白參菌茶降脂活性評價及活性成分來源的初步研究

潘聯(lián)云，趙 碧，楊方慧，馬玉青，劉本英

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所/云南省茶學(xué)重點實驗室，云南 勐海 666200

現(xiàn)有研究表明，茶葉及茶葉中的生物活性成分具有多種保健功效，如降血脂、降血糖、抗氧化、保肝護(hù)肝等[1]。茶葉接種有益微生物可提升茶葉品質(zhì)及功效，如接種冠突散囊菌可提升茶葉中多糖含量，增強(qiáng)抗氧化活性[2]。白參菌（SchizophyllumcommuneFr.）是一種食藥兼用名貴珍稀菇菌，別名裂褶菌、白蕈、樹花、雞毛菌[3]。隸屬真菌門（Eumycophyta）擔(dān)子菌綱（Basidiomyeetes）傘菌目（Agarieales）裂褶菌科（Sehizophyllaceae）裂褶菌屬（Schizophyllum）[4]。白參菌具有清肝明目、滋補(bǔ)強(qiáng)身的功效，可治療小兒盜汗、婦科疾病、神經(jīng)衰弱及頭昏耳鳴等癥狀，多糖是其主要活性功能成分。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所利用普洱茶渥堆發(fā)酵工藝，以改善中低檔茶葉品質(zhì)為目的，針對白參菌與茶共生的特點，用秋季修剪的嫩梢及半成熟葉制作曬青干毛茶，開發(fā)具有茶和菌雙重特色的茶制品——白參菌茶[5,6]。

粗老的曬青茶原料經(jīng)白參菌發(fā)酵后品質(zhì)特征得到顯著改善：湯色由黃綠轉(zhuǎn)變?yōu)槌燃t，滋味變醇，口感協(xié)調(diào)[6]。生化成分檢測分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過與白參菌發(fā)酵后茶葉中表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯的含量均大幅下降，降低比例高達(dá)80%以上，從而減少茶湯苦澀，提高口感[7]。通過以茶葉為培養(yǎng)基種植白參菌發(fā)現(xiàn)，與普通人工種植和野生生長的白參菌相比，粗老曬青毛茶作為基質(zhì)培養(yǎng)的白參菌氨基酸、多糖以及鋅、鉀、磷含量顯著增加[8]。可見，白參菌不僅可改善粗老毛茶的感官品質(zhì)，也可提高茶葉的保健功效。本研究使用模式生物秀麗隱桿線蟲，考察白參菌茶降脂減肥和抗衰老等方面的保健功效，并對其功效活性物質(zhì)來源進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料

曬青毛茶和白參菌茶（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所制備）；白參菌（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所篩選，在實驗室–20℃條件下保存）；線蟲品系N2和大腸桿菌E.coliOP50（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）。

1.1.2 儀器與試劑

主要儀器：正置熒光顯微鏡，奧林巴斯公司；SMZ168型體視顯微鏡，麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司；leica/MI65C體視顯微鏡，德國leica公司；SW-CJ-1FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-500F型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；超純水器，Barnstead公司；ZHWY-211C型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司。

主要試劑：油紅O、Triton X-100、甘油，Sigma公司；膽固醇，Genview公司；無水乙醇、異丙醇、磷酸二氫鉀、三水合磷酸氫二鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈣、硫酸鎂、氫氧化鈉、葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LP2001酵母粉、P0137蛋白胨，OXID公司；瓊脂、PBS磷酸鹽緩沖劑（pH 7.4），鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲及其食物E.coliOP50的培養(yǎng)

線蟲培養(yǎng)條件：溫度20℃±0.5℃，濕度40%～60%，食物為滅活E.coliOP50。秀麗隱桿線蟲及其食物E.coliOP50培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。本試驗中線蟲干預(yù)時間為幼蟲期到成蟲期（產(chǎn)卵期）。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲同步化

采用次氯酸鈉法，方法參考Eirini Lionaki和Nektarios Tavernarakis進(jìn)行[10]。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)測定

采用油紅O（Oil Red O, ORO）染色法，按前人報告[11]，用PBST（1×PBS和0.01% Triton X-100混合液）洗下待染色秀麗隱桿線蟲，懸浮沉淀2次，吸去上清留沉淀的線蟲；在沉淀中加入500 μL 40%異丙醇和100 μL油紅O染色液，室溫?fù)u動染色30 min；離心去上清液，PBST清洗3次去浮色；將染色后的秀麗隱桿線蟲置于載玻片上，使用顯微鏡拍照；每個實驗組3次以上生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)線蟲大于8條。使用Image pro plus（IPP）測量染色后秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)的積分光密度和蟲體總面積（Area），以平均光密度表示線蟲脂肪含量：MOD = IOD/Area。

1.2.4 秀麗隱桿線蟲壽命試驗

用不同濃度水提物（50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和500 mg/L）作為處理組對同步化N2線蟲干預(yù)至成蟲期，對照組不做任何處理。每天記錄線蟲的死亡數(shù)目。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為：用Picker輕輕接觸線蟲的蟲體無反應(yīng)。對于在轉(zhuǎn)移過程中丟失的線蟲和因爬到培養(yǎng)皿壁而死亡的線蟲作事故丟失處理，在統(tǒng)計處理中作為“Censored”。

1.2.5 白參菌培養(yǎng)和菌落測量

將白參菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d進(jìn)行活化，使用打孔器取5 mm活化后的白參菌，菌餅分別轉(zhuǎn)接到正常PDA平板和含有茶水添加的PDA平板上，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)溫度均為28℃，避光培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0比較試驗數(shù)據(jù)差異性，使用單變量-單因素方差分析顯著性。若方差齊性相等（Sig＞ 0.05），使用LSD法分析顯著性；若方差齊性不相等（Sig＜ 0.05），使用Tamhane法分析顯著性。使用軟件Origin 9.0作圖。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（x-±SEM）表示?！?”表示p＜ 0.05，“**”表示p＜ 0.01，“***”表示p＜ 0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 白參菌茶對秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)和壽命的影響

與對照組相比，在正常飲食條件下，50 mg/L和100 mg/L白參菌茶水提物處理降低線蟲脂質(zhì)含量的作用不顯著，200 mg/L、500 mg/L和1000 mg/L處理分別降低線蟲脂質(zhì)18.6%（p＜0.01）、23.6%（p＜ 0.01）和33.2%（p＜ 0.01）（圖1-A和圖1-B）。在實驗濃度范圍內(nèi)，白參菌茶的降脂作用呈濃度依賴性，與給茶濃度成正比。

圖1 白參菌茶的生物活性Figure 1 The biological activity of Schizophyllum fermented tea

在高糖飲食條件下，高糖飲食顯著增加秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)含量75.8%，白參菌茶干預(yù)組分別降低高糖飲食線蟲脂質(zhì)28.7%（50 mg/L）（p＜0.01）、43.9%（100 mg/L）（p＜ 0.01）、60.9%（200 mg/L）（p＜ 0.01）、56.2%（500 mg/L）（p＜ 0.01）和42.4%（1000 mg/L）（p＜ 0.01），實驗中所有濃度的白參菌茶水提物對高糖飲食線蟲均呈現(xiàn)顯著降脂效果（圖1-A和圖1-B）。通過壽命實驗研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，所有實驗濃度的白參菌茶均不影響秀麗隱桿線蟲的平均健康壽命（圖1-C）。

2.2 白參菌茶降脂活性來源

由于白參菌發(fā)酵茶兼具白參菌和茶葉的雙重特色，其功能活性物質(zhì)來源也可能兼有菌成分和茶成分。研究使用勐海大葉茶曬青茶、白參菌茶和發(fā)酵白參菌茶的粗老原料分別飼喂秀麗隱桿線蟲，發(fā)現(xiàn)曬青茶和白參菌茶均顯著降低秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)，粗老原料對秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)無顯著降低作用（圖2-A和B）。壽命實驗也表明，曬青茶和粗老原料對線蟲平均健康壽命無影響（圖2-C和D）。這說明白參菌發(fā)酵茶葉能夠提高其降脂活性，但不影響茶葉延長線蟲壽命的作用。

圖2 勐海大葉茶、粗老原料茶和白參菌茶的降脂活性比較Figure 2 Comparison of the lipid-lowering effect of Menghai large leaf sun-dried green tea, rough raw and Schizophyllum fermented tea

由于毛茶原料在發(fā)酵過程中各種內(nèi)含成分均下降[4,5]，推測白參菌茶的活性成分可能主要來自菌的成分。使用白參菌茶和茶為基質(zhì)培養(yǎng)的白參菌分別飼喂秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn)，在正常飲食和高糖飲食條件下白參菌都具有和白參菌茶基本相同的降脂活性（圖3），表明白參菌茶的降脂活性主要來自白參菌。

圖3 白參菌茶和白參菌的降脂活性比較Figure 3 Comparison of the lipid-lowering effect of Schizophyllum fermented tea and Schizophyllum

2.3 茶葉水提物抑制白參菌生長且誘導(dǎo)菌絲分泌物情況

為進(jìn)一步研究白參菌茶發(fā)酵過程中菌的變化，本試驗將5 mm活化后的白參菌菌餅分別接種于正常PDA平板（對照組）和含粗老曬青茶水提物（100 g/L）PDA平板（干預(yù)組）上，連續(xù)培養(yǎng)5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)到第4天時，干預(yù)組的白參菌菌落面積與茶葉水提物濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，白參菌菌落生長隨著茶葉水提物濃度增加而顯著被抑制（圖4-A和圖1-B）。將對照組菌落生長速率設(shè)為1，與對照組相比，干預(yù)組的白參菌菌落生長速率顯著降低，生長速率與茶葉濃度負(fù)相關(guān)（圖4-C）。通過接種白參菌也發(fā)現(xiàn)，茶葉培養(yǎng)基種植的白參菌子實體顯著小于野生白參菌和人工接種的白參菌（圖4-D）。上述結(jié)果表明，茶葉水提物能夠顯著抑制白參菌菌落的生長。

圖4 茶葉對白參菌生長的影響Figure 4 The effect of tea on the growth of Schizophyllum

進(jìn)一步使用顯微鏡觀察茶葉水提物對白參菌菌絲形態(tài)變化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，茶葉水提物干預(yù)組的白參菌菌絲產(chǎn)生大量分泌物，隨著茶葉水提物濃度的增加，白參菌菌絲分泌物的數(shù)量呈現(xiàn)先增后減（圖5-A和圖5-C）。該分泌物呈現(xiàn)水滴樣，懸掛于菌絲之間，其體積與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)，且通過機(jī)械力作用（敲打和反復(fù)搖晃培養(yǎng)皿）不能使該分泌物掉落（圖5-B和圖5-D）。根據(jù)上述結(jié)果，我們認(rèn)為白參菌菌絲產(chǎn)生的分泌物可能是茶葉水提物抑制其生長所分泌的次生代謝物，這些代謝物可能與白參菌茶活性相關(guān)。

圖5 茶葉誘導(dǎo)白參菌菌絲產(chǎn)生分泌物Figure 5 Tea induce the production of secreta from mycelia of Schizophyllum

3 討論

云南是中國四大茶產(chǎn)區(qū)之一，茶產(chǎn)業(yè)是云南省傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)和高原特色農(nóng)業(yè)的重要組成部分[12]。但云南省茶葉存在精深加工類產(chǎn)品開發(fā)不夠、茶葉出口產(chǎn)品始終處于茶葉產(chǎn)業(yè)鏈中下游等問題，加之夏秋茶質(zhì)量較差、效益低、利用率不高[13]，開發(fā)茶葉深加工產(chǎn)品及提高夏秋茶利用率是云南省茶產(chǎn)業(yè)的未來發(fā)展方向。研究表明，茶葉通過白參菌發(fā)酵能夠提高其品質(zhì)、活性成分和保健功能?？梢?，利用白參菌發(fā)酵茶葉是一種提高夏秋茶利用率的新的途徑和方法。

本試驗研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物評價白參菌茶功能活性，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵白參菌茶的粗老原料對秀麗隱桿線蟲沒有降脂作用，而白參菌茶的降脂活性與勐海大葉種曬青茶相當(dāng)，說明白參菌發(fā)酵茶葉能夠增加其降脂活性。白參菌茶、粗老原料和勐海大葉種曬青茶都不影響秀麗隱桿線蟲壽命，表明白參菌茶原料及產(chǎn)品安全無毒。

使用茶葉栽培的白參菌和白參菌茶飼喂秀麗隱桿線蟲，發(fā)現(xiàn)白參菌的降脂效果和白參菌茶一致。結(jié)合我們之前的研究結(jié)果，茶葉栽培的白參菌子實體多糖含量顯著高于野生白參菌和人工普通種植的白參菌，而多糖本身具有降脂活性[14]，進(jìn)一步說明白參菌茶的降脂活性極大程度可能來源于白參菌。但由于白參菌成品茶中菌的含量并不占多數(shù)，且菌和茶無法徹底分離，因此我們無法確認(rèn)白參菌發(fā)酵后的茶葉（純茶部分）是否具有功能活性，這有待進(jìn)一步研究。

通過對菌落大小和菌絲觀察發(fā)現(xiàn)，茶葉能夠抑制白參菌生長且誘導(dǎo)白參菌菌絲產(chǎn)生水滴樣分泌物。推測這些分泌物可能是菌絲響應(yīng)茶葉成分的誘導(dǎo)而自分泌產(chǎn)生分泌物，或者是茶葉成分作為菌絲某些代謝產(chǎn)物的前體，通過微生物作用轉(zhuǎn)化并在菌絲上形成。由于分泌物較小，無法直接收集，因此關(guān)于分泌物的具體成分有待進(jìn)一步研究。

綜上，白參菌茶具有一定的降脂活性，其活性來源可能主要來自白參菌。