異鼠李素通過上調(diào)自噬水平預防巨噬細胞脂質(zhì)代謝紊亂

王婷婷，張鵬珂，史敏，于倩怡，喬嬌，薛玉剛

急性心肌梗死是動脈粥樣硬化性心血管疾病的主要并發(fā)癥，其致死率較高，為13.2%［1］。鑒于不穩(wěn)定斑塊的治療策略有限，有必要開發(fā)新的治療手段來預防斑塊形成，而不是治療已經(jīng)形成的斑塊［2］。動脈粥樣硬化的形成主要是由于巨噬細胞中脂質(zhì)代謝紊亂，導致脂質(zhì)轉(zhuǎn)運出巨噬細胞發(fā)生障礙及巨噬細胞中存在多余的脂質(zhì)沉積，進而導致泡沫細胞的形成［3］。而泡沫細胞在血管內(nèi)皮下的不斷形成及積聚可促進斑塊的形成和進展，且脂質(zhì)核心不斷擴大可導致不穩(wěn)定斑塊的形成［4］。因此，探討糾正巨噬細胞中脂質(zhì)代謝紊亂從而抑制泡沫細胞形成的機制有助于抑制不穩(wěn)定斑塊的形成，從而降低急性心血管事件的發(fā)生率。

異鼠李素是一種主要從大量果實、花等植物中提取的黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，其具有降血脂、擴張冠狀動脈、抗氧化等重要作用［5］。研究顯示，真核細胞中維持細胞器和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的一種重要的細胞過程被稱為“自噬”［6］。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可通過升高SIRT6來減輕巨噬細胞脂質(zhì)代謝障礙，進而抑制泡沫細胞形成［7］，但自噬是否參與這一病理過程目前尚不得而知。基于此，本研究旨在探討異鼠李素預防巨噬細胞脂質(zhì)代謝紊亂的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2022年1—6月。

1.2 實驗細胞 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7細胞）購自美國ATCC公司。

1.3 主要實驗試劑與儀器 異鼠李素（批號：MED80003，純度≥9 8%）購自湖南康都制藥有限公司，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）購自廣州市益源生物科技有限公司，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）Ⅱ抗體（貨號：AB192890）、P62抗體（貨號：AB109012）、GAPDH抗體（貨號：#8864S）購自美國CST公司，山羊抗兔IgG二抗購自西安壯志生物科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及分組 采用含有15%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞，培養(yǎng)環(huán)境為消毒滅菌細胞孵箱。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，將其分為對照組（不干預）、動脈粥樣硬化組（采用50 μg/ml的ox-LDL干預24 h［8］）、動脈粥樣硬化+異鼠李素組（采用20 μmol/L的異鼠李素孵育8 h，之后采用50 μg/ml的ox-LDL干預24 h）。

1.4.2 油紅O染色檢測巨噬細胞中脂質(zhì)含量 收集各組RAW264.7細胞，固定15 min后根據(jù)試劑盒說明書進行油紅O染色，然后在倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞中脂質(zhì)含量。實驗獨立重復3次。

1.4.3 Western blot法檢測巨噬細胞中自噬標志物（LC3Ⅱ、P62）表達水平 收集各組RAW264.7細胞，用PBS洗滌并充分消化，提取蛋白后進行聚丙酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；加入LC3Ⅱ、P62、GAPDH抗體（實驗中所需LC3Ⅱ、P62、GAPDH抗體提前按1∶100的比例配好），用脫脂奶粉封固后于4 ℃冰箱中孵育過夜；滴加山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，采用化學發(fā)光法、利用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)檢測巨噬細胞中LC3Ⅱ、P62表達水平。實驗獨立重復3次。

1.4.4 透射電鏡觀察巨噬細胞中自噬小體數(shù)目 收集各組RAW264.7細胞，送往空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院電鏡室制備標本，在透射電鏡下觀察自噬小體數(shù)目。實驗獨立重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 5.01軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞中脂質(zhì)含量 油紅O染色結(jié)果顯示，對照組巨噬細胞中未發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)沉積；動脈粥樣硬化組巨噬細胞中存在明顯的脂質(zhì)沉積現(xiàn)象；與動脈粥樣硬化組比較，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中脂質(zhì)含量明顯減少，見圖1。

圖1 油紅O染色檢測各組巨噬細胞中脂質(zhì)含量（×200）Figure 1 Lipid content of macrophages in each group detected by oil red O staining

2.2 巨噬細胞中自噬標志物表達水平 三組巨噬細胞中LC3Ⅱ、P62表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平低于對照組，P62表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平高于動脈粥樣硬化組，P62表達水平低于動脈粥樣硬化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組巨噬細胞中自噬標志物表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of autophagy markers of macrophages in three groups

表1 三組巨噬細胞中自噬標志物表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of autophagy markers of macrophages in three groups

注：LC3=微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與動脈粥樣硬化組比較，P＜0.05

組別LC3ⅡP62對照組1.000±0.0531.000±0.062動脈粥樣硬化組0.193±0.136a4.086±0.436a動脈粥樣硬化+異鼠李素組0.586±0.096ab2.273±0.105ab F值159.60351.60 P值＜0.001＜0.001

2.3 巨噬細胞中自噬小體數(shù)目 透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對照組巨噬細胞中可觀察到自噬小體；與對照組相比，動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數(shù)目明顯減少；與動脈粥樣硬化組相比，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數(shù)目增多，見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組巨噬細胞中自噬小體數(shù)目Figure 2 The number of autophagosomes in macrophages in each group observed by transmission electron microscopy

3 討論

心血管疾病是影響全世界人民健康的最主要問題之一，患者死亡率很高，因而早期預防和治療心血管疾病尤為重要，而動脈粥樣硬化是心血管疾病最常見的原因之一［9］。眾所周知，動脈粥樣硬化的形成是一個復雜的病理過程，包括脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥、氧化應激、自噬功能障礙和線粒體功能障礙，其中脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)揮著關(guān)鍵作用［9］。巨噬細胞攝取脂質(zhì)與清除脂質(zhì)的作用失衡將導致多余的脂質(zhì)積聚，從而引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂，進而導致泡沫細胞形成［10-11］；此外，脂質(zhì)超負荷會阻礙巨噬細胞從斑塊中遷移，導致其發(fā)生凋亡和壞死，從而加重斑塊的不穩(wěn)定性［12］。因此，糾正巨噬細胞脂質(zhì)代謝紊亂是抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的有效方法。既往研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素具有減輕氧化應激導致的內(nèi)皮功能障礙等多種生物學作用［2］，異鼠李素抗動脈粥樣硬化的作用主要體現(xiàn)在抑制ox-LDL形成、內(nèi)皮細胞損傷、脂質(zhì)堆積、平滑肌細胞增殖及遷移等［13］，然而其具體機制尚不清楚。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可減輕巨噬細胞脂質(zhì)代謝障礙，進而抑制泡沫細胞形成［7］。本研究旨在探討異鼠李素預防巨噬細胞脂質(zhì)代謝紊亂的具體機制。

本研究油紅O染色結(jié)果顯示，對照組巨噬細胞中未發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)沉積；動脈粥樣硬化組巨噬細胞中存在明顯的脂質(zhì)沉積現(xiàn)象；與動脈粥樣硬化組比較，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中脂質(zhì)含量明顯減少；提示異鼠李素可以減少脂質(zhì)在巨噬細胞中的沉積，進而預防泡沫細胞的形成。

研究發(fā)現(xiàn)，遺傳、飲食和藥物均可以激活自噬，而自噬功能障礙會導致動脈粥樣硬化，進而引起心血管疾?。?4］。自噬功能障礙可發(fā)生在各種類型細胞中，主要為血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞，其中巨噬細胞自噬功能障礙在動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中發(fā)揮著重要作用［15］。研究顯示，自噬底物P62可連接LC3和泛素化的底物，隨后被整合到自噬體中，并在自噬溶酶體中被降解［9］。本研究結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平低于對照組，P62表達水平高于對照組；動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平高于動脈粥樣硬化組，P62表達水平低于動脈粥樣硬化組，提示異鼠李素能夠上調(diào)巨噬細胞中自噬水平。此外，本研究透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對照組巨噬細胞中可觀察到自噬小體；與對照組相比，動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數(shù)目明顯減少；與動脈粥樣硬化組相比，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數(shù)目增多，提示異鼠李素能夠增加巨噬細胞中自噬小體的數(shù)目。以上研究結(jié)果表明，異鼠李素可能通過上調(diào)巨噬細胞自噬水平來促進脂質(zhì)通過自噬-溶酶體途徑進行降解，從而減少脂質(zhì)沉積，預防脂質(zhì)代謝紊亂，進而預防泡沫細胞形成。

綜上所述，異鼠李素可能通過上調(diào)巨噬細胞自噬水平來預防脂質(zhì)代謝紊亂，進而預防泡沫細胞形成。本研究為抑制動脈粥樣硬化斑塊形成、促進斑塊穩(wěn)定性提供了新的治療方向。但本研究為基礎(chǔ)研究，尚需要臨床試驗進一步驗證本研究結(jié)論。此外，臨床上冠心病合并糖尿病患者常同時存在糖脂代謝紊亂［16］，異鼠李素是否可通過上調(diào)巨噬細胞自噬水平來調(diào)控糖脂代謝紊亂還需要進一步研究。

致謝：感謝空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院的老師對本實驗給予的技術(shù)支持及設(shè)備支持。

作者貢獻：王婷婷、薛玉剛進行研究的構(gòu)思與設(shè)計、可行性分析及文章的撰寫，負責文章的質(zhì)量控制及審校；王婷婷、張鵬珂進行文章的修訂；于倩怡、喬嬌進行數(shù)據(jù)收集、整理；史敏進行結(jié)果分析與解釋；薛玉剛對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。