孕期慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激致產(chǎn)后抑郁的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證

金素慧， 李泓諭， 李佳琪， 王 瑞， 劉紅婭， 關(guān)素珍

（1.同心縣人民醫(yī)院，同心 751300； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，銀川 750004； 3.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

隨著生活節(jié)奏的加快，女性在妊娠階段，既面臨著孕期及產(chǎn)后心理狀態(tài)的改變，又需應(yīng)對(duì)此階段諸多因素作為應(yīng)激源帶來的壓力，孕期女性常處于較高程度的壓力狀態(tài)，而經(jīng)歷負(fù)面生活事件的產(chǎn)婦患產(chǎn)后抑郁癥（postpartum depression，PPD）的可能性更大。PPD 是產(chǎn)后出現(xiàn)過分焦慮、悲傷、絕望、快感喪失等情緒，甚至可能出現(xiàn)自殺或殺嬰的行為，是一種常見的產(chǎn)褥期精神障礙性疾病，國(guó)內(nèi)發(fā)病率為13.1%～16.3%[1]。研究[2]表明，孕期壓力事件是PPD 的重要危險(xiǎn)因素。一般在產(chǎn)后2 周內(nèi)多發(fā)，產(chǎn)后4～6 周癥狀明顯，于產(chǎn)后6 個(gè)月開始癥狀逐漸緩解，約2/3 患者可于1年內(nèi)康復(fù)，若再次妊娠，其復(fù)發(fā)率高達(dá)50%[3]。PPD 不僅對(duì)產(chǎn)婦的身心健康有著巨大影響，還可能對(duì)嬰兒情感和認(rèn)知發(fā)育造成損傷[4]。但目前關(guān)于PPD 的診斷多以問卷調(diào)查為主，缺少生物學(xué)診斷標(biāo)志物，導(dǎo)致其難以被及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，故尋找可能的生物學(xué)標(biāo)志物以了解致病機(jī)制尤為重要，而在實(shí)驗(yàn)機(jī)制的相關(guān)研究中更多的產(chǎn)后抑郁模型是以激素誘導(dǎo)法及長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激模型為主[5]，這些因素更多的是考慮產(chǎn)后環(huán)境及激素水平的改變，并未涵蓋PPD 與孕期諸多因素影響的相關(guān)性。本研究將模擬孕婦在妊娠期經(jīng)受的社會(huì)心理因素影響來建立產(chǎn)后抑郁模型，進(jìn)而為后期從圍產(chǎn)期出發(fā)研究產(chǎn)后抑郁發(fā)生的原因及機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年SD 大鼠購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SYXK（寧）2020-0001。其中雌鼠32 只，體質(zhì)量（240±20）g；雄鼠16 只，體質(zhì)量（300±20）g。經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核（IACUC-NYLAC-2021-121）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將32 只雌鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組16 只；將16 只雄鼠隨機(jī)分為對(duì)照交配組8 只和模型交配組8 只。其中雌鼠單籠飼養(yǎng)，雄鼠每籠2 只飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器及試劑

1.2.1 主要設(shè)備與儀器 電子天平［梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司］；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo Fisher 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo 生物技術(shù)有限公司）；超純水制備機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；VICTOR NivoTMMultimode Plate Reader［珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠皮質(zhì)酮/腎上腺酮（CORT）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；大鼠雌二醇（estradiol，E2）ELISA 試劑盒（上海酶免生物科技有限公司）；蔗糖分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.3 建立孕期慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型

選擇慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立動(dòng)物模型[6]。應(yīng)激方式包括：禁食禁水12 h；擁擠環(huán)境24 h（8 只合籠），籠具傾斜30° 24 h；潮濕環(huán)境24 h（濕度60%～70%）；冰水游泳5 min；30 min 搖晃（1 次/s）；行為束縛2 h；熱應(yīng)激5 min（42 ℃）；夾尾（距尾尖1 cm 處）2 min。模型周期為21 d，每天隨機(jī)安排應(yīng)激方式，保證7 d 內(nèi)不出現(xiàn)相同的應(yīng)激方式。交配過程：在應(yīng)激第3 天（17：00），對(duì)照組模型組分別與對(duì)照交配組和模型交配組1∶2 合籠飼養(yǎng)，第2 天早晨檢查雌鼠陰道涂片確定妊娠后，將雌雄分籠，雌鼠繼續(xù)單籠飼養(yǎng)，雄鼠每籠2只飼養(yǎng)。

1.4 血漿皮質(zhì)酮水平測(cè)定

孕期不同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈取血，采用ELISA 試劑盒，按說明書對(duì)血漿皮質(zhì)酮水平進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度（OD）值。

1.5 產(chǎn)后抑郁情緒測(cè)定

分別于產(chǎn)后1 周、3 周進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.5.1 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn) 通過動(dòng)物甜味溶液的攝入量占總液體量的比重，評(píng)價(jià)抑郁情緒。實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，取兩個(gè)相同的飲用瓶，其中一個(gè)放入1%蔗糖溶液，另一個(gè)放入純水，同時(shí)將兩瓶水放入籠中，訓(xùn)練24 h。訓(xùn)練結(jié)束后，動(dòng)物禁食禁水24 h，開始正式實(shí)驗(yàn)。分別記錄1 h 內(nèi)純水消耗量，1%糖水消耗量、液體總消耗量。計(jì)算1%蔗糖偏好百分比（1%糖水消耗量/液體總消耗量×100%）。

1.5.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 通過動(dòng)物在不熟悉環(huán)境下的探索行為，評(píng)估動(dòng)物的焦慮及緊張程度。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱采用100 cm×100 cm×50 cm 的無蓋敞箱，底部用記號(hào)筆畫出25 個(gè)4 cm×4 cm 的小格。實(shí)驗(yàn)前1 天將動(dòng)物飼養(yǎng)于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)熟悉環(huán)境。將動(dòng)物放入曠場(chǎng)中央，讓其在敞箱內(nèi)自主活動(dòng)5 min，分別記錄其在外周和中心運(yùn)動(dòng)的時(shí)長(zhǎng)。每只動(dòng)物測(cè)試結(jié)束后，清理曠場(chǎng)內(nèi)的糞便，噴灑75%乙醇去除動(dòng)物留下的氣味。

1.5.3 懸尾實(shí)驗(yàn) 通過動(dòng)物放棄掙扎的靜止?fàn)顟B(tài)，評(píng)價(jià)抑郁情緒。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尾部固定懸掛于懸尾實(shí)驗(yàn)箱上，使其頭部向下并與實(shí)驗(yàn)臺(tái)保持約20 cm 的距離，記錄其5 min 內(nèi)靜止時(shí)間。

1.5.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 使用直徑20 cm、高度40 cm 的圓柱形透明裝置，加入22 ℃左右的水，保持水面高度為25 cm，將大鼠放入水中，記錄其5 min 內(nèi)靜止時(shí)間。通過動(dòng)物在水中的不動(dòng)狀態(tài)，評(píng)價(jià)抑郁情緒。

1.6 E2 水平測(cè)定

在應(yīng)激第21 天、產(chǎn)后1 周、產(chǎn)后3 周尾靜脈采血，分離血清，利用E2ELISA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定。酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，同一指標(biāo)不同時(shí)點(diǎn)比較用重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕期應(yīng)激刺激對(duì)血漿皮質(zhì)酮水平的影響

應(yīng)激第7 天、21 天模型組雌鼠血漿皮質(zhì)酮水平高于同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），表明孕期雌鼠處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，見表1。

表1 孕期應(yīng)激對(duì)雌鼠血漿皮質(zhì)酮水平的影響（±s，ng·mL-1）

表1 孕期應(yīng)激對(duì)雌鼠血漿皮質(zhì)酮水平的影響（±s，ng·mL-1）

組別n應(yīng)激前1 天應(yīng)激第7 天應(yīng)激第14 天應(yīng)激第21 天對(duì)照組81.68±0.941.34±0.241.58±0.231.90±0.22模型組81.54±0.732.00±0.262.39±1.092.38±0.21 F 值0.07118.0652.60212.264 P 值0.7960.0030.1450.008

2.2 孕期應(yīng)激對(duì)雌鼠產(chǎn)后情緒的影響

2.2.1 孕期應(yīng)激對(duì)產(chǎn)后雌鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比，模型組產(chǎn)后1 周外周運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)、中心運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)縮短（P 均＜0.05），但產(chǎn)后3 周兩組中心運(yùn)動(dòng)時(shí)間、外周運(yùn)動(dòng)時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），見表2。

表2 孕期應(yīng)激對(duì)雌鼠產(chǎn)后行為學(xué)各指標(biāo)的影響（±s）

表2 孕期應(yīng)激對(duì)雌鼠產(chǎn)后行為學(xué)各指標(biāo)的影響（±s）

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2.2.2 孕期應(yīng)激對(duì)產(chǎn)后雌鼠1%蔗糖偏好百分比的影響 產(chǎn)后1 周、3 周模型組1%蔗糖偏好百分比均低于對(duì)照組（P 均＜0.05），提示孕期應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致雌鼠產(chǎn)后出現(xiàn)快感消失的問題，見表2。

2.2.3 孕期應(yīng)激對(duì)產(chǎn)后雌鼠懸尾實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響 模型組產(chǎn)后1 周、產(chǎn)后3 周的靜止時(shí)間均高于對(duì)照組（P 均＜0.05），見表2。

2.2.4 孕期應(yīng)激對(duì)產(chǎn)后雌鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)的影響 產(chǎn)后1 周模型組靜止時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05）。在產(chǎn)后3 周，模型組靜止時(shí)間與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 孕期應(yīng)激致產(chǎn)后E2 水平變化

經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較發(fā)現(xiàn)模型組與對(duì)照組E2水平存在差異（F=6.273，P＜0.05），產(chǎn)后對(duì)照組和模型組E2水平均下降，且模型組產(chǎn)后1 周和產(chǎn)后3 周E2水平均低于對(duì)照組（P 均＜0.05）。提示孕期應(yīng)激使產(chǎn)后雌鼠E2水平迅速降低，見表3。

表3 孕期應(yīng)激對(duì)雌鼠E2 水平變化的影響（±s，pmol·L-1）

表3 孕期應(yīng)激對(duì)雌鼠E2 水平變化的影響（±s，pmol·L-1）

組別n 應(yīng)激第21 天產(chǎn)后第1 周第3 周對(duì)照組840.49±4.48 39.36±6.00 38.40±6.63模型組838.10±2.94 33.29±0.86 29.19±2.55 F 值1.1916.04310.071 P 值0.3010.0340.010

3 討論

PPD 的影響因素有很多，包括經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、遺傳、生理等多種因素[7-8]。孕期慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型是Willner 通過改變動(dòng)物生存環(huán)境（如禁食、禁水、潮濕墊料等）使動(dòng)物長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)建立的經(jīng)典抑郁模型，其建立原理是動(dòng)物處于不適宜生存環(huán)境時(shí)會(huì)出現(xiàn)緊張、焦慮、抑郁等情緒，有研究[9]表明CUMS 會(huì)導(dǎo)致下丘腦-垂體－腎上腺（HPA）軸功能失調(diào)?？梢娫衅诼詰?yīng)激抑郁模型與臨床PPD 患者的病因相似。PPD 的病程持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，可長(zhǎng)達(dá)半年至1 年[10]，CUMS 可使動(dòng)物的抑郁情緒持續(xù)時(shí)間較一般應(yīng)激模型更長(zhǎng)。此外CUMS 造模方法可靠、穩(wěn)定、可操作性強(qiáng)，因此本研究選用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激建立PPD動(dòng)物模型。

慢性壓力在抑郁癥的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期的應(yīng)激，就會(huì)導(dǎo)致HPA功能障礙，糖皮質(zhì)激素是HPA 軸激活的標(biāo)志，而皮質(zhì)酮是糖皮質(zhì)激素的主要成分[11-12]，因此血漿皮質(zhì)酮常作為慢性應(yīng)激模型建立成功的指標(biāo)。本研究模型組雌鼠應(yīng)激第7 天、應(yīng)激第21 天血漿皮質(zhì)酮水平高于對(duì)照組，表明雌鼠處于應(yīng)激狀態(tài)，孕期慢性應(yīng)激模型建立成功。在應(yīng)激后期模型組雌鼠血漿皮質(zhì)酮水平增長(zhǎng)緩慢，可能與HPA軸對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)有關(guān)。有研究[13]發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激開始時(shí)血漿皮質(zhì)酮水平明顯升高，一段時(shí)間后升高速度變緩，與本研究結(jié)果相似。并且在不同的應(yīng)激模型中均能發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)酮水平的升高，如急性應(yīng)激[14]、慢性社交失敗應(yīng)激模型[15]等，說明皮質(zhì)酮在應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要作用。

行為學(xué)評(píng)價(jià)常用于評(píng)價(jià)PPD 動(dòng)物模型，PPD的臨床表現(xiàn)為焦慮、快感喪失甚至出現(xiàn)自殺傾向。在以往的研究中多以產(chǎn)后1 周為觀察終點(diǎn)，但PPD 的病程時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)半年至1 年，因此本研究觀察了雌鼠產(chǎn)后1 周和產(chǎn)后3 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)變化情況，并以產(chǎn)后3 周作為觀察終點(diǎn)。行為學(xué)中曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)常被用來觀察動(dòng)物的緊張、焦慮情緒[16]，本研究發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)后1 周模型組大鼠中心運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)低于對(duì)照組，外周運(yùn)動(dòng)時(shí)長(zhǎng)高于對(duì)照組，模型組的探索行為減少，產(chǎn)生焦慮、緊張情緒。蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)用1%糖水消耗率來評(píng)價(jià)快感缺失程度，這一指標(biāo)常常作為抑郁與否發(fā)生的標(biāo)志[17]?？旄腥笔荘PD 的臨床表現(xiàn)之一，CUMS大鼠與之出現(xiàn)了相同的情緒損傷。懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)以靜止時(shí)間作為評(píng)價(jià)指標(biāo)觀察動(dòng)物的絕望情緒。有研究[18]已證實(shí)CUMS 會(huì)使大鼠產(chǎn)生絕望情緒，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，與本研究結(jié)果相似。本研究顯示，CUMS 會(huì)使產(chǎn)后大鼠產(chǎn)生焦慮、緊張、快感缺失、絕望等情緒，出現(xiàn)了與PPD 相似的臨床表現(xiàn)。

神經(jīng)內(nèi)分泌因素與PPD 發(fā)病密切相關(guān)，而性腺軸（HPG）是女性分泌性激素的重要神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)體系。妊娠期女性性激素水平的明顯波動(dòng)可引起情緒障礙，其機(jī)制主要與HPG 軸的反饋性調(diào)節(jié)有關(guān)。E2作為性激素的一種，其水平變化是目前較為公認(rèn)的評(píng)價(jià)PPD 發(fā)生的指標(biāo)。孕期E2水平波動(dòng)較大，在孕晚期時(shí)可達(dá)到正常水平的40 倍，分娩后E2水平迅速下降[19]，導(dǎo)致產(chǎn)婦的情緒起伏大。有研究[20]表明PPD 患者的E2水平明顯低于健康產(chǎn)婦。而CUMS 會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)后E2水平降低[21]，進(jìn)一步加劇抑郁樣情緒的產(chǎn)生，能夠很好地解釋本研究結(jié)果。

從本研究中行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及血清中E2變化情況可見，孕期慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激刺激可用來建立產(chǎn)后抑郁大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)而可為后期從圍產(chǎn)期出發(fā)研究產(chǎn)后抑郁發(fā)生原因及機(jī)制提供新方法。