酒精性肝病動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀及展望

劉夢(mèng)佳,連奕琪,呂翼

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建省發(fā)育與神經(jīng)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350117)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是一類由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝代謝疾病,它嚴(yán)重危害人民的身體健康并給社會(huì)生活帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。隨著人民生活水平的提高和生活方式的改變,我國(guó)嗜酒者的比率在逐年上升,酒精已成為繼病毒后導(dǎo)致肝損傷的第二大病因[3]。ALD 早期主要呈現(xiàn)的病理改變是肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生脂肪變性,如不干預(yù)則進(jìn)一步會(huì)發(fā)展成肝炎、肝纖維化、肝硬化,甚至肝癌[4-5],酒精已然成為威脅我國(guó)公共健康的重要因素之一。除此之外,飲酒導(dǎo)致的醫(yī)療消費(fèi)也給患者家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。ALD 患者根據(jù)病情的嚴(yán)重程度每人每月所需的治療費(fèi)用為500～ 10 000元[6]。雖然早期的ALD 患者可以通過戒酒使病情得以改善甚至逆轉(zhuǎn),但對(duì)于中晚期患者目前臨床上仍沒有治療的特效藥物,而對(duì)于肝硬化晚期的患者,唯一行之有效的治療手段則是肝移植,但是目前肝源的短缺及肝移植的昂貴費(fèi)用嚴(yán)重制約著手術(shù)的開展[7-8]。肝是一個(gè)“沉默”的器官,由于缺乏痛覺神經(jīng)以及代償功能強(qiáng)大,在ALD 早期往往不會(huì)出現(xiàn)明顯的疼痛感以及肝功能失常的癥狀。這就使得ALD 在發(fā)現(xiàn)時(shí)就往往已經(jīng)處于疾病的晚期階段,從而引發(fā)一系列的并發(fā)癥并造成高死亡率。2015 年我國(guó)約16 萬(wàn)人死于酒精相關(guān)終末期肝病,其中約3 萬(wàn)人死于酒精性肝硬化,約13 萬(wàn)人死于酒精相關(guān)肝癌[9-10]。另外根據(jù)世界衛(wèi)生組織2016 年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,每年由于飲酒導(dǎo)致的相關(guān)死亡人數(shù)為300 多萬(wàn),占全球所有死亡人數(shù)的5.3%[11]。由此可見酒精對(duì)人體的毒害作用不容小覷,開發(fā)早期診斷標(biāo)志物來(lái)評(píng)估個(gè)體對(duì)ALD 的易感性以及研究出新的、有效的ALD 治療藥物或治療措施是目前亟待解決的問題。

近些年隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因組學(xué)的發(fā)展,對(duì)ALD 發(fā)病機(jī)制也有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)[12]。然而到目前為止尚未開發(fā)出確切的早期診斷工具,也還未成功研發(fā)出預(yù)防和有效治療ALD 的特效藥物,形成這一局面的部分原因是目前的動(dòng)物模型還不夠完善。一個(gè)行之有效的動(dòng)物模型不僅可以用來(lái)研究ALD 不同階段的發(fā)病機(jī)制,還能提高發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)的機(jī)率,也能加深對(duì)于酒精性肝損傷的認(rèn)識(shí)。而目前已知的酒精肝模型,沒有一個(gè)模型可以概括人類ALD 的整個(gè)進(jìn)程,這嚴(yán)重制約著對(duì)ALD的認(rèn)識(shí)及研究進(jìn)展[13]。本文綜述不同影響因素對(duì)ALD 動(dòng)物模型建模的影響和目前常見ALD 模型的優(yōu)缺點(diǎn),并根據(jù)目前最新的研究進(jìn)展提出相應(yīng)的建模思路,以期能更好地完善和補(bǔ)充ALD 動(dòng)物模型的病程涵蓋范圍,為該領(lǐng)域的發(fā)展提供借鑒。

1 影響因素

早在20 世紀(jì)50 年代研究者就開始使用嚙齒類動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為動(dòng)物模型來(lái)研究ALD[14]。靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類的ALD 的病理階段非常相似,是公認(rèn)的研究ALD 最理想的模型。但是由于倫理問題以及目前對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物使用的嚴(yán)格管控和成本等阻止了靈長(zhǎng)類動(dòng)物被廣泛應(yīng)用于ALD 的研究。因此,目前研究ALD 首選動(dòng)物仍是嚙齒類動(dòng)物,但實(shí)際上有很多因素會(huì)影響到嚙齒類模型的建成,如品種、性別、年齡等。接下來(lái)本文將從以下幾個(gè)方面對(duì)建模的影響因素進(jìn)行具體的綜述。

1.1 品種

研究發(fā)現(xiàn)與西方國(guó)家的人相比,亞洲國(guó)家的人乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的活性普遍較低,因此在同樣的飲酒情況下,亞洲人的肝更容易受到酒精的毒害[15]。同樣,酒精對(duì)不同品系鼠的肝造成的損傷也具有顯著性差異。轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞損傷的敏感標(biāo)志[16]。ICR 小鼠灌胃1 次體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液(14 mL/kg),處死后發(fā)現(xiàn)血液中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)含量與空白對(duì)照組相比提高了1倍[17]。以同樣的方式給予129/Sv 小鼠體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液(6 g/kg)灌胃處理后,與空白對(duì)照組相比ALT、AST 含量提高了4倍[18]。而同樣的處理只能引起C57BL/6 小鼠血液中ALT 和AST 輕度升高[19]。而在大鼠中,與對(duì)照組相比,使用40%的乙醇溶液(8 g/kg) 灌胃的雄性Wistar 大鼠和使用52%乙醇溶液(8 g/kg)灌胃的雄性SD 大鼠處死后血液中升高的轉(zhuǎn)氨酶的倍數(shù)幾乎相同[20-21]。說明不同品系的大、小鼠對(duì)酒精的耐受程度是不同的,有些品系的大、小鼠在較低濃度的酒精作用下就能產(chǎn)生的明顯的肝損傷,而有些品系的大、小鼠則需要更高的酒精濃度。在建模前從品種、期望性狀、實(shí)驗(yàn)結(jié)果出發(fā)對(duì)不同品系的小鼠進(jìn)行篩選是必要之舉。如ICR 小鼠生長(zhǎng)繁殖快,對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和疾病的抵抗力強(qiáng),可以用此品系的小鼠進(jìn)行相關(guān)藥物的開發(fā)。C57BL/6J 小鼠嗜酒精性高,對(duì)酒精耐受強(qiáng),如果要建立長(zhǎng)期模型適宜選用此品系的小鼠來(lái)建模。

1.2 年齡

隨著年齡的增大,人類的肝結(jié)構(gòu)、肝竇及功能發(fā)生改變,造成肝功能下降,導(dǎo)致了一系列與年齡有關(guān)的肝病的發(fā)展[22]。越來(lái)越多的證據(jù)表明酗酒者患酒精性肝病的風(fēng)險(xiǎn)與其年齡大小有關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)在嚙齒動(dòng)物中也存在相同的患病趨勢(shì)。當(dāng)分別以C57BL/6 老年小鼠(>16 個(gè)月)、中年小鼠(12～ 14 個(gè)月)、青年小鼠(8～ 12 周)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)探究年齡與酒精性肝損傷之間的關(guān)系時(shí),發(fā)現(xiàn)在同樣的喂養(yǎng)模式下,與青年小鼠相比,老年小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的含量更高、脂肪變性更嚴(yán)重、并且觀察到明顯的肝中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維化[24]。而當(dāng)加大劑量和延長(zhǎng)喂養(yǎng)周期時(shí),老年小鼠的肝呈現(xiàn)典型的酒精性肝纖維化改變,而中年小鼠只是增加了纖維化反應(yīng)有關(guān)的mRNA 的表達(dá),并沒有肝纖維化發(fā)生[25]。這些都說明在相同的喂養(yǎng)條件下老年小鼠的炎癥程度更深,并且隨著喂養(yǎng)周期的延長(zhǎng),老年小鼠的疾病進(jìn)程更容易向纖維化發(fā)展。雖然老年小鼠很容易誘發(fā)肝炎癥及肝纖維化,但是隨著年齡的增大,小鼠自身的身體狀況對(duì)建模也會(huì)有很大的影響,因此在建模時(shí)選擇合適年齡的小鼠是一個(gè)十分重要的問題。

1.3 性別

隨著女性社會(huì)地位的提升,女性的飲酒比例逐年上升,而對(duì)于同樣的飲酒量,女性患酒精肝的風(fēng)險(xiǎn)卻高于男性[26]。在一些小鼠中實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)雄性小鼠似乎比雌性小鼠更能抵抗乙醇喂養(yǎng)引起的肝損傷。眾所周知,慢性+狂飲的飲酒模式會(huì)導(dǎo)致顯著的肝損傷,采用此種模式喂養(yǎng)的C57BL/6 小鼠雌性小鼠血清中的ALT 和AST 水平明顯高于雄性小鼠[27]。對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn),與喂食相同酒精含量的雌性小鼠相比雄性在應(yīng)激環(huán)境下表達(dá)了更多對(duì)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用的熱休克蛋白27/70,同時(shí)對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用的IL-6 信號(hào)通路的激活更強(qiáng),肝細(xì)胞增殖加快,這一系列因素減弱了酒精對(duì)雄性小鼠肝的損傷,彌補(bǔ)了由于酒精刺激導(dǎo)致的肝細(xì)胞的損失,使得雌性小鼠的肝損傷比雄性小鼠的更嚴(yán)重[28]。另外有研究表明雌激素是ALD 的輔助致病因子,因?yàn)榕c分泌正常激素水平的雄性小鼠相比,分泌高雌激素和低睪酮的雄性小鼠的肝損傷明顯加重。而在日常中無(wú)論酒精攝入量如何,雄性小鼠的血清雌激素水平總是低于雌性小鼠,也就導(dǎo)致雌性鼠的肝損傷易感性更強(qiáng)[29]。不同性別小鼠的生理情況不同,激素分泌水平也有所區(qū)別,而且小鼠的肝重量在性別之間也存在明顯差異[30]。盡管更明確的影響因素還不確定,但是就目前的研究發(fā)現(xiàn)而言,雌鼠對(duì)ALD 的易感性更強(qiáng),因此在選擇小鼠來(lái)研究乙醇誘導(dǎo)的肝損傷時(shí)要注意考慮性別的影響。

1.4 酒精性飲料類型

隨著生活水平的提高,人們?nèi)粘Ｉ钪锌色@取的酒精飲品的類型也越來(lái)越豐富多樣,常見的有白酒、葡萄酒、黃酒、啤酒等。飲用不同類型的酒精飲料對(duì)人體的傷害有著不同的差異,如在攝入相同酒精的情況下,葡萄酒飲用者患肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)低于白酒和啤酒飲用者[31]。這是因?yàn)槠咸丫浦械姆蔷凭煞志哂锌寡趸奶匦?從而降低酒精對(duì)肝的損傷[32-33]。在小鼠中控制酒精的攝入量相同,分別喂食啤酒(酒精濃度≥5% vol)、黃酒(酒精濃度≥10% vol)、紅葡萄酒(酒精濃度≥12.5% vol)和白酒(酒精濃度≥56% vol),發(fā)現(xiàn)白酒組小鼠肝脂肪樣變和氣球樣變最為嚴(yán)重,啤酒組最輕,并且白酒組還出現(xiàn)了嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死[34]。表明在飲用相同量的酒精的情況下高濃度的酒精飲料對(duì)肝的傷害更大。這可能是因?yàn)榇罅康蜐舛鹊木凭嬃显诖x過程中是水和酒精一起代謝的,當(dāng)血容量擴(kuò)增時(shí),血液中的酒精濃度偏低,在產(chǎn)生相同乙醇脫氫酶和ALDH 的情況下,酒精代謝得更徹底,所以對(duì)肝的危害更小。研究者在選擇酒精飲料造模時(shí)要根據(jù)ALD 不同階段的情況和實(shí)驗(yàn)條件選擇合適濃度的酒精飲料,以達(dá)到最佳的造模效果。

1.5 飲食

除了上述幾種影響因素外,還有很多其他因素也會(huì)影響建模的效果,如飲食、飲酒方式等,飲酒方式會(huì)在下文詳細(xì)探討,對(duì)于飲食來(lái)說,飲食中微量元素的缺乏、高脂食物等會(huì)一定程度的影響酒精性肝病的發(fā)生進(jìn)程。如鋅的缺乏通過損害腸道屏障,使肝中內(nèi)毒素含量升高,誘導(dǎo)一系列炎癥因子的產(chǎn)生最終引發(fā)肝炎癥[35]。而微量元素鎂缺乏也會(huì)加劇酒精誘導(dǎo)的肝損傷[36]。高脂飲食會(huì)增加肥胖的機(jī)率,并且與非高脂飲食的酒精小鼠相比,高脂飲食的酒精小鼠血清ALT 水平更高,增加了患脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[37-38]。另外膽堿具有促進(jìn)脂肪代謝和降低血清中膽固醇的作用,喂食缺乏膽堿的飲食會(huì)使得大鼠出現(xiàn)一定程度的脂肪變性,若進(jìn)一步反復(fù)暴飲酒精則會(huì)引發(fā)肝纖維化[39]。所以,研究者在建模時(shí)要提供足量的營(yíng)養(yǎng)支持,并且要平衡好各組動(dòng)物的攝入熱量,以防出現(xiàn)建模不理想的狀況。

2 典型建模方式

研究表明,飲酒方式顯著影響人類酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制,酒精攝取的劑量以及持續(xù)時(shí)間會(huì)影響酒精性肝病的嚴(yán)重程度。目前應(yīng)用廣泛的喂養(yǎng)模型有急性酒精灌胃模型、慢性酒精喂養(yǎng)模型、慢性+暴飲模型、胃內(nèi)灌注模型以及“二次打擊”模型(見表1)。

2.1 急性酒精灌胃模型

為了克服小鼠天生對(duì)酒精的厭惡,研究者開發(fā)了一個(gè)酒精灌胃模型,直接給小鼠進(jìn)行一定劑量的酒精灌胃。此方法可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)血液酒精濃度(blood alcohol concentration,BAC) 水平逐漸升高[40]。給小鼠進(jìn)行一次30%的酒精(6 g/kg)灌胃,1.5 h 后發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,酒精組小鼠BAC 增加了4 倍多,內(nèi)毒素水平增加了6 倍,肝細(xì)胞輕度壞死[18,41]。當(dāng)給小鼠進(jìn)行3 次酒精灌胃時(shí),小鼠肝出現(xiàn)明顯的泡狀脂滴聚集并伴隨炎癥灶的產(chǎn)生[52]。急性酒精灌胃模型可以模擬沒有飲酒史的人群一次暴飲后酒精對(duì)肝的損傷,以及辨別急性肝損傷與慢性肝損傷的區(qū)別。該模型因?yàn)樵炷r(shí)間短,操作簡(jiǎn)單,在研究酒精性肝損傷的相關(guān)藥物方面有很大的應(yīng)用空間。但是該模型的缺點(diǎn)也是顯而易見的,只能引起血清中AST、ALT 輕微升高以及輕度的脂肪變性,不能模擬更嚴(yán)重的肝損傷形式。

2.2 慢性酒精喂養(yǎng)模型

目前應(yīng)用最多的慢性酒精喂養(yǎng)模型是由科學(xué)家Lieber等[53]創(chuàng)立的Lieber-DeCarli 液體飲食模型。用加工成粉末的飼料加水勾兌成液體飼料,對(duì)于酒精組小鼠來(lái)說則是在液體飼料中添加一定濃度的酒精,讓小鼠每天有一定量的酒精攝入。這個(gè)模型很好的模仿了人類慢性飲酒的模式。10 d 酒精飼料喂養(yǎng),能引起小鼠血清ALT 和AST 輕度升高,但是差異不顯著[19]。而當(dāng)慢性酒精喂養(yǎng)延長(zhǎng)到4 周時(shí),小鼠肝出現(xiàn)了明顯的脂肪聚集,還伴有微囊泡和大囊泡脂肪變性,血清中ALT 和AST 顯著升高[42-43]。有趣的是,當(dāng)這種喂養(yǎng)延長(zhǎng)到16 周時(shí),通過組織切片可以觀察到酒精組小鼠肝內(nèi)有大量脂滴聚集,肝中甘油三酯(triglyceride,TG)和總膽固醇(total cholesterol,TC)的含量是對(duì)照組的4倍[35]。該模型可以規(guī)避小鼠天生對(duì)酒精的厭惡情況,并且小鼠死亡率低、操作簡(jiǎn)單,同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)隨著酒精飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)肝的損傷也越來(lái)越嚴(yán)重。但是可能因?yàn)樾∈蟮臄z食時(shí)間長(zhǎng),該模型只是停留在ALD的早期,只會(huì)導(dǎo)致輕微的脂肪變性以及少量的炎癥而更嚴(yán)重的纖維化則沒有出現(xiàn)。

2.3 慢性+暴飲模型

前人的研究已經(jīng)揭示慢性酒精攝入或急性重復(fù)狂飲只會(huì)導(dǎo)致肝輕微脂肪變性。但是大多數(shù)因肝病住院的患者都是近期有暴飲現(xiàn)象的酗酒者,這類飲酒模式是進(jìn)一步增加肝損傷的誘因。高斌團(tuán)隊(duì)開發(fā)出的慢性+暴飲模型也即Gao-binge 模型很巧妙的模擬的這類飲酒模式[54]。筆者團(tuán)隊(duì)先前的研究發(fā)現(xiàn),10 d 慢性飲酒+一次暴飲可以給小鼠肝造成典型的損傷如:顯著升高的血清轉(zhuǎn)氨酶水平、TG 水平、TC 水平等[55],這與Shukla等[44]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。另外在4 周的慢性飲酒+2 周的酒精灌胃模型中,小鼠的肝小葉中心靜脈周圍出現(xiàn)明顯的脂滴聚集和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[56]。而肝內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是肝炎的一個(gè)顯著臨床特征,與酒精性肝炎的發(fā)生密切相關(guān)[45,57]。當(dāng)將慢性乙醇喂養(yǎng)期延長(zhǎng)至8～ 12 周,并也加上單劑量或者多劑量乙醇灌胃后發(fā)現(xiàn)該模型引起更嚴(yán)重的酒精性脂肪肝炎(alcoholic steatohepatitis,ASH)和輕度肝纖維化[19]。該模型是結(jié)合Lieber-DeCarli 液體飲食模型和口服灌胃模型來(lái)模擬大多數(shù)肝病患者的飲酒模式,它不僅操作簡(jiǎn)單,而且還能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的脂肪變性、血清ALT 和肝炎癥反應(yīng),在ALD 發(fā)病機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)的開發(fā)中得到廣泛的應(yīng)用。

2.4 胃內(nèi)灌注模型

胃內(nèi)灌注模型是T-sukamoto-French 開發(fā)的一種通過手術(shù)在胃內(nèi)插管直接輸注的喂養(yǎng)模式,也稱TF 模型[58]。這個(gè)模型需要在鼠的頸后部和腹中部各做一個(gè)皮膚切口,導(dǎo)管從頸后部的皮膚切口進(jìn)入,插進(jìn)前胃,通過導(dǎo)管來(lái)控制鼠的酒精攝入[16]。該模型可以通過導(dǎo)管隨意控制食物的種類和含量,以創(chuàng)建所需的肝損傷模型。研究表明在灌注4 周時(shí)就能出現(xiàn)高水平的酒精中毒,表現(xiàn)為BCA 的含量達(dá)到350 mg/dL,有的甚至超過400 mg/dL[46]。如果加大酒精的攝入量并聯(lián)合高脂飲食培養(yǎng),大鼠在4 周內(nèi)就會(huì)開始出現(xiàn)肝纖維化,當(dāng)培養(yǎng)到16 周時(shí)所有的實(shí)驗(yàn)大鼠都能觀察到肝纖維化[47]。若在該情況下繼續(xù)在食物中添加羰基鐵,有少數(shù)大鼠則會(huì)發(fā)展為肝硬化[59]。雖然TF 模型可以通過導(dǎo)管使體內(nèi)保持較高的酒精含量以及更改食物參數(shù)從而產(chǎn)生一系列肝損傷,如肝脂肪變性、肝硬化等,但是建立該模型需要很高的人力和物力成本,如高超的手術(shù)操作能力、嚴(yán)格的術(shù)后護(hù)理,以防止鼠在建模初期因感染致死,另外在造模過程中也要密切監(jiān)測(cè)鼠的健康狀況以及生理體征。這些嚴(yán)苛的條件限制了該模型的廣泛運(yùn)用。

2.5 “二次打擊”模型

大多數(shù)研究表明,單純的酒精誘導(dǎo)只能誘發(fā)肝脂肪變性或者輕度的肝炎,而對(duì)于更嚴(yán)重的肝炎或是肝纖維化都不能用單純的慢性酒精來(lái)誘導(dǎo)。因此有研究者開發(fā)了二次打擊模型,即在酒精誘發(fā)肝產(chǎn)生一定損傷后,再次引入另外一種因素來(lái)達(dá)到加速肝損傷的目的[60]。四氯化碳單獨(dú)作用不能引發(fā)肝纖維化,但當(dāng)它和酒精聯(lián)合使用時(shí)可以引發(fā)明顯的肝纖維化以及中度炎癥,并且該模型與人的酒精性肝纖維化和炎癥的關(guān)系模式基本相似[48,50-51]。另外,小鼠以高脂+急性酒精暴食的方式喂養(yǎng)3 d就會(huì)導(dǎo)致肝損傷以及觀察到中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),當(dāng)這個(gè)喂養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)至3 個(gè)月時(shí)則會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的脂肪性肝炎[49]。除了以上因素外還可以通過注射脂多糖、喂食缺乏膽堿的飲食等來(lái)獲得更嚴(yán)重的肝損傷模型[39,61-62]。概括來(lái)說,“二次打擊”模型可以很容易的誘發(fā)肝炎和肝纖維化,但是其局限性也很明顯,因?yàn)樗嬖诜蔷凭砸蛩?所以所取得的結(jié)果可能與單純酒精誘導(dǎo)的病變有所不同,對(duì)其病變機(jī)制的闡述也應(yīng)更加謹(jǐn)慎。

3 新型建模方式

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因編輯已經(jīng)成為建立人類疾病動(dòng)物模型的重要手段,研究者可以通過向動(dòng)物添加外源基因信息或者敲除某些內(nèi)源基因以達(dá)到促進(jìn)或抑制某些疾病相關(guān)基因表達(dá)的作用。過表達(dá)細(xì)胞色素P4502 酶1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)基因的酒精小鼠體內(nèi)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和重組有關(guān)的基因表達(dá)增多(如角蛋白8,細(xì)胞角蛋白8 是Mallory 小體中的主要角蛋白之一,它體現(xiàn)著酒精性肝病和酒精性肝炎的特征[63])而與代謝相關(guān)的基因表達(dá)減少(如膽固醇代謝),并且還能觀察到炎癥灶[64]。這說明過表達(dá)CYP2E1 會(huì)加重肝損傷,如果要達(dá)到治療ALD 的目的或許可以從抑制該基因表達(dá)或者敲除其入手。另外對(duì)表觀遺傳調(diào)節(jié)因子去乙?；?(sirtuin 6,SIRT6)基因進(jìn)行修飾,發(fā)現(xiàn)SIRT6 敲除的酒精小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷,尤其是氧化應(yīng)激和炎癥顯著增加。同時(shí)與酒精性肝炎患者一樣,EF-Sirt6 KO(ethanol-fed sirt6 knockout)小鼠肝中金屬硫蛋白(metallothionein,MT)1 和2 基因表達(dá)下調(diào)。當(dāng)進(jìn)一步在肝中過表達(dá)Mt1 則發(fā)現(xiàn)可以顯著改善Sirt6 KO 小鼠由于酒精導(dǎo)致的肝損傷。而在肝中過表SIRT6 也會(huì)出現(xiàn)與過表達(dá)Mt1 同樣的現(xiàn)象,這表明Sirt6 及Mt1 和Mt2 的表達(dá)增強(qiáng)了肝防御系統(tǒng)對(duì)酒精毒性的抵抗力[65]。在未來(lái)SIRT6 很可能成為酒精肝的一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)?；蚓庉嬆Ｐ瓦\(yùn)用基因編輯技術(shù)不僅可以針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全身進(jìn)行基因編輯,也能特異性的針對(duì)某個(gè)組織、器官進(jìn)行編輯,從而高效的對(duì)ALD 進(jìn)行研究,精準(zhǔn)的掌握ALD 的發(fā)病機(jī)制以及相關(guān)代謝通路,為尋找新的治療靶點(diǎn)提供新途徑。而它的缺點(diǎn)在于不能預(yù)見相關(guān)基因的敲除或過表達(dá)是否會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生致命性傷害,如早死、胚胎致死等。

4 未來(lái)可能的建模方向

慢性+暴飲模型可以很好的建立ASH 模型,引發(fā)嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。而ASH 患者的嚴(yán)重程度和死亡率與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著相關(guān)。在酒精處理的小鼠中,肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量趨化因子配體1 (chemokines 1,CXCL1)[66]。CXCL1 是中性粒細(xì)胞募集趨化因子,它通過趨化因子受體2 促進(jìn)中性粒細(xì)胞滲入肝,增加肝中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),加劇肝損傷。Hwang等[67]在高脂飲食(high-fat diet,HFD) 喂養(yǎng)的小鼠肝中過表達(dá)CXCL1,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)小鼠肝中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加,并且促進(jìn)了脂肪變性到非酒精性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)這一進(jìn)程,而正常飼料喂養(yǎng)的CXCL1 肝過表達(dá)小鼠可能因?yàn)槿狈χ咀冃院屠w維化并沒有產(chǎn)生NASH 表型。另外在HFD-CXCL1肝過表達(dá)小鼠中還發(fā)現(xiàn)了與人類同源的48 個(gè)炎癥和纖維化基因表達(dá)的上調(diào),這種建模方式完整的模擬了人類NASH 的表達(dá)譜。未來(lái)也許可通過EtOHCXCL1 肝過表達(dá)來(lái)建立酒精性肝炎模型,從而完整模擬人類ASH 的表達(dá)譜和尋找潛在的治療靶點(diǎn)。

5 總結(jié)與展望

綜上所述,小鼠的品種、年齡、性別、飲用酒精的類型對(duì)酒精性肝損傷有不同程度的影響,今后設(shè)計(jì)和解釋酒精性肝病動(dòng)物模型時(shí)應(yīng)考慮這些因素以選擇到合適的小鼠品種[68]。小鼠以不同方式攝入酒精會(huì)對(duì)肝產(chǎn)生不同程度的損傷,每種模式都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性,根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求選擇合適的喂養(yǎng)模型會(huì)給實(shí)驗(yàn)進(jìn)程帶來(lái)事半功倍的效果。需要注意的是嚙齒類動(dòng)物和人類在生理學(xué)和病理學(xué)方面存在明顯的物種差異,如嚙齒類動(dòng)物酒精分解速度是人類的5 倍、嚙齒類動(dòng)物更能抵抗內(nèi)毒素帶來(lái)的炎癥反應(yīng)等,如果要達(dá)到與人類相同的肝損傷可能需要更大的酒精刺激,所以不能直接將小鼠的結(jié)果轉(zhuǎn)換成人類的結(jié)果[69]。

不同模型以其自身的特點(diǎn)應(yīng)用于不同程度和不同階段的ALD 的研究,是ALD 的發(fā)病機(jī)制、診斷、預(yù)后、標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的有力研究工具。目前已經(jīng)建立的ALD 動(dòng)物模型還不能復(fù)制人類ALD全譜,而晚期ALD 如纖維化和肝硬化也不能僅僅通過酒精來(lái)誘導(dǎo),需要通過繼發(fā)性的損傷才能實(shí)現(xiàn),所以我們還需要改進(jìn)和開發(fā)新的ALD 模型,從而在更大相關(guān)程度上模擬人類的ALD譜[70]。