荒漠早春開花植物囊果草大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育

張 芳,黃代紅,吉乃提汗·馬木提,2*

(1 新疆農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院,烏魯木齊 830052;2 新疆農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院, 西部干旱區(qū)草地資源與生態(tài)教育部重點實驗室,烏魯木齊 830052)

植物生殖生物學是研究植物有性繁殖過程的一門前沿學科,其涉及花芽分化、雌雄性器官發(fā)生與發(fā)育、傳粉受精及胚胎發(fā)育等內(nèi)容[1-3]。研究植物的生殖生物學特性,不僅對揭示其演變及進化軌跡、闡明個體發(fā)育及物種間的親緣關系具有重要作用[4],還是開展雜交育種或系統(tǒng)學研究的前提和基礎[5]。

小檗科(Berberidaceae)共有17屬、700余種[6-8],主要分布于北溫帶和亞熱帶高山地區(qū)[7]。該科被劃分為鬼臼亞科(Podophylloideae)、小檗亞科(Berberidoideae)和南天竹亞科(Nandinoideae)3個亞科[8-10]。形態(tài)解剖學和分子系統(tǒng)學研究證明該科為單系[10-13]。馮旻等[14]以及Liu等[15]分別對該科的南天竹(Nandinadomestica)和牡丹草(Gymnospermiummicrorrhynchum)的花器官發(fā)生及其系統(tǒng)學意義進行了研究,討論了花器官的三基數(shù)祖征性狀并揭示了牡丹草花器官偏離祖先模式的二基數(shù)演化特征。黃衡宇等[16]以及馬紹賓等[17]對鬼臼亞科胚胎學與系統(tǒng)學的研究表明,鬼臼亞科為1個自然類群,確定了該亞科各屬間的演化關系。張明英等[18]認為小檗亞科和南天竹亞科存在共衍征,將其與鬼臼亞科區(qū)分開來,并支持了小檗亞科與南天竹亞科的姐妹關系。這些研究為小檗科植物的生殖生物學研究積累了基礎資料。

囊果草屬(Leontice)隸屬于小檗科南天竹亞科囊果草族(Leonticeae)[19]。該屬約3～4種,主要分布于北溫帶地區(qū),中國僅1種,產(chǎn)于新疆[7]。囊果草屬通常具塊狀根,莖直立,草質(zhì),不分枝,全株無毛[7]。Nickol[20]認為,蘭山草屬(Ranzania)、二葉鮮黃連屬(Jeffersonia)、山荷葉屬(Diphylleia)和鬼臼屬(Podophyllum)等均為囊果草屬的姊妹屬,且因牡丹草屬(Gymnospermium)的果實類型沒有可靠的形態(tài)學證據(jù)支撐,則將其歸并在囊果草屬中。但Liu等[15]基于牡丹草屬和囊果草屬花粉外壁紋飾的不同,提出牡丹草屬應從囊果草屬中獨立出來。

囊果草(LeonticeincertaPall.)是僅分布于哈薩克斯坦和中國新疆的小檗科囊果草屬多年生早春開花植物。在新疆,該物種僅帶狀分布于天山北坡荒漠和低山山坡[7],具有獨特的觀賞價值,是一種值得開發(fā)利用的野生花卉,且具有較高的飼用價值和生態(tài)價值[21-23]。

然而,由于囊果草自然種群分布區(qū)有限,分布面積狹窄,生長環(huán)境惡劣,且各種家畜均喜采食等影響而面臨瀕危狀態(tài)[23]。在《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》(IUCN)中,該物種被評估為近危種(NT)[7]。

有關囊果草的研究主要集中在形態(tài)特征[7]、染色體核型分析[24]、種群分布及其生態(tài)適應[23]、種子休眠與萌發(fā)特性[25]及繁殖保障機制[26]等方面,而有關該物種的生殖生物學研究鮮見報道。因此,本文以荒漠早春開花植物囊果草為研究材料,采用石蠟切片技術觀察其大/小孢子發(fā)生與雌/雄配子體發(fā)育的胚胎學特征,以期明確囊果草有性生殖過程,不僅為進一步分析該物種的致危原因以及指定合理的保護策略提供理論依據(jù),還可為小檗科植物的系統(tǒng)學研究積累基礎資料。

1 材料和方法

1.1 取樣地點與研究材料

囊果草(L.incerta)采自新疆沙灣縣安集海鎮(zhèn)南部低山山坡。該地點地理坐標為85°30′04.6″E、44°36′08.6″N,海拔600 m左右,屬溫帶大陸性干旱荒漠氣候,土壤為淡栗鈣質(zhì)荒漠土[27]。年均氣溫約6.5 ℃,年最低氣溫(1月)可達-28 ℃,年最高氣溫(7月)可達37 ℃,年均降水量為131.8 mm,其中約65%的降水發(fā)生在春季和夏季(數(shù)據(jù)來源于中國氣象局國家氣象信息中心, 2020-2021年)。年蒸發(fā)量為1 237～1 770 mm,年均日照時數(shù)可達2 200～3 200[27-28]。

囊果草株高5～15 cm,直立總狀花序,每年3月下旬至4月上/中旬快速萌動開花,5月中旬果實成熟[7,26]。6月初,植株地上部分凋亡,屬于典型的多年生早春短命植物。

1.2 研究方法

于2021年3月5日至4月16日、9月15日至11月25日,分別在自然居群中對該物種不同發(fā)育時期的花芽及開放的花朵進行采樣。每7 d取1次,按照材料大小不同,分別將其固定在10 mL和50 mL FAA (70%乙醇∶甲醛∶冰乙酸 = 18∶1∶1, 體積比)固定液中,置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

在室內(nèi)將已固定的材料在解剖鏡下進行解剖,分別剝離出完整的雌、雄蕊。采用石蠟切片法[29]:將材料抽氣后在植物軟化液中軟化24 h,成熟花藥用番紅—固綠雙重染色外,其他材料均利用Gill改良蘇木精法[30]整染2 d,水洗返藍(成熟花藥用番紅—固綠雙重染色),按(70%、75%、80%、90%、95%、100%、100%)乙醇梯度逐級脫水,前5級均1 h,100%乙醇40 min;體積比1∶1的無水乙醇和二甲苯透明1 h,純二甲苯透明2次,均45 min;將透明好的材料放置于體積比約1∶2的二甲苯和液體石蠟混合液中37 ℃過夜。在56～60 ℃浸蠟2～3 d,每6 h更換1次過濾干凈的蠟液,最后進行包埋和修塊,用Leica RM 2126RT切片機切片(蠟帶厚度8～10 μm)、展片;二甲苯脫蠟、透明,樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察并拍攝。

2 結(jié)果與分析

囊果草具2片基生葉,為總狀花序,每個花序上約8～15朵小花(圖1, A)。花序上的開花順序為自下而上。其花為兩性花,黃色,每朵花具6枚花萼,呈卵圓形,6枚花瓣特化為蜜腺狀,6枚雄蕊離生,單心皮雌蕊,花萼明顯長于花瓣(圖1, B)。在花萼背面具有藍紫色斑塊(圖1, C)?；ǘ漭^小,花瓣特化為蜜腺狀,呈倒卵形,與雄蕊對生,雌蕊發(fā)育為囊狀結(jié)構(gòu),具短花柱,柱頭平截(圖1, D、E)。成熟花藥的開裂方式為瓣裂(圖1, F)。果實呈囊泡狀緊密排列在果序上,果皮不開裂,4枚種子基生。

A. 植株和總狀花序; B. 單花; C. 箭頭示花萼背面具藍紫色斑塊; D. 花部形態(tài), 示雄蕊與特化花瓣; E. 側(cè)面觀, 示囊狀單雌蕊; F. 箭頭示花藥瓣裂. b. 苞片; i. 花序; l. 葉; p. 花瓣; pi. 雌蕊; s. 花萼; st. 雄蕊; sti. 柱頭; sty. 花柱. B, D-F. 標尺 = 2 mm。

2.1 小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育

2.1.1 花藥壁的發(fā)育

囊果草雄蕊具4個小孢子囊,兩側(cè)的小孢子囊由藥隔相連?；ㄋ幵尚廴镌敹朔只纬??；ㄋ幵钔鈱訛?層表皮細胞,內(nèi)側(cè)主要為分生組織,表皮內(nèi)側(cè)4個角隅處各有分裂產(chǎn)生的孢原細胞(圖2, A)。孢原細胞經(jīng)1次平周分裂形成2層細胞,向外為初生壁細胞,即周緣細胞,向內(nèi)形成體積較大的初生造孢細胞。周緣細胞進行平周和垂周分裂,由外向內(nèi)逐漸產(chǎn)生4層細胞,分別為1層藥室內(nèi)壁、2層中層和1層絨氈層;造孢細胞經(jīng)多次有絲分裂形成小孢子母細胞,早期的絨氈層細胞為單核,胞質(zhì)濃厚(圖2, B-D)?；ㄋ幈诜只耆?中層細胞呈扁平狀,最內(nèi)層的絨氈層細胞不規(guī)則,細胞體積大,原生質(zhì)濃,具雙核或多核(圖2, E)。

A. 花藥原基橫切面, 示孢原細胞時期; B. 周緣細胞進行平周分裂; C. 幼小花藥的橫切面, 示4個小孢子囊的分化; D. 發(fā)育中的花藥壁及早期小孢子母細胞; E. 箭頭示雙核或多核絨氈層細胞; F. 花藥壁和游離小孢子; G. 絨氈層細胞開始解體; H. 纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁; I. 成熟花藥的橫切面, 示纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁和成熟花粉粒. aw. 花藥壁; en. 藥室內(nèi)壁; ep. 表皮; ml. 中層; mi. 小孢子; ta. 絨氈層; fe. 纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁; pg. 花粉粒. A-D. 標尺=100 μm; E-H. 標尺=50 μm; I. 標尺=200 μm。

因此,囊果草的花藥壁具2層中層,依據(jù)Davis[31]對被子植物花藥壁發(fā)育劃分標準,該物種花藥壁發(fā)育為基本型。

小孢子四分體至游離小孢子時期,藥室內(nèi)壁逐漸加厚,中層細胞發(fā)生解體,發(fā)達的絨氈層細胞開始出現(xiàn)解體(圖2, F)。小孢子單核靠邊期,絨氈層細胞不斷為小孢子提供營養(yǎng),細胞界限不明顯,細胞核消失,逐漸原位解體被小孢子吸收,故為腺質(zhì)型絨氈層(圖2, G)。隨著早期花粉粒的發(fā)育,藥室內(nèi)壁進一步徑向延長,最內(nèi)1層中層細胞被吸收,絨氈層完全解體(圖2, H)。成熟花藥時期,花藥壁僅剩纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁和殘留的表皮細胞,絨氈層和中層細胞完全解體,表皮細胞未見明顯加厚(圖2, I)。

2.1.2 小孢子發(fā)生

囊果草幼小花藥表皮內(nèi)側(cè)的孢原細胞經(jīng)平周分裂,形成的造孢細胞體積大,近橢圓形,核仁明顯,細胞質(zhì)濃厚,無明顯液泡(圖3, A-C)。小孢子母細胞呈圓球形,細胞體積大,胞質(zhì)濃厚,細胞核大而核仁明顯,無明顯液泡,核仁與染色質(zhì)形成染色較深的圓球體(圖3, D)。分化初期,圓球形的小孢子母細胞被胼胝質(zhì)壁包圍,進入減數(shù)分裂期。小孢子母細胞在減數(shù)第1次分裂前期,絨氈層細胞開始發(fā)生核分裂(圖3, E)。隨后,進入減數(shù)第1次分裂中期,此時染色體排列在赤道板附近(圖3, F)。小孢子母細胞減數(shù)第2次分裂后期,4個細胞核由紡錘絲相連接(圖3, G)。第1次核分裂過程不伴隨胞質(zhì)分裂,直到減數(shù)第2次分裂末期,4個子細胞核形成后,細胞質(zhì)開始分裂,小孢子四分體呈四面體型排列(圖3, H、I)?？梢?囊果草小孢子母細胞減數(shù)分裂過程中胞質(zhì)分裂為同時型,小孢子四分體排列為四面體型,其壁呈向心式發(fā)生。

A. 孢原細胞平周分裂; B, C. 造孢細胞時期; D. 小孢子母細胞; E. 花藥縱切面, 示小孢子母細胞減第Ⅰ次數(shù)分裂前期絨氈層細胞發(fā)生核分裂; F. 小孢子母細胞減數(shù)第Ⅰ次分裂中期; G. 小孢子母細胞減數(shù)第Ⅱ次分裂后期; H. 小孢子母細胞減數(shù)第Ⅱ次分裂末期; I. 四分體時期. mc. 小孢子母細胞; te. 四分體. A-C. 標尺 = 100 μm; D, G. 標尺 = 35 μm; E, F, H, I. 標尺 = 50 μm。

同一藥室及同一花藥的不同藥室間小孢子母細胞減數(shù)分裂基本同步。在小孢子母細胞減數(shù)分裂過程中,伴隨著胼胝質(zhì)壁的發(fā)生,其始終包圍在小孢子外。小孢子減數(shù)分裂形成的四分體亦被胼胝質(zhì)壁所包圍。

2.1.3 雄配子體的發(fā)育

小孢子母細胞在減數(shù)分裂完成后,小孢子四分體的胼胝質(zhì)壁開始溶解,四分體小孢子逐漸被分離開,形成游離的單核小孢子(圖4, A、B)。剛釋放的單核小孢子又叫單核花粉粒。其細胞呈橢球形,細胞壁薄,胞質(zhì)濃厚,細胞核較大且位于細胞中央(圖4, C)。此后,單核花粉粒不斷從絨氈層細胞中獲取營養(yǎng),細胞質(zhì)明顯液泡化,逐漸形成中央大液泡,細胞核被擠向花粉一側(cè),進入單核靠邊期(圖4, D)。

A. 胼胝質(zhì)開始溶解; B. 從四分體中釋放的游離小孢子; C. 單核居中期, 花粉細胞中具大液泡; D. 單核靠邊期, 花粉細胞具有大液泡; E. 早期單細胞花粉粒; F. 單核花粉粒有絲分裂期; G, H. 早期2細胞花粉, 1個大的營養(yǎng)細胞, 箭頭示1個小的靠邊生殖細胞; I. 成熟花粉粒, 箭頭示3細胞型花粉. A～D. 標尺 = 50 μm; E～I. 標尺 = 25 μm。

隨著單核花粉粒不斷生長,小孢子核在靠近花粉壁位置發(fā)生不均等有絲分裂(圖4, E、F)。經(jīng)有絲分裂后形成2個細胞核,貼近花粉壁的為生殖核,靠近中央液泡的為營養(yǎng)核(圖4, G、H)。成熟花粉粒多為2細胞型,偶見3細胞型,花粉近球形(圖4, I)。花藥成熟后,花粉囊開裂,成熟花粉粒散出。

2.2 大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育

2.2.1 大孢子發(fā)生

囊果草具單雌蕊,由1心皮組成,子房1室,為基生胎座,胚珠4枚(圖5, A)。胚珠原基逐漸分裂形成指狀結(jié)構(gòu),發(fā)育為珠心組織,珠心表皮細胞下出現(xiàn)孢原細胞,其體積大而胞質(zhì)濃(圖5, B)。孢原細胞經(jīng)平周分裂,形成周緣細胞和造孢細胞,前者分裂形成的細胞參與珠心組織的生長發(fā)育;造孢細胞進一步發(fā)育為大孢子母細胞,其位于遠離珠孔端位置,細胞呈圓球形,細胞核大且核仁明顯(圖5, C)。隨著大孢子母細胞不斷分化,內(nèi)、外珠被逐漸形成并包圍珠心組織。此時,直立胚珠逐漸向一側(cè)彎曲與珠柄平行,呈倒生生長(圖5, D、E)。周緣細胞數(shù)目增多,大孢子母細胞被數(shù)層周緣細胞與珠心表皮隔開(圖5, F)。因此,囊果草胚珠發(fā)育為厚珠心胚珠。囊果草大孢子母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成直線形排列的大孢子四分體(圖5, G、H)。隨后,四分體靠近珠孔端的3個大孢子相繼退化,僅合點端1個大孢子優(yōu)先分化,其體積增大,細胞核明顯(圖5, I)。珠孔端的3個大孢子逐漸退化消失,合點端大孢子逐漸向珠孔端移動,發(fā)育為功能大孢子(圖5, J)。功能大孢子進一步發(fā)育,形成了單核胚囊(圖5, K、L)。

2.2.2 雌配子體的發(fā)育

單核胚囊經(jīng)1次有絲分裂,形成2核胚囊。剛形成的2核胚囊中,2個核位于胚囊稍中央位置,核兩端液泡化明顯,此時,外珠被分化速度加快,包裹內(nèi)珠被和珠心組織(圖6, A、B)。胚囊腔逐漸增大,2核逐漸向胚囊兩端移動,此時,2核胚囊開始進行第2次有絲分裂,形成4核胚囊(圖6, C)。胚囊腔的液泡逐漸增大,內(nèi)、外珠被分化完全。隨后,4核胚囊發(fā)生第3次有絲分裂,形成8核胚囊(圖6, D)。同時,胚囊發(fā)生細胞質(zhì)分裂,形成7細胞8核的成熟胚囊。其中,珠孔端的3個核形成卵器,2個極核靠近合點端,3個反足細胞緊密排列在合點端,其細胞核明顯,細胞質(zhì)濃,分化完全的成熟胚囊發(fā)育為典型的單孢蓼型(圖6, E)。囊果草成熟胚囊珠孔端的卵器由1個卵細胞和2個助細胞組成,呈“品”字形排列(圖6, F)。助細胞分化早期,其胞質(zhì)濃厚,細胞內(nèi)未見明顯液泡化,細胞周圍具發(fā)達的絲狀器,其染色較深,呈漏斗狀排列(圖6, G)。隨著胚囊不斷發(fā)育,合點端的3個反足細胞逐漸退化消失,上下極核體積增大,逐漸融合,形成2核中央細胞(圖6, H、I)。

A. 單核胚囊第Ⅰ次有絲分裂; B. 2核胚囊; C. 4核胚囊; D, E. 8核蓼型胚囊, 胚囊內(nèi)合點端的反足細胞開始逐漸退化; F. “品”字形卵器, 示1個卵細胞和2個助細胞; G. 助細胞早期, 示絲狀器; H, I. 反足細胞退化, 2個極核逐漸融合. tes. 2核胚囊; fes. 4核胚囊; ac. 反足細胞; ec. 卵細胞; pn. 極核; sy. 助細胞; fa. 絲狀器。A-C, F-I. 標尺 = 50 μm; D, E. 標尺 = 100 μm。

3 討 論

有性生殖過程成功進行對植物的生命延續(xù)和種群擴增具有重要意義[32]。生殖過程的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常,都將不同程度地導致生殖敗育,因此,了解大/小孢子發(fā)生與雌/雄配子體發(fā)育規(guī)律對于植物有性生殖能否順利完成具有重要的作用[33-35]。本研究結(jié)果表明,囊果草花藥具4個花粉囊,花藥壁由5層細胞組成,由外至內(nèi)分別為1層表皮、1層藥室內(nèi)壁、2層中層和1層絨氈層,其藥壁發(fā)育為基本型,這與Davis[31]的描述一致。其藥室內(nèi)壁發(fā)生纖維狀加厚,腺質(zhì)型絨氈層細胞具2核或多核現(xiàn)象?；ㄋ幊墒烨?同側(cè)兩個花粉囊間的隔膜退化并消失。在解剖過程中發(fā)現(xiàn),花藥壁的不同發(fā)育階段均未出現(xiàn)異常現(xiàn)象。這些結(jié)果與同科植物南方山荷葉(Diphylleiasinensis)花藥壁的發(fā)育過程相似[36]。

花粉是植物遺傳信息的重要載體之一,具有較強的遺傳穩(wěn)定性[37]。開花植物的成熟花粉類型代表整個屬(科)的進化特征[31, 38]。據(jù)報道,開花植物中系統(tǒng)發(fā)育較原始物種均具有2細胞型花粉,而3細胞型花粉演化程度較高,被認為是開花植物對不同環(huán)境的適應性演化[39-40]。在小檗科植物中2細胞型花粉出現(xiàn)在十大功勞屬(Mahonia)[41]、山荷葉屬[36]、八角蓮屬(Dysosma)和桃兒七屬(Sinopodophyllum)[16]等大多數(shù)物種中,偶見3細胞型,且桃兒七屬亦存在單細胞型花粉。在本研究中,囊果草成熟花粉多為2細胞型,偶見3細胞型。這一結(jié)果與上述已報道的屬的花粉類型相吻合,反映了小檗科各屬種間系統(tǒng)發(fā)育的一致性,進而體現(xiàn)了囊果草雄配子體發(fā)育過程的穩(wěn)定性。

囊果草的大孢子發(fā)生與同科植物齒蕊十大功勞的發(fā)育特征表現(xiàn)出一致性[41],即具有倒生胚珠;胚珠具雙珠被和厚珠心;1個功能大孢子發(fā)育為7細胞8核的單孢蓼型胚囊;珠孔端助細胞早期形成發(fā)達的漏斗形絲狀器。研究表明,倒生胚珠、雙珠被、厚珠心及蓼型胚囊均為較原始的胚胎學性狀[42],且蓼型胚囊被認為是被子植物最常見的胚囊類型[43],且剛分化的助細胞絲狀器發(fā)達,成熟胚囊的絲狀器逐漸消失,在胚囊發(fā)育過程中,絲狀器可能承擔營養(yǎng)轉(zhuǎn)輸作用[44]。由此推測,囊果草的胚珠和胚囊發(fā)育過程均表現(xiàn)出明顯的原始性狀,體現(xiàn)了其胚胎發(fā)育的保守性。

生殖生物學特征在植物系統(tǒng)進化過程中屬于比較保守的性狀,是不同類群間親緣關系、系統(tǒng)進化進程的重要判斷依據(jù)[45-46]。有性繁殖過程的順利進行則有效保證了開花植物的結(jié)實結(jié)籽率[47]。囊果草的大/小孢子發(fā)生和雌/雄配子體發(fā)育過程正常,其發(fā)生、發(fā)育過程多表現(xiàn)出較原始的胚胎學性狀?？梢?囊果草是小檗科的較原始物種。

4 結(jié) 論

在形態(tài)結(jié)構(gòu)上,囊果草為兩性花,雌蕊存在囊泡狀膨大現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明,囊果草大/小孢子發(fā)生與雌/雄配子體發(fā)育順利完成,即花藥和胚囊發(fā)育過程正常,不僅可作為授粉植株,也可作為優(yōu)良的雜交母本。其發(fā)生/發(fā)育過程與小檗科已報道的其他物種具有相似性,表現(xiàn)出較原始的發(fā)育特征。該物種孢子發(fā)生與配子體發(fā)育的生殖生物學特征可為進一步對其進行雜交育種或人工繁育提供基礎資料,還可為該物種及其近緣科屬的系統(tǒng)學研究提供重要信息。

致謝：感謝陳可為、劉帥、楊帆和薛肖蘭幫助采集試材;感謝孫博洋幫助解決試驗過程中遇到的問題;感謝薛肖蘭和楊帆在試驗過程中的幫助。