脹果甘草花粉生活力測定及甘草的雜交育種

謝姿雁, Botir Khaitov, 楊天順, 李重, 李勇青,6*, 王瑛,6*

脹果甘草花粉生活力測定及甘草的雜交育種

謝姿雁1,2,3, Botir Khaitov4, 楊天順1,2, 李重5, 李勇青1,2,3,6*, 王瑛1,2,3,6*

(1. 中國科學(xué)院華南植物園, 中國科學(xué)院華南農(nóng)業(yè)植物分子分析與遺傳改良重點實驗室, 廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點實驗室, 廣州 510650；2. 華南國家植物園, 廣州 510650；3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4., Tashkent 100084, Uzbekistan；5. 百瑞源枸杞股份有限公司，銀川 750200；6. 中國科學(xué)院核心植物園, 廣州 510650)

雜交育種是最為傳統(tǒng)的選育新品種的方式之一，花粉生活力能夠影響其中遺傳物質(zhì)的傳遞。脹果甘草是3種藥典收錄的甘草之一，具有許多特殊活性成分。通過TTC法和離體萌發(fā)法對2個脹果甘草()種質(zhì)資源GJJ-7和GJJ-9花朵開放5個時期(a～e)的花粉生活力進(jìn)行測定。結(jié)果表明，GJJ-7花粉生活力趨勢在5個時期呈現(xiàn)波浪型，在a、d時期達(dá)到最高；GJJ-9花粉生活力會隨著花瓣展開度的變大而升高，在e時期達(dá)到最高。離體萌發(fā)結(jié)果表明GJJ-7和GJJ-9花粉生活力隨花朵開放程度增大呈先升高后降低的趨勢，萌發(fā)力均在c時期最高。雜交結(jié)莢率則與離體萌發(fā)結(jié)果一致，說明離體萌發(fā)法測定花粉生活力比TTC法更可靠。以光果甘草() S-7和S-12為母本的雜交組合結(jié)莢率低，但能夠獲得發(fā)芽率高的種子；以烏拉爾甘草() GDN-16為母本的雜交組合結(jié)莢率高，但種子發(fā)芽率低，說明在甘草雜交中父母本的選擇對結(jié)莢率有重要影響。

甘草；花粉生活力；雜交育種

甘草是多年生草本植物，為豆科(Leguminosae)甘草屬()植物，在我國藥用歷史悠久?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定，光果甘草()、烏拉爾甘草()和脹果甘草()等3種甘草的干燥根和根莖可入藥[1]。野生甘草往往比栽培甘草品質(zhì)更好，藥用價值更高，但是人們的過度采挖已經(jīng)嚴(yán)重地破壞了野生甘草原本的生長環(huán)境, 因此野生甘草資源面臨枯竭的困境。人工培育并種植是保護(hù)甘草野生種質(zhì)資源的有效途徑，目前已有多種藥用植物通過選擇育種、雜交育種等方式獲得了優(yōu)質(zhì)的藥用植物新品種[2–5]。通過培育、篩選出高產(chǎn)高品質(zhì)的甘草新品種，不僅能緩解野生資源匱乏的問題，而且有助于增加甘草產(chǎn)量，滿足市場需求的同時保護(hù)生態(tài)環(huán)境[6]。

本團(tuán)隊廣泛收集了野生甘草資源，并從中選育了5份優(yōu)良的種質(zhì)資源：烏拉爾甘草GDN-16、脹果甘草GJJ-7和GJJ-9、光果甘草S-7和S-12。前期研究表明不同物種根莖中的代謝物具有差異累積的現(xiàn)象，脹果甘草GJJ-7和GJJ-9根中含有特征性化合物甘草查爾酮A，且生物量較大；光果甘草S-7和S-12根中能夠積累含量較高的光甘草定，生物量也較大；而烏拉爾甘草GDN-16根中甘草酸含量更高，但生物量較小。甘草酸具有抗癌[7]、抗炎[8]和抗病毒[9]等藥理活性，是甘草的特殊甜味來源[10]，且藥典中規(guī)定，甘草干燥品中甘草酸的含量不得低于2%[1]。如果能夠通過雜交獲得生物量大,且富含甘草酸以及其他次生代謝物的甘草新品種, 將有助于滿足市場的多樣化需求。

雜交是傳統(tǒng)的培育作物新品種的方式之一，其中花粉生活力指數(shù)是影響雜交成功率的關(guān)鍵因素之一。測定甘草的花粉生活力，有助于提高雜交結(jié)莢率，獲得更多的雜交后代[11]。本研究基于從野生資源中選育出的5份優(yōu)良甘草種質(zhì)資源，對兩個脹果甘草品種GJJ-7和GJJ-9不同開放程度的花朵進(jìn)行花粉生活力的測定，同時進(jìn)行甘草雜交，旨在探索提高雜交效率的方法，并培育集合親本優(yōu)良性狀的甘草新品種。

1 材料和方法

1.1 試驗區(qū)域和材料選擇

供試材料脹果甘草()品種GJJ-7和GJJ-9均來自寧夏回族自治區(qū)銀川市西夏區(qū)平吉堡西北農(nóng)業(yè)生物中心。

GJJ-7和GJJ-9的花粉生活力測定實驗于2020年6月—7月進(jìn)行。選擇當(dāng)天采摘的新鮮花朵，將開花狀態(tài)分為a～e時期(圖1)。a時期雄蕊低于雌蕊, 花藥微微裂開散出少量花粉；b時期雄蕊與雌蕊繼續(xù)生長，但二者相對距離增大，此外花藥裂開程度加大，能夠觀察到有少量花粉附著在柱頭上；c時期花藥幾乎完全裂開，雌蕊繼續(xù)生長，與雄蕊間距離繼續(xù)拉大，此時能夠觀察到花粉大量附著在柱頭上；d時期翼瓣展開，龍骨瓣微微裂開，此時的花粉已經(jīng)能從花朵中由蟲媒散布；e時期的花朵完全打開，花藥開始萎縮變黑。從a時期到e時期約需要3 d。

圖1 脹果甘草開花過程的5個時期。a: 花藥開始散粉; b: 旗瓣白色部分露出2 mm; c: 旗瓣開縫2 mm; d: 翼瓣展開; e: 龍骨瓣展開。

雜交試驗材料有烏拉爾甘草GDN-16、脹果甘草GJJ-7和GJJ-9、光果甘草S-7和S-12等5個種質(zhì)資源。

1.2 方法

1.2.1 TTC法測定花粉生活力

TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，能夠與活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的甲臜，以顯示細(xì)胞的生活力[12–13]。利用0.5%的TTC溶液對花粉進(jìn)行染色，根據(jù)顯色的程度不同可以判斷花粉的生活力，紅色越深表示花粉生活力越強(qiáng)。在載玻片上滴1～2滴0.5%的TTC溶液，把花粉輕輕撒入載玻片上的溶液中，輕輕晃勻。蓋上蓋玻片，在30 ℃培養(yǎng)箱中染色20 min。顯色后即可觀察計數(shù)。顯色程度分為無色、粉色和紅色。每個樣本觀察3個視野，每個視野有20粒以上的花粉，計數(shù)并統(tǒng)計各顏色花粉的數(shù)量及比例。花粉生活力=(染色花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100%

1.2.2 花粉萌發(fā)力測定

花粉萌發(fā)力測定通過人為創(chuàng)造適合花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基條件，以花粉管的萌發(fā)情況來判定花粉管萌發(fā)力的強(qiáng)弱。花粉的萌發(fā)力受到硼酸、蔗糖等因素的影響，因此通過單因素試驗設(shè)計分別對培養(yǎng)基蔗糖和硼酸(H3BO3)進(jìn)行最適濃度篩選。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為5.8，最適蔗糖濃度篩選以含100 mg/L H3BO3的MS培養(yǎng)基為基底，并分別添加0、20、40、60、80和100 g/L蔗糖;最適硼酸濃度篩選以20 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基為基底,并分別添加0、50、100、150、200、250 mg/L H3BO3。

將采集的新鮮花粉均勻撒在MS培養(yǎng)基上，每處理設(shè)置3個重復(fù)。將培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)4 h以上，直至花粉管長度穩(wěn)定。使用光學(xué)顯微鏡觀察計算花粉萌發(fā)數(shù)量，每組隨機(jī)觀察5個視野，計算萌發(fā)花粉數(shù)，統(tǒng)計花粉萌發(fā)力。花粉萌發(fā)力=(萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100%。

1.2.3 甘草雜交方法

試驗時間為2020年和2021年的6月—7月, 在無風(fēng)無雨的天氣下進(jìn)行雜交。選擇花朵未開放，雄蕊未成熟的花朵去雄，進(jìn)行授粉、套袋，5 d后去袋，1個月后統(tǒng)計結(jié)莢量。試驗材料為烏拉爾甘草(GDN-16)、脹果甘草(GJJ-7、GJJ-9)、光果甘草(S-7、S-12)。

2 結(jié)果和分析

2.1 脹果甘草GJJ-7、GJJ-9花粉生活力測定

2.1.1 花粉生活力

從圖2可見，2個品種幾乎所有的花粉都能被TTC染色，無色花粉粒多為發(fā)育不良的花粉，無生活力的花粉占比非常低，約為2.08%，說明這2個品種花粉的生活力都比較高，其中GJJ-7花粉生活力的變化趨勢不穩(wěn)定，在a～e時期呈現(xiàn)波浪型，以a、d時期最高；GJJ-9花粉生活力隨著花瓣的展開而升高，在e時期達(dá)到最高。

圖2 TTC法測定GJJ-7、GJJ-9的花粉生活力(A)和花粉顏色(B)。a～e為開花的5個時期。下同

2.1.2花粉萌發(fā)力

隨著蔗糖濃度的升高，花粉萌發(fā)力越來越高,在100 g/L蔗糖時達(dá)到最高(圖3: A)，因此培養(yǎng)基最適蔗糖濃度為100 g/L。隨著硼酸濃度的升高，花粉萌發(fā)力呈先升高后下降的變化趨勢，GJJ-7花粉在硼酸濃度為200 mg/L時達(dá)到最高，但與150 mg/L硼酸時的萌發(fā)力差異不顯著，而GJJ-9花粉在硼酸濃度為150 mg/L時達(dá)到最高(圖3: B)，因此將150 mg/L定為最適硼酸濃度，進(jìn)行后續(xù)實驗。

在含100 g/L蔗糖和150 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中, GJJ-7和GJJ-9的花粉萌發(fā)力均在c時期最高，且花粉生活力隨花朵開放程度增大呈先升高后下降的變化趨勢，兩種花粉在a～e時期的萌發(fā)力變化趨勢一致，且GJJ-7的花粉萌發(fā)力比GJJ-9高(圖3: C)，這與TTC法測定結(jié)果不一致。

綜合兩種方法，認(rèn)為c、d時期的花粉生活力較適合作為父本進(jìn)行授粉，為甘草雜交時父本的選擇提供參考。

2.2 雜交結(jié)莢率

由表1可見，同一物種分別作為父母本時，結(jié)莢率有明顯差異。當(dāng)GDN-16作為母本時，結(jié)莢率在30%以上；當(dāng)其作為父本時，♀GJJ-7×♂GDN-16的結(jié)莢率最高，僅為16.67%；♀S-7×♂GDN16的結(jié)莢率為1.80%，♀S-12×♂GDN-16為6.91%；反交組合♀GDN16×♂S-7、♀GDN16×♂S-12結(jié)莢率最高, 分別達(dá)52.50%和47.58%，說明GDN-16更適合做母本，S-7和S-12則更適合作父本。但♀GJJ-9×♂S-7的結(jié)莢率為0，♀GJJ-9× ♂S-12為18.87%，這些組合的結(jié)莢率不高，說明不同種間的雜交親和性也會影響結(jié)莢率。

我們還觀察到，將GDN-16、GJJ-7、GJJ-9、S-12等進(jìn)行套袋自交，自交花朵都無法結(jié)出果莢，少量結(jié)莢也是發(fā)育不良的果莢，無法收獲種子。將S-7和S-12進(jìn)行種內(nèi)雜交的結(jié)莢率僅為11.86%，并且無法獲得種子。而對GDN-16進(jìn)行同株異花及異株異花自交均能正常結(jié)果，結(jié)莢率分別為46.67%和13.89%，但種子發(fā)育不良，無法收獲正常的種子,說明甘草存在自交不親和的現(xiàn)象，并且莢果的發(fā)育可能不需經(jīng)過授精作用。

當(dāng)雜交選用的父本均為c、d時期的花朵，雜交組合♀S-12×♂GJJ-7和♀GDN-16×♂GJJ-7的結(jié)莢率分別為23.53%和30.25%；雜交組合♀S-12×♂GJJ-9和♀S-7×♂GJJ-9的結(jié)莢率分別為36.78%和29.77%, 這與離體萌發(fā)法測定的GJJ-7和GJJ-9花粉生活力更為接近，因此離體萌發(fā)法測定的花粉生活力結(jié)果更為可靠。

2.3 雜交種子活力

對2020和2021年收獲的雜交種子進(jìn)行播種和發(fā)芽率測定，播種數(shù)為各雜交組合收獲的種子數(shù)(表2)。組合♀S-12×♂GDN-16、♀S-7×♂GJJ-9和♀S- 7×♂S-12的種子發(fā)芽率最高，均達(dá)100%，組合♀S- 12×♂GJJ-9的發(fā)芽率也高達(dá)91.15%，說明這兩種甘草的雜交種子活力較高，雜交親和性也更高，且種間隔離機(jī)制不完善。但這3組雜交組合的結(jié)莢率均較低，說明S-12和S-7不僅適合作父本也適合作為母本，作母本時雖然結(jié)莢率低，但是種子飽滿，發(fā)芽率高。而♀GDN-16×♂S-7的種子發(fā)芽率僅為1.89%,但雜交結(jié)莢率為52.50%；相似的，♀GDN- 16×♂S-12的種子發(fā)芽率僅為4.3%，但雜交結(jié)莢率高達(dá)47.58%,說明GDN-16作母本時雖然結(jié)莢率較高，但是種子發(fā)芽率低。因此母本的選擇對于雜交種子的收獲更為重要，選擇合適的母本能夠提高雜交種子產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，組合♀S-7×♂S-12能夠收獲飽滿且正常發(fā)芽的種子，但是套袋自交卻無法結(jié)實，說明光果甘草S-12和S-7能夠進(jìn)行種內(nèi)雜交，但有自交不親和的現(xiàn)象。

圖3 離體萌發(fā)法測定GJJ-7、GJJ-9花粉生活力(A～C)和花粉在MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況(D)

表1 甘草的雜交結(jié)果率

3 結(jié)論和討論

采用TTC法與離體萌發(fā)法對GJJ-7、GJJ-9花粉生活力的測定結(jié)果不一致，離體萌發(fā)法表明a～e時期的花粉生活力呈先升高后下降的變化趨勢，與烏拉爾甘草不同開放階段的花粉生活力較為一致[14]，也與本研究中的甘草雜交結(jié)莢率較為一致。TTC法有操作簡單，成本低，能夠大批量檢測的優(yōu)點，但其染色程度不易分辨，容易導(dǎo)致測定值偏高[15]。蔗糖和硼酸是影響花粉萌發(fā)力的重要因素，蔗糖能提供營養(yǎng)和所需碳源，硼酸能增加花粉管的萌發(fā)力，通過培養(yǎng)基模擬柱頭環(huán)境能夠更加準(zhǔn)確的檢測花粉的生活力，此外Ca2+、Mg2+、pH值、溫度、水分、光照等都會影響到花粉管的萌發(fā)[16–21]。本研究中只篩選了蔗糖和硼酸的濃度，并且當(dāng)蔗糖濃度超過100 g/L時，花粉萌發(fā)力仍有提高的可能，對于其他會影響到花粉管萌發(fā)的因素沒有做深入的研究，因此本試驗中離體萌發(fā)法測定的結(jié)果可能會偏低，但與后期雜交實驗的結(jié)莢率相近且變化趨勢一致，因此可認(rèn)為離體萌發(fā)法對脹果甘草花粉活力的檢測結(jié)果比TTC法更加可靠。

表2 雜交種子的發(fā)芽率

GDN-16作為母本的雜交結(jié)莢率最高，在田間自然結(jié)莢率也比較高，而且其花大，去雄時較為簡單也是其較適宜作為母本的重要原因，但其種子的發(fā)芽率在本研究收獲種子中最低，且多數(shù)發(fā)霉，這可能與其植株形態(tài)有重要的關(guān)系，GDN-16匍匐生長，果莢容易接觸地面，而甘草地采取漫灌方式, 在澆水時果莢容易長時間浸泡在水中，進(jìn)而易引起霉菌感染。而GJJ-7、GJJ-9、S-7、S-12直立生長, 能夠避免果莢遭受水浸的情況，后續(xù)研究可通過抬高植株避免果莢浸水，減少種子的損失。S-7、S-12等的田間自然結(jié)莢率較高，但花小，雜交時作為母本的去雄操作較為困難，在去雄、授粉、套袋時也容易造成機(jī)械損傷，進(jìn)而影響結(jié)莢率，但收獲的種子較為飽滿，且發(fā)芽率高，因此在能夠避免機(jī)械損傷的情況下，S-7、S-12適合作為母本進(jìn)行雜交。GJJ-7、GJJ-9的田間自然結(jié)莢率較低，且從自然結(jié)莢的果莢中收獲的種子多數(shù)發(fā)育不良，僅有少數(shù)飽滿的種子；而GDN-16經(jīng)同株異花雜交和異株異花雜交均無法收獲種子，但果莢仍能夠發(fā)育，說明甘草果莢的發(fā)育可能不需要經(jīng)過受精作用。

甘草具有蟲媒傳粉特性，傳粉者多為蜂類，當(dāng)傳粉者的足部停在翼瓣和龍骨瓣上時，利用自身重量使得龍骨瓣打開，暴露出雌雄蕊后再由昆蟲授粉[22]。然而，在花未開放時(b、c時期)花粉便已經(jīng)附著在柱頭上，這種行為模式更適合自交。但我們多次在GDN-16、GJJ-7、GJJ-9、S-7、S-12花開前套袋，1個月后無種子生成，可能存在自交不親和現(xiàn)象，因此猜測在脹果甘草花柱中可能存在某種預(yù)防自交機(jī)制。組合♀S-7×♂S-12能夠收獲飽滿種子并且正常發(fā)芽，但是各自套袋自交卻無法結(jié)實，說明光果甘草S-12和S-7能夠進(jìn)行種內(nèi)雜交，但同時有自交不親和的現(xiàn)象。已有研究報道在顯微鏡下觀察到烏拉爾甘草花柱頭的可授性，在無外來花粉的情況下,自身雄蕊上的花粉能夠萌發(fā)花粉管并進(jìn)入胚珠中完成受精，證明其授粉方式屬于閉花受精[23]，但本研究中的烏拉爾甘草GDN-16品種并不能自交結(jié)實，說明授粉方式可能存在品種差異。而在田間試驗中，張新玲等[24]報道烏拉爾甘草自交不親和，本研究中除烏拉爾甘草GDN-16自交不親和外，脹果甘草GJJ-7和GJJ-9、光果甘草S-7和S-12同樣自交不親和。異種花粉也能在柱頭上萌發(fā)并且到達(dá)子房完成受精，但不同雜交組合的花粉管生長速度不一致，說明甘草屬種間雜合親和性較高，種間隔離機(jī)制不完全[25]，這也與本研究中不同雜交組合的結(jié)莢率差異一致。

綜上所述，TTC法和花粉離體萌發(fā)法對脹果甘草GJJ-7、GJJ-9花朵5個開放時期花粉生活力的測定結(jié)果存在差異，以花粉離體萌發(fā)法更加可靠。甘草種間正交和反交的結(jié)莢率存在明顯差異，說明在甘草雜交中父母本的選擇有助于提高結(jié)莢率。

通過測定甘草花朵不同開放程度時的花粉生活力，能夠輔助雜交育種對于父本花朵的選擇，提高雜交成功率。后續(xù)研究可通過雜交育種構(gòu)建遺傳群體后代，培育甘草新品種以及構(gòu)建甘草遺傳圖譜，有助于甘草的遺傳學(xué)研究、品種改良以及甘草資源的可持續(xù)利用。

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Determination of Pollen Viability ofand Hybridization Study of Licorice

XIE Ziyan1,2,3, Botir Khaitov4, YANG Tianshun1,2, LI Zhong5, LI Yongqing1,2,3,6*, WANG Ying1,2,3,6*

(1. Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Genetic Improvement & Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2. South China National Botanical Garden, Guangzhou 510650, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. International Center for Biosaline Agriculture, Regional office for Central Asia and the Caucasus, Tashkent 100084, Uzbekistan; 5. Beryl Wolfberry Limited by Share Ltd., Yinchuan 750200, China; 6. Center of Economic Botany, Core Botanical Gardens, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China)

Hybridization is one of the traditional methods to breed new cultivars, pollen viability is important for the successful transmission of genetic material to generations.is one of the three licorice species recorded in Chinese Pharmacopoeia, with many specialized active compounds. In order to determine the optimal pollen development periods for licorice hybridization, the pollen viability of five bloom stages (a, b, c, d, and e) of twocultivars (GJJ-7 and GJJ-9) were measured by TTC staining andpollen germination methods. The result of TTC staining method showed that the pollen viability of GJJ-7 trended in a wave pattern and peaked at a and d stages. The pollen viability of GJJ-9 increased with the opening process of petals, and peaked at e stage. But the result ofpollen germination method showed that the pollen viability of both GJJ-7 and GJJ-9 was highest at c stage, which was consistent with fruiting rate in the hybridization, and further indicating the higher reliability of thegermination method compared with the TTC staining. Hybridization results of the three medicinal licorice species showed that a low fruiting rate but highest seed germination rate was obtained whencultivars S-7 and S-12 were used as the female parents. High fruiting rate but low seed germination rate was observed whencultivar GDN-16 was used as the female parent, indicating the importance of parent selection during licorice hybridization. These provides an important reference for improving the field hybridization efficiency of licorice.

Licorice, Pollen viability, Hybridization

10.11926/jtsb.4659

2022-04-22

2022-04-25

廣州市科技計劃項目(202002030442)；廣東省科技廳產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2020KJ148)資助

This work was supported by the Project for Science and Technology Planning in Guangzhou (Grant No. 202002030442), and the Project for Modern Agriculture Industry Technology Innovation Teams of Department of Science and Technology of Guangdong (Grant No. 2020KJ148).

謝姿雁(1996年生), 女, 碩士研究生, 研究方向為藥用植物分子遺傳。E-mail: yan.574554015@qq.com

. E-mail: liyongqing@scbg.ac.cn; yingwang@scbg.ac.cn