不同基因型甘薯葉片酚類質(zhì)量分?jǐn)?shù)及PPO，POD活性的差異

冉海榕， 李佳欣， 傅玉凡， 陳培濤，王璐璐， 黃雨， 宗繼鍇， 羅青青

西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心，重慶 400715

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是我國重要的糧食、 飼料和工業(yè)原料作物之一[1]． 隨著淀粉甘薯、 鮮食甘薯產(chǎn)業(yè)規(guī)?；蛯I(yè)化的發(fā)展, 塊根成為主要的收獲對象, 而原先被作為飼料利用的藤蔓則被大量遺棄[2], 造成資源浪費(fèi)、 病蟲害傳播． 甘薯藤蔓含有豐富的蛋白質(zhì)、 維生素和礦物質(zhì)以及多酚、 綠原酸等功能性物質(zhì)[3-4], 不僅是營養(yǎng)豐富的飼料和葉類蔬菜來源, 還具有預(yù)防心血管等疾病、 提高人體免疫力等多種生理保健功能[5-6], 值得重視和開發(fā)利用, 如從甘薯品種渝紫薯7號、 西蒙1號中成功提取、 純化出多酚[7]和制作飲料沖劑等[8]． 酚類物質(zhì)普遍存在于植物中, 在植物生長發(fā)育、 繁殖以及抗逆等過程中發(fā)揮著重要作用[9], 但容易被多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和過氧化物酶(peroxidase, POD)氧化成醌類物質(zhì)從而降低果蔬等農(nóng)產(chǎn)品的營養(yǎng)成分和商品品質(zhì), 造成經(jīng)濟(jì)損失[10], 其合成與積累與PPO, POD的生理活性具有一定的相關(guān)性[11]． 除此之外, PPO, POD在乙醇生產(chǎn)、 啤酒風(fēng)味陳化等食品加工、 污水處理等領(lǐng)域也具有重要的利用價值[12-13]．

就甘薯葉片中功能成分而言, 前人的研究多集中在酚類、 綠原酸、 黃酮等質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組分的定性定量分析[14-15]、 抗氧化能力[16-17]等方面, 由于檢測方式、 實驗材料及其栽培因素的差異, 相關(guān)的研究結(jié)論具有一定的差異． 關(guān)于甘薯PPO, POD活性的研究也往往只針對于塊根, 如鮮切甘薯不同部位褐變機(jī)理差異[18-19]、 不同處理對酶活性的影響[20]等方面, 而甘薯葉片中關(guān)于這兩種酶的研究較少, 且只在少數(shù)品種中開展過兩種酶的分離純化與性質(zhì)研究[[13, 21]． 由于葉片是藤蔓的主要部位, 其質(zhì)量占比在50%以上[22], 有資料顯示多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)有器官依賴性[23], 且質(zhì)量分?jǐn)?shù)與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)[24], 因此, 本文對86個甘薯高級育種品系葉片中多酚、 綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 抗氧化能力、 PPO和POD活性進(jìn)行測定和分析, 以期為這些甘薯新品系的進(jìn)一步鑒定、 藤蔓資源的利用提供一定的數(shù)據(jù)支撐, 也為PPO, POD的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的86個甘薯新品系或基因型, 均來自于重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心合川農(nóng)場基地2020年的品種比較試驗． 供試材料的編號、 名稱見表1．

表1 86個供試甘薯的編號、 名稱

1.2 田間試驗設(shè)計

采用隨機(jī)區(qū)組排列小區(qū), 重復(fù)3次, 小區(qū)面積20 m2, 種植密度60 000株/hm2． 試驗于2019年5月17日至6月20日栽插, 常規(guī)性施肥、 中耕、 除草等田間管理．

1.3 取樣及其樣品制備

生長期110 d時在品種比較試驗的Ⅱ重復(fù)里取樣． 藤蔓自上往下第3～4節(jié)位采集新鮮無病斑、 無腐爛的葉片, 質(zhì)量約100 g, 快速去除雜質(zhì)、 切絲、 混勻后裝入紙袋, 置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱于 40 ℃干燥至恒質(zhì)量． 烘干的樣品用中草藥植物粉碎機(jī)粉碎, 過100目篩后、 密封低溫保存, 用于多酚、 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定及ABTS自由基清除能力測定．

每個供試材料再隨機(jī)挑選3株藤蔓, 取其自上往下第3～4節(jié)位新鮮無病斑、 無腐爛的葉片, 快速去除雜質(zhì)后稱質(zhì)量, 錫箔紙包住液氮處理后-80 ℃保存, 用于PPO, POD活性測定．

取樣均重復(fù)3次．

1.4 總多酚提取與測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作: 參照張文婷等[14]的方法得到?jīng)]食子酸濃度(X)與吸光度(Y)的回歸方程:

Y=2.852 7X+ 0.054R2=0.999 0

樣液制備: 參照Sun等[5]的方法, 稍作修改． 準(zhǔn)確稱取0.200 0 g粉末干樣, 加入70%乙醇8.0 mL, 浸泡提取16～18 h后, 超聲30 min, 5 000 r/min離心15 min, 吸上清液于50 mL離心管中, 向殘渣中加入70%乙醇8.0 mL 再次提取, 合并2次提取液, 于55 ℃條件下旋蒸, 用蒸餾水洗滌濃縮液, 定容, 得到總多酚提取待測液．

質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定: 取0.20 mL待測液, 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定待測液吸光度． 總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示為每克鮮質(zhì)量的沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent, GAE)毫克數(shù), 計算公式為

C總多酚=(A×V1)/m×B

式中,C總多酚為總多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g);A為反應(yīng)體系樣液濃度(mg/mL), 由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算可得;V1為定容體積50 mL;m為稱取的粉末干樣0.200 0 g;B為葉片干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)．

1.5 綠原酸的提取與測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作: 參照傅玉凡等[17]的方法得到綠原酸濃度(X)與吸光度(Y)的回歸方程:

Y=0.028 7X-0.003 7R2=0.999 0

樣液制備: 參照傅玉凡等[17]的方法, 稍作修改． 準(zhǔn)確稱取0.200 0 g粉末干樣, 加入50%乙醇20.0 mL, 浸泡提取20 h后, 超聲30 min, 5 000 r/min離心20 min, 吸上清液于50 mL離心管中, 向殘渣中加入 50%乙醇20.0 mL再次提取, 合并2次提取液, 定容得綠原酸待測液．

質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定: 待測液稀釋20倍后, 在326 nm處測定待測液吸光度． 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示為每克鮮質(zhì)量的綠原酸當(dāng)量(chlorogenic acid equivalent, CAE)毫克數(shù), 計算公式為

C綠原酸=(A×n×V2)/(m×1 000)×B

式中,C綠原酸為綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g);n為稀釋倍數(shù)20;V2為定容體積50 mL．

1.6 ABTS自由基清除能力測定

樣品醇溶提取液的制備: 參照1.5方法制備4.0 mg/mL的醇溶提取樣液．

ABTS自由基儲備液的制備: 參照Re等[25]的方法． 計算使ABTS自由基活性降低50%的提取液濃度后, 換算成鮮基下的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50), 分析EC50與鮮基下的總多酚和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及PPO, POD活性的相關(guān)性．

S=[(A0-A1)/A0]×100

式中,S為ABTS自由基清除率(%),A0,A1為反應(yīng)前后的吸光度．

1.7 PPO, POD活性測定

粗酶液提取: 參照李嬌洋[26]方法．

PPO活性的測定: 參照梁建榮[21]的方法并稍加修改． 反應(yīng)體系為2.0 mL磷酸緩沖液, 加入1.6 mL鄰苯二酚, 再加入200 μL粗酶液, 于401 nm處比色測定, 用蒸餾水作為對照, 以每分鐘吸光度變化0.01為1個PPO活性單位(U/g·min)．

POD活性的測定: 參照付偉麗等[13]的方法并稍加修改． 反應(yīng)體系為2.775 mL磷酸緩沖液, 加入0.1 mL愈創(chuàng)木酚, 0.1 mL H2O2, 再加入25 μL粗酶液, 于470 nm處比色測定, 用蒸餾水作為對照, 以每分鐘吸光度變化0.01為1個POD活性單位(U/g·min)．

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的整理、 計算用軟件 Excel 2019, 數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析以及方差分析采用SPSS 26.0．

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的分組

86個基因型有5組葉片色澤的品種群體(BC), 即BC1(紫綠), BC2(深綠), BC3(褐綠), BC4(綠), BC5(淺綠)． 根據(jù)葉片干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定得到的數(shù)據(jù), 可將86個品種分為8組干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)基因型群體(DM)． 86個基因型在BC, DM中的分布見表2．

表2 86個甘薯基因型在葉片色澤和干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)群體上的分布

2.2 葉片干物質(zhì)、 總多酚和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 EC50以及PPO, POD活性的多重比較

2.2.1 86個基因型間的比較

葉片干物質(zhì)、 總多酚和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)等6項指標(biāo)在86個基因型間的變幅、 平均值和變異系數(shù)如表3． 方差分析表明鮮基葉片的這6項指標(biāo)在86個基因型間均有統(tǒng)計學(xué)意義．

表3 86個甘薯基因型6項指標(biāo)的平均值、 變幅和變異系數(shù)

2.2.2 BC群體內(nèi)不同基因型間和BC群體間的比較

葉片干物質(zhì)、 總多酚與綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)等6項指標(biāo)在同一BC群體內(nèi)部不同基因型之間的變幅、 平均值、 變異系數(shù)見表4．

干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)指標(biāo)在群體內(nèi)的變異系數(shù)相對較小, 而總多酚與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及EC50指標(biāo)變異系數(shù)居中, PPO, POD活性在BC群體內(nèi)變異系數(shù)最大． 多重比較表明, 無論哪一個BC群體, 6項指標(biāo)在群體內(nèi)不同基因型間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)略)．

除POD活性外, 其余5項指標(biāo)在BC群體間差異無統(tǒng)計學(xué)意義． BC1群體的POD活性顯著高于BC2群體和極顯著高于其余BC群體． POD活性在BC2-BC5群體間差異無統(tǒng)計學(xué)意義．

2.2.3 DM群體內(nèi)不同基因型間和DM群體之間的比較

葉片干物質(zhì)、 總多酚與綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)等6項指標(biāo)在同一DM群體內(nèi)不同基因型之間的變幅、 平均值、 變異系數(shù)見表5．

DM群體內(nèi)不同基因型間的葉片干物質(zhì)、 總多酚與綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50的變異系數(shù)普遍低于DM群體間的變異系數(shù), 而PPO活性和POD活性的變異系數(shù)普遍高于DM群體間的變異系數(shù)． 葉片干物質(zhì)、 總多酚與綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50值以及PPO, POD活性6項指標(biāo)在DM群體間的變異系數(shù)均高于BC群體間的變異系數(shù)． DM群體內(nèi)不同基因型間比較表明, 葉片干物質(zhì)、 總多酚和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及EC50差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 而PPO, POD活性在群體內(nèi)基因型間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)略)．

葉片干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在兩兩DM群體之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義． DM8的總多酚與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于其他群體, DM1與DM2之間的總多酚、 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但都顯著低于其他群體． DM1的EC50顯著高于其他群體, DM5至DM8群體之間的EC50差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但都顯著低于其他群體． DM1群體的PPO活性最大, 與DM5的PPO活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義, 與其他DM群體之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義． POD活性在8個DM群體之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義．

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50的相關(guān)性

總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50的相關(guān)性如表6(群體內(nèi)不同基因型之間相關(guān)性不明顯, 相關(guān)系數(shù)未列出)． 在86個基因型之間、 DM群體間的分析尺度上, 總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈極顯著正相關(guān), 與EC50呈極顯著負(fù)相關(guān); BC群體之間, 總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān), 與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān), 與EC50呈負(fù)相關(guān)． BC2, BC3, BC4, BC5群體內(nèi)不同基因型之間的總多酚與干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著或極顯著正相關(guān), 與EC50(除BC3外)呈極顯著負(fù)相關(guān)． DM群體內(nèi)不同基因型之間, 總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不明顯, 與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM1和DM4群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著或極顯著相關(guān)性, 與EC50只在DM1和DM8群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著負(fù)相關(guān), 而在DM6群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著正相關(guān)．

表6 總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 EC50的相關(guān)性

2.3.2 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)和總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50的相關(guān)性

綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)和總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50的相關(guān)性的趨勢類似表6(具體數(shù)據(jù)略)． 在86個基因型之間、 BC群體間、 DM群體間的分析尺度上, 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)和總多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著或極顯著關(guān)系, 與EC50只在86個基因型之間和DM群體間呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)． BC群體內(nèi)不同基因型之間, 除綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50在BC1群體內(nèi)相關(guān)性不明顯外, 其余情況下綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)和總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著或極顯著正相關(guān), 與EC50呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)． 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM1,DM2和DM5群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著或極顯著正相關(guān), 與總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM1和DM4群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著或極顯著正相關(guān), 與EC50只在DM4群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著負(fù)相關(guān)．

2.3.3 PPO, POD活性之間及其與干物質(zhì)、 總多酚與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、EC50的相關(guān)性

86個基因型之間、 BC4和DM1群體內(nèi)不同基因型之間的分析尺度上, PPO活性與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān), 其余分析尺度下, PPO活性和POD活性之間沒有顯著的相關(guān)性． PPO活性與干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM1群體內(nèi)不同基因型之間呈極顯著負(fù)相關(guān), 與總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM1和DM4群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著負(fù)相關(guān), 與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM1群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著負(fù)相關(guān)． POD活性與干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM3群體內(nèi)不同基因型之間呈顯著正相關(guān), 與綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)只在DM7群體內(nèi)不同基因型之間呈極顯著負(fù)相關(guān)． PPO, POD活性與EC50在各種分析尺度下相關(guān)性均不明顯．

3 討論與結(jié)論

本文以甘薯藤蔓主要器官葉片為研究對象, 測定其干物質(zhì)、 總多酚和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù), 結(jié)果表明在86個基因型之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義． 這與Sun等[5]、 王永徐[27]的研究結(jié)果相類似, 表明可以通過育種手段篩選出葉片總多酚、 綠原酸高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘薯專用基因型; 也說明在多個淀粉基因型或多個鮮食甘薯基因型相當(dāng)?shù)那闆r下, 可以優(yōu)先選用葉片總多酚、 綠原酸高的基因型, 便于綜合利用．

總多酚和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然在BC群體間差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 但在深綠(BC2)或淺綠(BC5)群體葉片里變異系數(shù)較大, 且變幅的上限值相對較高． 總多酚和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在DM群體內(nèi)不同基因型之間差異較小, 但在DM群體間差異有統(tǒng)計學(xué)意義, 且與杜曉華等[28]的研究結(jié)果相類似． 總多酚、 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在86個基因型之間、 BC群體間、 DM群體間以及BC群體內(nèi)不同基因型之間多個分析尺度下均與相應(yīng)的葉片干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著或極顯著正相關(guān)性． 同時與梨果實[29]、 紅樹莓葉[30]、 黑核桃青皮[31]、 番石榴果實[32]等研究中的總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化活性呈顯著的正相關(guān)相類似． 甘薯葉片醇溶提取液的ABTS自由基清除能力與其總多酚和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著或極顯著正相關(guān), 因此, 可以在深綠(BC2)或淺綠(BC5)群體里篩選葉片總多酚和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的功能性基因型, 并以葉片干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為間接篩選指標(biāo)． 就本文供試材料而言, 綜合考慮總多酚和綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及ABTS自由基清除能力的EC50值, 編號50(BC5DM8群體里的15-10-2), 33(BC5DM7群體里的T85-5), 18(BC2DM8群體里的18-10-3)等可作為總多酚、 綠原酸功能成分育種資源或進(jìn)一步鑒定篩選, 如15-10-2是一個薯塊食味好的品系, 而18-10-3是一個薯塊淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的品系． 值得注意的是83號18-6-24, 79號廣薯72葉片總多酚、 綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對不高, 但是其EC50值相對較低, 抗氧化活性較高, 可能與其總多酚、 綠原酸的組分種類有關(guān)系[33], 值得進(jìn)一步研究．

本文86個基因型葉片之間的PPO, POD活性變幅較寬, 變異系數(shù)較大, 高低相差約35倍, PPO和POD活性與葉片色澤、 干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及總多酚和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅在部分群體內(nèi)有相關(guān)性, 且沒有明顯規(guī)律可循． 這可能與PPO, POD活性與遺傳、 植物代謝和環(huán)境等因素的關(guān)系較為復(fù)雜有關(guān)[34], 如植物酚類物質(zhì)代謝途徑涉及到酶的種類繁多, 有時并不只與PPO, POD兩個酶[35]有關(guān), 而且POD, PPO除了能夠?qū)⒎宇愇镔|(zhì)氧化成醌類物質(zhì)外, 還參與了木質(zhì)素前體的聚合作用[36-37]． 本文中編號17(18-11-7), 43(18-1-1), 46(171404)的PPO活性相對較高, 編號5(161010), 10(161834), 84(18-6-1)的POD活性相對較高, 可進(jìn)一步提取分離純化[13, 21]或作為種質(zhì)資源在甘薯育種中加以利用．