的膳食抗氧化劑, 甘薯塊根和莖葉中的酚酸類(lèi)化合物主要是CGA[25-26], 包括3種單咖啡?？鼘幩岷?種二咖啡?？鼘幩嵋约?種三咖啡酰奎寧酸(3, 4,5-diCQA)． Truong等[26]發(fā)現(xiàn)甘薯葉中的CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高, 其次是薯皮、 全根和薯肉組織． 本文研究結(jié)果表明, 甘薯葉片中的3種單咖啡酰奎寧酸和3種二咖啡?？鼘幩岬馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)及其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 與Truong等[26]、 Chen等[27]和Krochmal等[17]的研究結(jié)論一致． 本文中的基因型S1葉片CGA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)每100 g干物質(zhì)達(dá)到5 033.86 mg, 是基因型S50的16.22倍, CGA等功能物質(zhì)在品種之間的差異可能與在次級(jí)代謝物形成中起重要作用的遺傳因素有關(guān)[24]． 50個(gè)基因型葉片中雖然均存在6種CGA組分, 但是各個(gè)組分在總質(zhì)量分?jǐn)?shù)中的占比在基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 總體而言, 3,5-diCQA, 3,4-diCQA和3-CQA 3種CGA組分是本文50個(gè)基因型葉片CGA的主要組分, 這3種組分占比平均值分別為35.36%, 22.98%和21.54%, 三者總占比為79.88%, 趙珊等[28]研究13個(gè)甘薯基因型的組分也發(fā)現(xiàn), 3,5-diCQA, 3,4-diCQA和3-CQA為主要組分, 三者總占比為79.05%．

CGA具有較強(qiáng)的抗氧化能力[25]． 已經(jīng)有較多的研究表明甘薯葉片具有抗氧化活性和多種生理保健作用． 本文供試材料葉片提取物的ABTS, DPPH自由基清除能力和FARP鐵離子還原能力在50個(gè)基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 雖然這些基因型的抗氧化能力大小排序和CGA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的排序不完全一致(乙醇提取物還含有其他非CGA活性成分), 但是抗氧化能力與CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間總體上呈極顯著正相關(guān), 這與傅玉凡等[29]、 趙櫻等[30]對(duì)于甘薯CGA的DPPH清除能力與其質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著或極顯著正相關(guān)的研究結(jié)果類(lèi)似．

鑒于甘薯葉片遺棄浪費(fèi)較大的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)實(shí)以及可利用價(jià)值潛力, 有必要開(kāi)展富含CGA葉類(lèi)甘薯新品種選育或淀粉、 食用、 加工類(lèi)品種葉片品質(zhì)改良的甘薯育種工作[31-32]． Ning 等[33]研究發(fā)現(xiàn)CGA的廣義遺傳率高達(dá)0.84, 因此進(jìn)行富含CGA葉類(lèi)甘薯新品種選育或品種改良理論上也是可行的． 種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用是甘薯遺傳多樣性拓展的重要途徑, 是品種改良的基礎(chǔ)和保障． 許建華等[34-35]研究表明西蒙1號(hào)甘薯是藥用甘薯品種, 在臨床上對(duì)多種出血性疾病及胰島素非依賴(lài)型糖尿病有顯著療效, 其莖葉乙醇提取物還具有一定的體內(nèi)外抗腫瘤活性; Xi等[18]通過(guò)對(duì)渝紫薯7號(hào)和西蒙1號(hào)葉片中的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗氧化活性的對(duì)比研究表明, 渝紫薯7號(hào)的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(甘薯莖葉中的多酚主要是CGA[25-26])與抗氧化能力分別是西蒙1號(hào)的1.18, 1.28倍, 是一個(gè)優(yōu)異的富含CGA和高抗氧化能力的資源． 然而渝紫薯7號(hào)的CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力在本文50個(gè)基因型中分別排名第43位與第42位, 因此本研究有機(jī)會(huì)篩選出較多的比渝紫薯7號(hào)更富含CGA和抗氧化能力更強(qiáng)的資源, 如基因型18-11-4, 161837, 170407, 18-6-33, 18-11-5的CGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別比渝紫薯7號(hào)高3.82, 3.75, 3.35, 2.99, 3.75倍, ABTS, DPPH自由基清除能力和FARP鐵離子還原能力分別比渝紫薯7號(hào)最少高出1.29倍, 1.84倍和1.82倍, 因此, 這些資源可用于高CGA、 高抗氧化能力葉類(lèi)利用與開(kāi)發(fā)的甘薯品種的選育與改良工作． 例如, 目前正在大力推廣的高淀粉甘薯渝薯27葉片中CGA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)每100 g干物質(zhì)中含2 078.90 mg, 可與葉富含CGA的淀粉資源18-11-5進(jìn)行雜交育種篩選塊根淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高、 同時(shí)葉片也富含CGA的新品種, 對(duì)渝薯27進(jìn)行改良, 實(shí)現(xiàn)薯塊和葉片的綜合利用, 提高單位土地面積的甘薯產(chǎn)業(yè)效益．