甘薯抗旱品系(種)的篩選及其生理特征分析

宗繼鍇， 陳培濤， 羅青青， 趙騰飛，高紀龍， 秦瑞華， 傅玉凡

西南大學 生命科學學院/重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心，重慶 400715

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是我國第4大糧食作物, 在我國具有重要的地位[1]． 甘薯不僅富含淀粉等碳水化合物[2-4], 還富含胡蘿卜素、 花青素和酚類等多種生物活性物質(zhì)[5-6], 具有增強免疫力、 抗氧化、 降血糖、 抗心血管疾病和抗腫瘤等藥理作用[7-9]．

隨著生態(tài)環(huán)境的惡化和全球氣候異常, 旱災已成為一種常見的氣象災害． 中國是受旱災影響最大的國家之一, 大規(guī)模的干旱災害頻發(fā)[10]． 每年平均約有2 443萬hm2的農(nóng)作物遭受干旱, 中國每年因干旱受到的經(jīng)濟損失巨大[11]． 伏旱會導致根系吸收養(yǎng)分減少、 甘薯葉片蒸發(fā)加快、 莖葉生長受阻, 阻礙甘薯塊根的生長和干物質(zhì)積累等, 導致甘薯產(chǎn)量下降[12-14]． 高溫干旱同時會導致粉虱、 麥蛾、 斜紋夜蛾等病蟲害區(qū)域性發(fā)生, 進一步導致產(chǎn)量降低[15]． 選育抗旱甘薯新品種是應(yīng)對干旱對甘薯生產(chǎn)影響的重要途徑之一[16]．

一直以來, 人們對植物耐旱性進行了大量的研究, 其中以人工模擬干旱的情況居多[17]． 聚乙二醇(Polyethyleneglycol, PEG)是一種惰性的、 較為理想的滲透調(diào)節(jié)劑, 如利用PEG溶液處理模擬土壤干旱來探究番茄、 小麥、 水稻等植物的抗旱機制[18-20]． 對植物耐旱性鑒定的生理生化研究表明莖尖鮮質(zhì)量減少度、 莖尖生根數(shù)、 相對含水量減少度、 丙二醛質(zhì)量分數(shù)等生理指標與植物抗旱性有著密切的聯(lián)系, 可作為植物抗旱性的重要指標[21-24]．

本研究在對課題組育種進程中93個育種材料品系(部分為育成品種)干旱脅迫下的莖尖生根數(shù)、 莖尖鮮質(zhì)量減少度、 葉片相對含水量減少度3項指標進行測定和隸屬函數(shù)綜合評價分析后, 選取7個抗旱能力強的與7個抗旱能力弱的供試材料進一步測定丙二醛、 可溶性蛋白、 超氧陰離子、 葉綠素a、 葉綠素b的質(zhì)量分數(shù)等生理指標, 并分析兩類品種抗旱的生理特征差異, 以期能對甘薯新品系抗旱性能的進一步鑒定和抗旱種質(zhì)資源的篩選與研究奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 供試材料

本文供試材料來自西南大學重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心合川實驗農(nóng)場基地的71個育種品系和22個品種(下文統(tǒng)稱為品系), 它們的編號、 名稱和類型見表1．

表1 93個供試甘薯品系的編號、 名稱、 類型

1.2 實驗方法

1.2.1 采樣方法

當甘薯處于莖葉盛長與薯塊膨大期90 d時, 取20～25 cm的新鮮、 無病、 健康的莖尖, 在實驗室的1/2霍格蘭培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h(3次重復, 每重復3株莖尖)．

1.2.2 PEG處理濃度及處理時間的確定

莖尖在1/2霍格蘭培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后隨機選取4個甘薯品系莖尖, 轉(zhuǎn)入含10%,20%,30%,35% PEG6000的霍格蘭培養(yǎng)液中培養(yǎng), 在0,6,12,24,48,72,96 h分別拍照比較莖尖生長狀況, 確定適宜的PEG處理濃度與處理時間．

1.2.3 93個甘薯品系3項抗旱性指標的測定及抗旱性能力的初步評價

將1/2霍格蘭培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h的莖尖苗按照1.2.2實驗結(jié)果(20% PEG6000處理48 h)進行干旱脅迫處理, 對照采用1/2霍格蘭培養(yǎng)液培養(yǎng)．

1.2.3.1 莖尖生根數(shù)(R): 人工計數(shù)統(tǒng)計莖尖生根數(shù)．

1.2.3.2 莖尖鮮質(zhì)量減少度(F):

F=M2/M1

式中,M2指處理前的莖尖苗質(zhì)量,M1指處理后的莖尖苗質(zhì)量．

1.2.3.3 葉片相對含水量減少度(W):

W=[(M3-M5)/(M4-M5)]/[(m3-m5)/(m4-m5)]×100%

式中,M3指處理后莖尖第3片葉鮮質(zhì)量,M4指處理后莖尖第3片葉再次浸入蒸餾水12 h吸干表面水分后的鮮質(zhì)量,M5指M4葉片115 ℃殺青10 min再60 ℃干燥后的恒質(zhì)量．m3,m4,m5分別為對照組相應(yīng)數(shù)據(jù)．

1.2.3.4 綜合抗旱能力的隸屬函數(shù)評價: 每個品系R,F和W的隸屬函數(shù)值

UXj=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,3,…,93

式中,UXj為第j個品系某一指標的隸屬函數(shù)值,Xj表示第j個品系指標測定值,Xmin,Xmax表示該指標在93個品系間的最小值和最大值． 每一個品系3個指標的隸屬函數(shù)值的平均值為該品系的綜合抗旱能力初步評價得分D1值．

1.2.4 7個抗旱能力強品系和7個抗旱能力弱品系生理指標的測定和抗旱性分析

根據(jù)1.2.3.4的D1值在93個供試材料中的排名, 分別選取排名前7位品系和排名后7位品系再次按照1.2.2實驗結(jié)果(20% PEG處理48 h)進行干旱脅迫處理, 對照采用1/2霍格蘭培養(yǎng)液培養(yǎng), 測定生理指標及進行分析評價．

1.2.4.1 葉片丙二醛質(zhì)量分數(shù)測定: 參考劉新等[25]的測定方法, 并稍加改進． 取1.00 g甘薯葉片加入2 mL 10%的三氯乙酸(TCA)溶液, 研磨至勻漿, 后加入8 mL 10%TCA溶液繼續(xù)研磨, 勻漿后4 000 r/min離心20 min, 取上清液2 mL, 加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸(TBA), 沸水反應(yīng)15 min, 冷卻后離心, 測定上清液的600 nm, 450 nm, 532 nm吸光度, 計算丙二醛抗旱系數(shù)(M)為

M=MCK/MEG

式中,MEG為實驗組丙二醛質(zhì)量分數(shù),MCK為對照組丙二醛質(zhì)量分數(shù)．

1.2.4.2 葉片可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)測定: 參照劉小華等[26]的測定方法, 并稍加改進． 取1.00 g甘薯葉片用10 mL 50 mmol 磷酸緩沖液(pH值為 7.8)研磨成勻漿, 4 000 r/ min離心20 min, 取0.1 mL上清液, 加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑, 充分混合, 放置2 min后測定595 nm吸光度, 可溶性蛋白抗旱系數(shù)(P)為

P=PCK/PEG

式中,PEG為實驗組可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù),PCK為對照組可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)．

1.2.4.3 葉片超氧陰離子質(zhì)量分數(shù)測定: 參考劉新等[25]的測定方法, 并稍加改進． 取1.00 g甘薯葉片用10 mL 50 mmol磷酸緩沖液(pH值為 7.8)研磨成勻漿, 4 000 r/min離心20 min, 取0.5 mL上清液, 加入0.5 mL 50 mmol磷酸緩沖液和1 mL 1 mmol/L鹽酸羥胺, 混勻后于25 ℃水浴鍋中保溫1 h, 然后再加入1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/L α-萘胺, 混勻后于25 ℃水浴鍋中保溫 20 min, 后測定530 nm吸光度, 計算超氧陰離子抗旱系數(shù)(O)為

O=OCK/OEG

式中,OEG為實驗組超氧陰離子質(zhì)量分數(shù),OCK為對照組超氧陰離子質(zhì)量分數(shù)．

1.2.4.4 葉片葉綠素a、 葉綠素b質(zhì)量分數(shù)測定: 參考劉新等[25]的測定方法, 并稍加改進． 取0.20 g甘薯葉片, 去除葉脈后剪成0.2 cm左右的細絲, 然后加入10 mL無水乙醇和丙酮(1∶1)混合試劑, 暗處浸提24 h, 離心取上清液, 測定上清液的663 nm, 646 nm, 470 nm吸光度, 計算葉綠素a質(zhì)量分數(shù)和葉綠素b質(zhì)量分數(shù), 葉綠素a抗旱系數(shù)(Ca)和葉綠素b抗旱系數(shù)(Cb)為

Ca=Ca(EG)/Ca(CK)

Cb=Cb(EG)/Cb(CK)

式中,Ca(EG)為實驗組葉綠素a質(zhì)量分數(shù),Ca(CK)為對照組葉綠素a質(zhì)量分數(shù);Cb(EG)為實驗組葉綠素b質(zhì)量分數(shù),Cb(CK)為對照組葉綠素b質(zhì)量分數(shù)．

1.2.4.5 綜合抗旱能力分析: 參照1.2.3.4計算隸屬函數(shù)值, 計算生理指標權(quán)重值(W)為

Wi=Ci/ΣCi

式中,Wi為第i項生理指標抗旱系數(shù)的權(quán)重,Ci為第i項生理指標抗旱系數(shù)的變異系數(shù)． 品系的綜合抗旱能力(D2)為

D2=Σ[Wi×U(Xi)]

式中,U(Xi)為第X個品種的第i項生理指標的隸屬函數(shù)值．

1.2.4.6 主成分綜合評價得分分析

Y=ΣFjn×Ei

式中,Y為主成分分析法得到的第n品系的主成分綜合分值,Fjn為第n個品系累積貢獻率大于80%第j個主成分的得分值,Ei為第i個主成分的方差貢獻率．

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理及計算, 利用SPSS 23.0進行主成分與相關(guān)性分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG濃度和處理時間選擇

福薯7-6、 忠薯1號、 渝薯1號、 商薯19在10% PEG6000和20% PEG6000處理下, 培養(yǎng)的甘薯苗生出的根都有不同程度的生長, 總體上不如在0% PEG6000培養(yǎng)液條件下生長狀況好． 20% PEG6000處理下根生長比10% PEG6000處理下根生長更為緩慢, 其葉子萎蔫比10% PEG6000處理發(fā)生更早． 當PEG6000濃度達到30%以上, 6 h根已經(jīng)有缺水干枯的現(xiàn)象, 且沒有新根發(fā)生; 處理48 h時, 部分品系甘薯葉片及莖萎蔫過于嚴重, 無法再進行后續(xù)實驗． 這4個品系在20% PEG6000, 30% PEG6000處理下的植株形態(tài)如圖1． 選定20% PEG6000培養(yǎng)48 h的干旱脅迫處理方案開展后續(xù)實驗．

圖1 4個品系甘薯在20%, 30% PEG6000濃度下的生長情況

2.2 93個甘薯品系20% PEG6000模擬干旱處理后的抗旱能力初步評價及品系分類分析

在93個甘薯品系經(jīng)過20% PEG6000模擬干旱處理48 h后的莖尖生根數(shù)(R)、 莖尖鮮質(zhì)量減少度(F)和相對含水量減少度(W)的統(tǒng)計分析見表2． 獨立樣本t檢驗分析表明, 每項指標在93個品系間差異有統(tǒng)計學意義． 3項指標的隸屬函數(shù)初步評價D1值變幅達0.65, 品系間抗旱能力差異也有統(tǒng)計學意義． 93個品系D1平均值為0.48, 有43個品系D1值高于這個平均值, 有35個品系D1值超過公認的抗旱品種潮薯1號[27-29]的D1值(0.52)．

表2 93個甘薯品系20% PEG6000模擬干旱處理后的生長情況及抗旱性綜合得分的統(tǒng)計

6類甘薯的莖尖生根數(shù)(R)、 莖尖鮮質(zhì)量減少度(F)和相對含水量減少度(W)及隸屬函數(shù)初步評價D1值比較分析結(jié)果見表3． 隸屬函數(shù)初步評價D1值和莖尖鮮質(zhì)量減少度在品系類型間差異無統(tǒng)計學意義, 淀粉型生根能力最差, 飼料型和葉菜型的莖尖鮮質(zhì)量減少度最?。?總體而言每類型甘薯都有抗旱能力強的品系和抗旱能力弱的品系．

表3 不同類型甘薯20% PEG6000模擬干旱處理后分類分析

D1排名前7位品系分別是XS160615, 21-F-4, XS161819, XN1729-11, XN1526-3, 綿紫薯9號, 21-P-19,D1值介于0.70～0.77, 排名后7位品系分別是18-11-5, 21-P-21, 21-P-26, 忠薯1號, 21-P-34, 18-12-3和商薯19,D1值介于0.12～0.27． 這14個品系進一步進行20% PEG6000處理, 測定和分析其生理指標．

2.3 7個抗旱能力強的品系和7個抗旱能力弱的品系的抗旱能力驗證

7個抗旱能力強的品系和7個抗旱能力弱的品系經(jīng)過20% PEG6000生長培養(yǎng)48 h后的莖尖生根數(shù)(R)、 莖尖鮮質(zhì)量減少度(F)、 相對含水量減少度(W)、 丙二醛抗旱系數(shù)(M)、 可溶性蛋白抗旱系數(shù)(P)、 超氧陰離子抗旱系數(shù)(O)、 葉綠素a抗旱系數(shù)(Ca)和葉綠素b抗旱系數(shù)(Cb)測定與計算結(jié)果表明, 這8項指標不僅在14個品系之間差異有統(tǒng)計學意義, 在同是抗旱能力強的品系之間或同是抗旱能力弱的品系之間差異也有統(tǒng)計學意義． 形態(tài)與生理指標的隸屬函數(shù)分析得到的綜合抗旱能力D2值及7個抗旱能力強的品系和7個抗旱能力弱的品系指標統(tǒng)計表明, XS161819, 21-F-4, 21-P-19, XS160615和綿紫薯9號綜合抗旱性能較好, 居于14個品系前5位(表4)．

表4 7個抗旱能力強的品系和7個抗旱能力弱的品系指標統(tǒng)計

本文把抗旱能力強的7個品系集合體稱為抗旱群體, 7個抗旱能力弱的品系集合體稱為不抗旱群體, 兩個群體的莖尖生根數(shù)(R)、 莖尖鮮質(zhì)量減少度(F)、 相對含水量減少度(W)和丙二醛抗旱系數(shù)(M)的變幅范圍完全沒有交叉, 葉綠素a抗旱系數(shù)(Ca)和葉綠素b抗旱系數(shù)(Cb)變幅交叉較少, 而可溶性蛋白抗旱系數(shù)(P)和超氧陰離子抗旱系數(shù)(O)交叉較多(表5)．R,F,W,M,Ca和Cb在抗旱與不抗旱兩個品系群體之間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),P和O在抗旱與不抗旱兩個品系群體之間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)． 綜合抗旱能力D2值在兩個品系群體之間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)． 初步表明R,F,W,M,Ca和Cb是抗旱品系和不抗旱品系之間最為顯著的差異特征．

表5 抗旱群體和不抗旱群體的9項指標的變幅、 平均數(shù)和變異系數(shù)

2.4 14個品系主成分分析及其主成分得分

14個品系8項指標的主成分分析表明, 這8項指標可簡化為累積貢獻度大于80%的兩個獨立主成分, 累計貢獻率為83.2%, 可代表原來所有指標的絕大部分信息, 主成分1(F1)中主要綜合了W(0.95),M(0.73),F(0.85)和R(0.67), 代表原始數(shù)據(jù)信息量的74.39%． 主成分2(F2)中主要綜合了P(0.91) ,O(0.72),Ca(0.75)和Cb(0.76), 代表原始數(shù)據(jù)信息量的8.81%． 14個品系在兩個主成分上的得分介于-2.67～2.81之間, 其中前5位分別是XS161819 (2.81), 21-F-4(2.13), 21-P-19(2.02), 綿紫薯9號(1.39)和XS160615(1.23)．

2.5 14個品系8項指標的相關(guān)性分析

進一步考察主成分載荷較大指標與其余指標的相關(guān)性發(fā)現(xiàn), 抗旱群體與不抗旱群體的關(guān)鍵形態(tài)差異指標莖尖生根數(shù)(R)與莖尖鮮質(zhì)量減少度(F), 葉綠素a和葉綠素b抗旱系數(shù)呈極顯著正相關(guān)(表6)．

表6 8項形態(tài)、 生理指標及其與綜合抗旱能力D2的相關(guān)系數(shù)

20% PEG6000處理48 h后的表觀響應(yīng)指標莖尖鮮質(zhì)量減少度(F)不僅得益于與莖尖生根數(shù)(R)的極顯著正向作用, 而且對W值, 葉綠素a和葉綠素b的抗旱系數(shù)和丙二醛抗旱系數(shù)(M)具有極顯著正向效應(yīng)． 葉綠素a、 b功能的維持進一步極顯著增強丙二醛抗旱系數(shù)(M)和可溶性蛋白抗旱系數(shù)(P)． 表明在干旱情形下, 生根能力強(本文具體指莖尖生根數(shù)多)的品系, 葉片鮮質(zhì)量和相對含水量保持能力較強, 相對較強地維持了葉綠素的正常功能, 丙二醛、 可溶性蛋白、 超氧陰離子應(yīng)急響應(yīng)程度低; 生根能力弱(莖尖生根數(shù)少)的品系由于水分吸收總量的減少, 葉片里丙二醛、 可溶性蛋白、 超氧陰離子應(yīng)急抗旱方面的代價相對高于生根能力強的品系．D2值與R,F,Cb和Ca指標的相關(guān)系數(shù)大也印證了R對于抗旱能力的重要性．

3 討論與結(jié)論

已有研究表明莖尖生根數(shù)(R)、 莖尖鮮質(zhì)量減少度(F)以及相對含水量減少度(W)是開展植物抗旱能力評價的可靠指標[23-24, 30]． 因此, 本文在確定PEG6000濃度為20%和時間為48 h干旱模擬處理方法的基礎(chǔ)上, 對93個供試材料的莖尖生根數(shù)、 莖尖鮮質(zhì)量減少度和葉片相對含水量減少度進行測定與分析, 結(jié)果表明, 這3項指標在供試材料之間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)． 參照菊芋、 桑樹、 馬鈴薯等種質(zhì)抗旱性鑒定[31-33]的隸屬函數(shù)方法綜合評價了93個品系的抗旱能力, 得到該供試材料的綜合抗旱能力初步評價D1值, 且有35個品系D1值超過抗旱品種潮薯1號[27-29]的D1值． 為了進一步確認抗旱能力, 將93個供試材料綜合抗旱能力排名前7和后7共計14個供試材料分別構(gòu)成抗旱和不抗旱兩類群體, 進一步分析兩類群體之間的生理抗旱指標差異, 以期進行生理指標印證抗旱能力．

PEG6000是一種高分子滲壓劑, 因其不能透過植物細胞壁和細胞膜, 不會給植物提供營養(yǎng), 給植物提供一個高滲環(huán)境使植物細胞緩慢吸水, 類似干旱條件下較少吸水情形, 因此常用來模擬干旱脅迫[34]． 關(guān)于植物在干旱處理的生理響應(yīng)指標較多, 賈學靜等[35]根據(jù)金葉吊蘭的丙二醛質(zhì)量分數(shù)、 超氧陰離子質(zhì)量分數(shù)等指標確定金葉吊蘭葉片不同部位的抗旱能力． 謝賢健等[36]根據(jù)可溶性蛋白、 葉綠素等形態(tài)和生理指標對3種巖生植物進行抗旱能力排名． Batool等[37]研究表明耐旱油菜品種表現(xiàn)出更高的葉綠素質(zhì)量分數(shù)和較低的丙二醛質(zhì)量分數(shù)． 因此本文采用丙二醛抗旱系數(shù)(M)、 可溶性蛋白抗旱系數(shù)(P)、 超氧陰離子抗旱系數(shù)(O)、 葉綠素a抗旱系數(shù)(Ca)和葉綠素b抗旱系數(shù)(Cb)對抗旱和不抗旱兩類群體的抗旱能力做進一步測定與分析． 結(jié)果表明抗旱群體的P,O顯著高于不抗旱群體, 抗旱群體的M,Ca和Cb極顯著高于不抗旱群體． 主成分分析和相關(guān)系數(shù)分析表明, 品系莖尖生根數(shù)(R)對于莖尖鮮質(zhì)量減少度(F)、 葉片相對含水量減少度(W)和丙二醛抗旱系數(shù)(M)、 葉綠素a抗旱系數(shù)(Ca)和葉綠素b抗旱系數(shù)(Cb)具有較強的正向影響． 抗旱群體莖尖生根數(shù)變幅為25.00～44.00, 平均值為33.52, 極顯著高于不抗旱群體的平均值10.62． 植物根系首先會感知到干旱情況的發(fā)生, 并經(jīng)過形態(tài)和生理代謝變化來吸收水分及營養(yǎng)[38], 繼而影響整個植株的生長與發(fā)育, 例如鮮質(zhì)量及含水量的減少、 膜脂過氧化的發(fā)生[29, 39], 光合作用減弱[40]等． 有研究表明抗旱植物的根系能通過垂直生長與增多伸展根數(shù)來增加根際面積, 從而提高根系的吸水量以供應(yīng)植株的正常生長發(fā)育[41-42]． 根的數(shù)量、 形態(tài)、 分布和生理條件直接影響甘薯的抗旱強度[43]．

甘薯是重要的糧食作物和食品加工原料之一, 在其大田生長的早、 中期, 極易遭遇干旱災害性天氣, 生長和產(chǎn)量受到極大影響[12]． 選育抗旱品種是重要的干旱應(yīng)對措施, 朱天亮等[44]研究表明不同雜交類型組合后代出現(xiàn)抗旱品系的頻率差異很大, 其中耐旱與耐旱的組合, 后代中出現(xiàn)耐旱、 耐瘠的品種最多． 因此, 要育出既擁有優(yōu)良性狀又耐旱的甘薯新品種, 親本中至少有一方必須是耐旱的育種資源, 所以選育出耐旱、 抗旱的甘薯種質(zhì)資源是抗旱品種的選育、 應(yīng)對干旱災害性天氣的重要基礎(chǔ)性工作． 本研究通過在93份供試材料中初步篩選7個抗旱能力強的品種, 再進行5項抗旱生理指標的測定和驗證, 篩選出XS161819, 21-F-4, 21-P-19, 綿紫薯9號和XS160615 共5個抗旱種質(zhì)資源, 其中XS161819是高淀粉高產(chǎn)甘薯品系, 21-F-4和21-P-19是葉菜用甘薯品系, 綿紫薯9號是已經(jīng)通過行業(yè)組織機構(gòu)鑒定的高產(chǎn)紫肉甘薯品種, XS160615是一個已經(jīng)行業(yè)組織機構(gòu)鑒定的熟食口感優(yōu)的黃心食用型新品種． 這些抗旱品系、 種質(zhì)資源和品種將進行進一步大田抗旱鑒定和相關(guān)分子機制研究, 以期建立切實可行的實驗室抗旱測定技術(shù), 為進一步應(yīng)用于抗旱甘薯新品種篩選育種或作為抗旱新品種推廣奠定基礎(chǔ)．