三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CTL 基因SNP 位點(diǎn)E4-205 C/T 與抗溶藻弧菌相關(guān)性分析*

郝貴杰 林 鋒 母昌考 雷 寧 黃愛(ài)霞 崔雁娜沈亞芳 張海琪① 文 菁

(1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 廣東湛江 524048; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚(yú)類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖州市水產(chǎn)品品質(zhì)提升與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 浙江湖州 313001; 3.寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江寧波 315211)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹屬(Portunus), 廣泛分布于中國(guó)、日本等海域,因生長(zhǎng)速度快、味道鮮美而深受消費(fèi)者青睞。早在20 世紀(jì)80 年代被列為我國(guó)海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象, 是我國(guó)重要的一種海洋漁業(yè)資源。隨著育苗和養(yǎng)殖技術(shù)的日臻成熟, 梭子蟹養(yǎng)殖面積與產(chǎn)量逐年增加, 目前已成為沿海各省海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)品。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及集約化發(fā)展, 對(duì)三疣梭子蟹的生存環(huán)境產(chǎn)生較大的影響, 與此同時(shí)養(yǎng)殖環(huán)境的污染等因素也對(duì)其免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生了一定程度的損害, 導(dǎo)致其自身的抗病力下降, 對(duì)病害的易感性增加, 病害頻發(fā),例如弧菌引起的“乳化病”。由溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)引起的“乳化病”給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此, 研究三疣梭子蟹的免疫機(jī)制, 篩選與抗病相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行人工輔助育種, 選育優(yōu)良抗病品系具有重要意義。

分子標(biāo)記輔助選擇(molecular maker assisted selection, MAS)育種是利用分子標(biāo)記與決定目標(biāo)性狀的基因緊密連鎖的特點(diǎn), 通過(guò)檢測(cè)所篩選的分子標(biāo)記, 判定目的基因的存在, 從而進(jìn)行目標(biāo)性狀的選擇,與傳統(tǒng)的選育費(fèi)時(shí)費(fèi)力相比, 具有時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、而且受環(huán)境干擾較小等優(yōu)點(diǎn)(Dekkerset al, 2002;Collardet al, 2005; Masoudiet al, 2007)。而C-型凝集素(C-type lectin, CTL)是甲殼類動(dòng)物體液免疫中重要的免疫因子之一(McGrealet al, 2004), 是重要的模式識(shí)別受體之一(Wanget al, 2013a), 其對(duì)外來(lái)病原菌以及復(fù)雜的碳水化合物具有選擇性凝集作用, 同時(shí)具有調(diào)理素的作用, 介導(dǎo)血細(xì)胞對(duì)外來(lái)物質(zhì)的吞噬,和機(jī)體其他免疫因子一起抵御外來(lái)病原的入侵(Wanget al, 2009a; Weiet al, 2012; Wanget al, 2013b)。課題組前期通過(guò)克隆CTL基因的DNA 全長(zhǎng), 并在其四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子上共篩選到4 個(gè)SNP 位點(diǎn)及一個(gè)三堿基的缺失, 通過(guò)制備三疣梭子蟹易感群體及抗性群體, 分析了各多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與抗溶藻弧菌的相關(guān)性, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTL第四外顯子 SNP E4-205 C/T 具有三種基因型C/C、C/T 和T/T, 其T等位基因在抗病群體中出現(xiàn)的頻率(53%)顯著高于敏感群體(33.3%), T/T 基因型在易感群體中頻率為6.1%,在抗性群體中頻率為 21.2%, 具有顯著性差異(P=0.022) (Haoet al, 2015)。為初步闡明SNP E4-205 C/T 位點(diǎn)T/T 基因型三疣梭子蟹抗溶藻弧菌的分子機(jī)理, 本文對(duì)該位點(diǎn)非同義突變(ACT-AT T)導(dǎo)致的一個(gè)氨基酸改變(Thr-Ile)的兩種蛋白進(jìn)行了體外重組表達(dá)與純化, 并從體內(nèi)外研究了CTL的T/T 基因型梭子蟹在抗溶藻弧菌感染中的作用。以期為三疣梭子蟹免疫防御機(jī)制研究及抗病品系的選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 耗材與試劑 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) (45～60 g)購(gòu)自寧波鑫億鮮活水產(chǎn)有限公司, 正常投喂冰鮮小雜魚(yú)?；蚍中秃筠D(zhuǎn)至小池塘中的塑料筐內(nèi)飼養(yǎng)備用。

溶藻弧菌由寧波大學(xué)海洋學(xué)院王國(guó)良教授惠贈(zèng);副溶血弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

TIANamp Genomic DNA Kit、TIANamp Blood DNA Kit、RNAsimple Total RNA kit、FastQuant cDNA RT Kit (with gDNA)、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司; SsoFast EvaGreen supermix 購(gòu)自Bio-rad 公司; T-vector pMD19(Simple)、TaKaRa LA Taq、質(zhì)粒提取試劑盒、BamHI、XhoI、T4DNA 連接酶等購(gòu)自TaKaRa 公司; 卡那霉素、Trans1-T1、pET-30a(+)、BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金公司; Agarose Gel DNA Purification Kit 購(gòu)自Axygen 公司; Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司; Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所; 其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 Mx3005P 熒光定量 PCR 儀(Stratagene 公司); Rotor-Gene 6000 熒光定量PCR 儀(德國(guó)Qiagen 公司); Biometra TGradient PCR 儀購(gòu)(華粵行儀器有限公司); JY920-IIN 超聲波裂解器(寧波新芝); 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀SpectraMax 190 (美國(guó)MD 公司);Smart Spec 3000 核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);Q-Exactive 質(zhì)譜儀(Thermo Scientific 公司)。

1.2 活體三疣梭子蟹SNP 基因分型

隨機(jī)選取300 只健康三疣梭子蟹, 抽取少量血淋巴后繼續(xù)喂養(yǎng)。血淋巴樣品DNA 提取按照TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 核酸濃度統(tǒng)一稀釋至20～30 ng/μL 備用。采用小片段擴(kuò)增法進(jìn)行HRM 分型(Liewet al, 2004), 并以標(biāo)準(zhǔn)基因型樣品為對(duì)照。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的 CTL 基因 SNP E4-205 C/T 位點(diǎn)序列, 設(shè)計(jì)并篩選1 對(duì)特異性、靈敏性 均 優(yōu) 的 引 物, HRM-124 F: 5′-AAATGCCTACT GGAGGAGAGAAACA-3′和HRM-124 R: 5′-TTTCCT CGTTACTTC TCACAAATCG-3′, 片段大小為124 bp。PCR 反應(yīng)體系: 10 μL SsoFast EvaGreen supermix、0.8 μL HRM-124F (10 μmol/L)、0.8 μL HRM-124R(10 μmol/L)、1 μL DNA 模板(20 ng/μL)、雙蒸水補(bǔ)足20 μL。采用帶有HRM 分析功能的Rotor-Gene 6000熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 擴(kuò)增條件為: 98 °C 2 min, 40 個(gè)循環(huán)(98 °C 5 s, 58 °C 20 s)。利用儀器自帶的HRM 分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析, 分析閾值設(shè)為90%, 比較已知基因型樣品和待測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)視圖和差異視圖, 對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行SNP 分型, 每個(gè)樣品4 個(gè)平行。引物合成及PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 T/T 和C/C 基因型CTL 編碼蛋白的原核表達(dá)及純化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的CTL 基因序列(GenBank:JX195096.1), 設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物: CTL-BD-F: 5′-CC CATATGACTGGCTTCAGGCTGCTGT-3′(含Nde I 酶切位點(diǎn)), CTL-BD-R: 5′-CGGATTCCTCACAAATCG GACTTACA-3′ (含BamH I 酶切位點(diǎn)), 預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為438 bp, 引物由南京金斯瑞生物公司進(jìn)行合成。以SNP E4-205 T/T 和C/C 基因型的梭子蟹cDNA 樣品為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 目的片段分別命名為CTL-ACT 及CTL-ATT, 代表密碼子變異(ACT-ATT)導(dǎo)致所編碼氨基酸改變(Thr-Ile)。PCR 擴(kuò)增體系: 5 μL 10×Ex Taq buffer、0.5 μL Ex Taq 酶、4 μL dNTP Mixture、1 μL CTL-BD-F、1 μL CTL-BD-R、1 μL cDNA、ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件: 94 °C 5 min; 94 °C 50 s,54 °C 50 s, 72 °C 1 min, 33 個(gè)循環(huán); 72 °C 10 min, 4 °C 10 min, 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR 產(chǎn)物鑒定。

采用購(gòu)自Axygen 公司的柱式DNA 膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物。將目的片段克隆至T 載體, 進(jìn)行 PCR、酶切及測(cè)序鑒定, 將構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒PET-CTL-ATT 及PET-CTL-ACT, 并轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細(xì)胞, 挑取單克隆進(jìn)行鑒定、保存。將含CTL-ATT及CTL-ACT 的重組表達(dá)菌轉(zhuǎn)接到LB 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。次日, 按1︰100 比例接種到新鮮LB 液體培養(yǎng)基(含Kan 50 μg/mL), 37 °C, 250 r/min 恒溫?fù)u至OD600達(dá)到0.6～0.8 時(shí), 加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo), 同時(shí)設(shè)置未誘導(dǎo)組。低溫離心收集菌體沉淀, 對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎后采用咪唑梯度洗脫法進(jìn)行蛋白純化, 經(jīng)透析濃縮后再測(cè)定濃度, 蛋白進(jìn)行 SDSPAGE 電泳檢測(cè), 純化產(chǎn)物保存于–20 °C 備用。

1.4 重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT 的質(zhì)譜鑒定

將膠塊剪成1～2 mm3大小, 純水漂洗兩次, 依次進(jìn)行脫色(25 mmol/L NH4HCO3, 50%乙腈水溶液)、脫水(先50%乙腈溶液, 后100%乙腈溶液)、還原(含10 mmol/L DTT 和25 mmol/L NH4HCO3的水溶液)、烷基化(含50 mmol/L IAM 和25 mmol/L NH4HCO3的水溶液)處理; 加入25 mmol/L NH4HCO3清洗10 min,后依次用 50%乙腈溶液、100%乙腈溶液脫水處理30 min; 吸出多余液體, 加入10 μL 酶解工作液(含0.02 μg/μL 胰蛋白酶的酶解覆蓋液)吸脹30 min, 再加入20 μL 酶解覆蓋液, 37 °C 水浴酶解16 h, 將上清轉(zhuǎn)至新離心管; 加入50 μL 肽段萃取液(含5%甲酸, 67%乙腈的水溶液)于剩下的膠中, 37 °C 水浴20 min 后低速離心, 合并上清, 揮干后脫鹽。將揮干的多肽樣品溶解Buffer A (含0.1%甲酸-水溶液)中, 后進(jìn)行液相分離, 液相A 液為0.1%甲酸-水溶液, B 液為0.1%甲酸-乙腈溶液; 色譜柱Trap column 以100%的A 液平衡, 樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣, 并吸附到Trap column柱上, 再經(jīng) Analysis column 色譜柱分離, 流速為300 nL/min; 樣本間用空白溶劑30 min 流動(dòng)相梯度清洗一次; 酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive 質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 不同基因型三疣梭子蟹的溶藻弧菌感染實(shí)驗(yàn)

將T/T、C/T 及C/C 三種基因型梭子蟹分為三個(gè)組, 各組均設(shè)有感染組和對(duì)照組, 溶藻弧菌7.8×106CFU/mL (預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)注射量為0.2 mL/只。感染后不同時(shí)間(0、3、6、12、24、48、72、96 h)進(jìn)行血淋巴及肝胰腺細(xì)菌分離, 冰上采取梭子蟹的肝胰腺和肌肉組織并迅速置于液氮罐中, 后轉(zhuǎn)入–80 °C 保存待用。

1.6 溶藻弧菌在三疣梭子蟹組織中的復(fù)制

根據(jù)溶藻弧菌的膠原蛋白酶基因序列, 設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物: JY142-F: 5′-TTTGGCAAGGTCTGT TTGGTTAC-3′, JY142-R: 5′-GTGGCTTACACGTT GGAATGATC-3′, 并構(gòu)建含溶藻弧菌膠原蛋白酶基因片段的重組質(zhì)粒pMD19-JY142。根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒抽提pMD19-JY142 質(zhì)粒DNA, 并測(cè)定其濃度和純度, 根據(jù)公式: 質(zhì)粒拷貝數(shù)(單位: copies/μL) =(6.02×1014×質(zhì)粒濃度) / [(T 載體DNA 長(zhǎng)度+目的基因片段長(zhǎng)度)×660], 計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。利用雙蒸水將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋成102～1098 個(gè)梯度備用, 提取感染后不同時(shí)間點(diǎn)的組織樣品 DNA, 定量后作為待測(cè)樣品模板, 與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品一起進(jìn)行AQ-PCR (absolute quantitative PCR)反應(yīng), 每個(gè)樣品測(cè)定 3 次。根據(jù)SuperReal Premix Plus (SYBR Green)說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系, 熒光定量PCR 儀Mx3005P 進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 兩種重組蛋白的凝集活性檢測(cè)

1.7.1 小鼠紅細(xì)胞凝集活性 健康小鼠進(jìn)行心臟采血, 保存于4 °C 冰箱中, 臨用前3 000 r/min 離心3 min, 取血細(xì)胞以0.85%生理鹽水洗三次后, 配成2% (V/V)血細(xì)胞懸液備用。于96 孔微量血凝板中進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn), 每孔加入25 μL 的TBS-?, 取25 μL 兩種重組蛋白各做連續(xù)2 倍稀釋, 再加入25 μL 的2%血細(xì)胞, 室溫靜置1～2 h, 按文獻(xiàn)觀察并記錄紅細(xì)胞凝集情況(戴華生, 1983)。

1.7.2 細(xì)菌凝集活性 所用菌株為金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌以及酵母菌為代表。具體步驟如下: 各菌經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后, 8 000 r/min 離心5 min; 棄去培養(yǎng)基后, 加入TBS 緩沖液, 重新懸起菌體再次離心, 按此重復(fù)清洗菌體三次, 徹底去除培養(yǎng)基成分。使用TBS-I 重懸菌體, 并通過(guò)測(cè)定菌液濃度將其稀釋至1.5×109cell/mL; 取20 μL 重組蛋白至酶標(biāo)板孔中,20 μL BSA (1 mg/mL)溶液作為對(duì)照組, 再取10 μL 菌懸液加入并混勻, 室溫下孵育45 min 后, 取10 μL 至載玻片上, 在顯微鏡下觀察。

1.8 兩種重組蛋白對(duì)溶藻弧菌的抑菌活性

采用液體生長(zhǎng)方法檢測(cè)重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT 對(duì)溶藻弧菌的抑制作用。將溶藻弧菌在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜, 將菌液用TSB 稀釋濃度至OD550為0.001 左右, 在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入50 μL 菌液和 50 μL 梯度稀釋的重組目的蛋白(64 μg/mL 倍比稀釋至 2 μg/mL); 陰性對(duì)照組為50 μL 菌液和50 μL BSA (64 μg/mL)的混合溶液; 陽(yáng)性對(duì)照組為50 μL 菌液和50 μL Kana (64 μg/mL)的混合溶液?？傮w積為100 μL, 每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù);將培養(yǎng)板置30 °C、100 r/min 的搖床培養(yǎng), 分別在0、1、2、4、6、8、10、12、24 h, 將細(xì)胞板置酶標(biāo)儀測(cè)定OD550值。

1.9 兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結(jié)合活性

本實(shí)驗(yàn)以篩選CTL SNP 的溶藻弧菌作為所用的包被菌, 將菌株培養(yǎng)到OD600為1.0 左右, 并用包被液重懸使其終濃度為5×108個(gè)/mL。按100 μL/孔將菌液加入96 孔酶標(biāo)板, 4 °C 孵育過(guò)夜, PBST 洗滌3 次,3～5 min/次; 然后每孔加入200 μL 含3% BSA 的PBS,37 °C 封閉3 h, 同上洗滌; 各孔加入不同濃度的重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT (16 μg/mL 倍比稀釋至0.5 μg/mL) 100 μL, PBS 作為陰性對(duì)照, 30 °C 孵育2 h,同上洗滌; 每孔加入100 μL 一抗His-tag 抗體(1︰1 000,V/V), 37 °C 溫育1 h, 同上洗滌; 再加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L) (1︰250,V/V), 37 °C 溫育1 h, 同上洗滌; 每孔加入200 μL TMB 顯色液, 避光孵育10～30 min, 然后每孔加入50 μL 2 mol/L 硫酸溶液中止反應(yīng), 于450 nm 測(cè)定吸光度, 當(dāng)樣品OD450值/陰性對(duì)照OD450值≥2 時(shí)判定為陽(yáng)性。

1.10 兩種重組蛋白與細(xì)菌PAMP 的結(jié)合活性研究

參考Wang 等(2016)的方法略作修改, 目的是用ELISA 方法測(cè)定兩種重組蛋白與病原相關(guān)分子模式PAMPs 結(jié)合活性的差異。所用的PAMPs 有脂多糖、菌肽聚糖、葡聚糖 G 及脂磷壁酸。用包被液將各PAMP 稀釋至200 μg/mL, 按100 μL/孔將菌液加入96孔酶標(biāo)板, 4 °C 孵育過(guò)夜; 配制含0.5 mL/L Tween20的PBS 即PBST 洗液, 滿孔加液洗滌, 每次3～5 min,共洗滌3 次; 然后每孔加入200 μL 含3% BSA 的PBS,置于37 °C 水浴鍋封閉3 h, 同上洗滌; 加入不同濃度的重組蛋白CTL-ACT 和CTL-ATT (64 μg/mL 倍比稀釋至2 μg/mL) 100 μL, PBS 作為陰性對(duì)照, 30 °C 孵育2 h, 同上洗滌; 后續(xù)步驟同1.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻弧菌感染后不同基因型三疣梭子蟹的死亡率

通過(guò)HRM 分析對(duì)300 只三疣梭子蟹進(jìn)行了基因分型(表1), 結(jié)果顯示C/T 基因型共140 只, 占46.7%;T/T 基因型共49 只, 占16.3%; C/C 基因型共111 只,占37%。不同基因型梭子蟹感染溶藻弧菌后的死亡情況(表1, 圖1), C/T、T/T 和C/C 基因型梭子蟹的累積死亡率分別為81.4%、57.1%和82%, 結(jié)果表明T/T基因型三疣梭子蟹的累積死亡率極顯著低于其他基因型(P=0.001)。

圖1 CTL SNP E4-205 C/T 位點(diǎn)不同基因型梭子蟹感染溶藻弧菌的死亡率Fig.1 Cumulative mortality of swimming crabs expressing SNP genotypes at the CTL E4-205 locus upon V. alginolyticus infection

表1 三種基因型在E4-205 位點(diǎn)的分布及感染溶藻弧菌后的死亡率Tab.1 Distribution of the three genotypes at the E4-205 locus, and its mortality after infected with V. alginolyticus

2.2 溶藻弧菌在不同基因型三疣梭子蟹體內(nèi)的拷貝情況

根據(jù)各模板的熒光值變化規(guī)律自動(dòng)生成溶藻弧菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= –3.691×lg(X)+41.36,其中Y為CT 值,X為起始模板的拷貝數(shù), 相關(guān)系數(shù)為0.999, 說(shuō)明在質(zhì)粒模板濃度范圍內(nèi)其線性關(guān)系較好,可以用于檢測(cè)分析溶藻弧菌的拷貝。按照建立的溶藻弧菌AQ-PCR 方法, 測(cè)定不同基因型三疣梭子蟹感染溶藻弧菌后不同時(shí)間肝胰腺和肌肉中溶藻弧菌的拷貝情況(見(jiàn)圖2)。發(fā)現(xiàn)肝胰腺中12 h 前T/T 組細(xì)菌拷貝數(shù)極顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.01), 之后的時(shí)間內(nèi)細(xì)菌拷貝數(shù)差異不明顯; 肌肉中3 h 時(shí)T/T 組細(xì)菌拷貝數(shù)極顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.01), 6 h 時(shí)T/T組顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.05), 12 h 時(shí)各組細(xì)菌拷貝數(shù)無(wú)顯著差異, 而24 h 時(shí)T/T 組細(xì)菌拷貝數(shù)極顯著低于C/C 和C/T 組(P<0.01), 且感染12 h 之后肌肉中的細(xì)菌拷貝數(shù)明顯高于肝胰腺。結(jié)果表明三疣梭子蟹CTL 基因SNP 位點(diǎn)E4-205 C/T 的變異與其體內(nèi)溶藻弧菌的復(fù)制存在相關(guān)性, 存在于T/T 基因型梭子蟹肌肉組織中或肝胰腺組織中的細(xì)菌拷貝數(shù)在一定時(shí)間內(nèi)均顯著低于其他基因型。

圖2 三疣梭子蟹不同基因型肝胰腺、肌肉組織中的溶藻弧菌拷貝數(shù)Fig.2 Copies of V.alginolyticus in different genotype P.trituberculatus infected by V.alginolyticus

2.3 重組蛋白CTL-ACT 及CTL-ATT 的表達(dá)、純化及鑒定

成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒 PET-30a/CTL-ACT、PET-30a/CTL-ATT 并進(jìn)行重組表達(dá)。陽(yáng)性重組菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后, 利用SDS-PAGE 檢測(cè)重組蛋白CTL-ACT 和CTL-ATT 的表達(dá)。結(jié)果表明, 兩個(gè)蛋白在37 °C 誘導(dǎo)4 h 時(shí)后以包涵體形式存在, 蛋白分子量約為17.6 kDa (如圖3)。以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)的Bradford法測(cè)定純化的目的蛋白得率約為CTL-ACT 0.8 mg/L,CTL-ATT 0.6 mg/L。

圖3 SDS-PAGE 鑒定目的蛋白純化Fig.3 Purification of the target fusion protein

對(duì)純化蛋白譜帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解及MALDI- TOF/TOF 質(zhì)譜分析鑒定(見(jiàn)圖4), 結(jié)果表明所切下的兩種重組蛋白有多個(gè)肽段與三疣梭子蟹C 型凝集素PtLP的氨基酸序列完全匹配(GenBank 登錄號(hào)ACC86854.1),由此可以判定, 上述蛋白條帶即為重組表達(dá)的目的蛋白, 兩個(gè)差異蛋白成功獲得了體外重組包涵體表達(dá), 可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 重組蛋白的凝集活性分析

按照常規(guī)方法分別測(cè)定了兩種重組蛋白對(duì)小鼠紅細(xì)胞及相關(guān)細(xì)菌的凝集活性, 結(jié)果表明兩者均有凝集小鼠紅細(xì)胞的活性, 且CTL-ATT 比CTL-ACT 活性稍強(qiáng), 但兩者凝集效價(jià)均較低, 僅為21(見(jiàn)圖5)。檢測(cè)兩種重組蛋對(duì)金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌以及酵母菌的凝集作用, 結(jié)果表明即使在一定Ca2+存在的條件下, 兩種重組蛋白均不能凝集任何一種細(xì)菌, 呈現(xiàn)的溶藻弧菌凝集見(jiàn)圖6。

圖5 兩種重組蛋白小鼠紅細(xì)胞凝集活性Fig.5 Hemagglutinating activity of two kinds of recombinant proteins

圖6 兩種重組蛋白對(duì)溶藻弧菌的凝集活性(400×)Fig.6 The agglutination activity of V. alginolyticus induced by two kinds of recombinant proteins

2.5 重組蛋白的抑菌活性結(jié)果

利用酶標(biāo)儀測(cè)定經(jīng)作用的溶藻弧菌最佳吸光度OD550的吸光值, 繪制兩種重組蛋白以及 Kana 與BSA 對(duì)照均在64 μg/mL 濃度作用不同時(shí)間, 對(duì)溶藻弧菌生長(zhǎng)抑制的作用曲線。結(jié)果如圖7, Kana 具有強(qiáng)烈的抑菌作用, 細(xì)菌吸光度保持在0.2 以下; 兩種重組蛋白和BSA 組在前4 h 內(nèi)未見(jiàn)明顯的細(xì)菌吸光度增加, 從6 h 開(kāi)始, 隨著細(xì)菌繁殖的增加吸光度逐漸增加;與BSA 對(duì)照組相比較, 兩種重組蛋白對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用, 且CTL-ATT 蛋白比CTL-ACT 蛋白具有更強(qiáng)的抑菌活性。應(yīng)用SPSS 19.0 單因素方差分析各組在培養(yǎng)24 h 時(shí)的吸光值, 結(jié)果表明各組吸光值差異極顯著(P<0.01), 說(shuō)明24 h 時(shí)CTL-ATT 蛋白的抗溶藻弧菌活性顯著高于CTL-ACT 蛋白。

圖7 兩種重組蛋白不同時(shí)間的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of two kinds of recombinant proteins in different hours

2.6 重組蛋白的溶藻弧菌結(jié)合活性

用ELISA 方法檢測(cè)兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結(jié)合活性(圖8), 發(fā)現(xiàn)隨著重組蛋白濃度的增加, 各組吸光值也隨之升高, 說(shuō)明兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結(jié)合也是濃度依賴性模式; 而在同樣濃度下,CTL-ATT 與溶藻弧菌的結(jié)合活性要高于CTL-ACT 與溶藻弧菌的結(jié)合活性。

圖8 兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結(jié)合活性Fig.8 ELISA analysis of the binding activity between two kinds of recombinant proteins and V. alginolyticus

2.7 重組蛋白的PAMPs 結(jié)合活性

為了檢測(cè)兩種重組蛋白與病原相關(guān)分子模式PAMPs 的相互作用, 我們利用不同濃度的重組蛋白與脂多糖、肽聚糖、葡聚糖及脂磷壁酸進(jìn)行孵育, 后進(jìn)行ELISA 檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9, 發(fā)現(xiàn)CTL-ATT蛋白與四種PAMPs 的結(jié)合活性均高于CTL-ACT 蛋白, 兩個(gè)重組蛋白與四種PAMPs 結(jié)合強(qiáng)弱依次為L(zhǎng)PS>GLU>LTA>PGN; 兩種重組蛋白與四種PAMPs的結(jié)合均具有濃度依賴性, 即隨著蛋白濃度的升高與PAMPs 結(jié)合活性更強(qiáng)。應(yīng)用SPSS 19.0 中單樣本T檢驗(yàn)分析兩種重組蛋白分別與各PAMP 結(jié)合的差異性, 結(jié)果表明均為差異極顯著(P<0.01), 說(shuō)明CTL-ATT蛋白與四種PAMPs 的結(jié)合活性顯著高于CTL-ACT蛋白。

圖9 兩種重組蛋白與四種PAMPs 的結(jié)合活性Fig.9 ELISA analysis of the binding activity of two kinds of recombinant proteins and four kinds of PAMPs

3 討論

分子標(biāo)記輔助選擇育種相較于與傳統(tǒng)選育, 具有準(zhǔn)確、快速、不受環(huán)境條件干擾的優(yōu)點(diǎn)(Dekkerset al, 2002; Masoudiet al, 2007)。但目前眾多的研究報(bào)道仍局限于分子標(biāo)記的篩選, 而真正將其應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇育種并取得成功的例子仍較少, 主要原因是尚未弄清楚分子標(biāo)記的作用機(jī)制。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期從三疣梭子蟹免疫基因 C-型凝集素中篩選到的SNP E4-205 C/T 位點(diǎn), 本研究利用PCR-HRM 方法對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行基因分型, 后以溶藻弧菌感染不同基因型的三疣梭子蟹, 探究不同基因型梭子蟹體內(nèi)細(xì)菌復(fù)制的差異性, 以期初步闡明該抗病分子標(biāo)記抗溶藻弧菌的作用機(jī)理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 溶藻弧菌感染后T/T 基因型組的三疣梭子蟹死亡率顯著低于C/T和C/C 基因型組; 可初步表明篩選的SNP E4-205 C/T位點(diǎn)與三疣梭子蟹抗病性存在一定關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的AQ-PCR 分析結(jié)果表明, 溶藻弧菌感染后12 h 前T/T組三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉中的細(xì)菌拷貝數(shù)顯著低于C/C 和C/T 組, 12 h 之后肌肉中的細(xì)菌拷貝數(shù)明顯高于肝胰腺, 說(shuō)明細(xì)菌已突破肝胰腺的免疫防線, 在肌肉中大量復(fù)制, 進(jìn)而產(chǎn)生“肌肉乳化病”的癥狀(王國(guó)良等, 2006; 劉淇等, 2007)。同時(shí)也說(shuō)明T/T 基因型梭子蟹抗溶藻弧菌的能力明顯高于另外兩個(gè)基因型,可與三疣梭子蟹死亡情況相佐證。以上研究表明從三疣梭子蟹CTL 基因中篩選出的SNP E4-205 C/T 位點(diǎn)與抗溶藻弧菌相關(guān), 初步說(shuō)明可應(yīng)用于三疣梭子蟹分子標(biāo)記輔助選擇育種工作。

為了進(jìn)一步闡明易感及抗性基因型梭子蟹抗溶藻弧菌的差異性, 對(duì)該位點(diǎn)非同義突變(ACT-ATT)導(dǎo)致的一個(gè)氨基酸改變(Thr-Ile)的兩種蛋白進(jìn)行了體外重組表達(dá)與純化, 并對(duì)兩種重組蛋白進(jìn)行活性分析。凝集活性結(jié)果表明, 兩者均有較弱的凝集小鼠紅細(xì)胞的活性, 且CTL-ATT 比CTL-ACT 活性稍強(qiáng), 但不能凝集所測(cè)定的任何一種細(xì)菌。這與已報(bào)道的一些C-型凝集素不同, 例如中華絨螯蟹重組C-型凝集素EsCTLDcp、EsCTL1、EsCTL2 能夠凝集G+菌金黃色葡萄球菌S.aureus, G-菌嗜水氣單胞菌A.hydrophila以及副溶血弧菌V.parahaemolyticus(Huanget al,2014a); 中國(guó)對(duì)蝦的 FcLec2、FcLec4, 日本對(duì)蝦的PjLec, 南美白對(duì)蝦的LvLec 等均能夠凝集一種或多種細(xì)菌(Wanget al, 2009b; Zhanget al, 2009)。這可能與該包涵體表達(dá)蛋白純化復(fù)性時(shí)活性丟失, 或者該蛋白本身就不具有體外凝集細(xì)菌的活性有關(guān)。此外,兩種重組蛋白對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)均具有一定抑制作用, 其具有濃度依賴性, CTL-ATT 蛋白比CTL-ACT蛋白的抑菌活性更強(qiáng)。這一結(jié)果從體外證明了三疣梭子蟹CTL 抗感染能力及T/T 基因型可作為抗病品系篩選的分子標(biāo)記。

C-型凝集素作為一類模式識(shí)別受體, 主要是通過(guò)對(duì)微生物表面糖類的識(shí)別即病原相關(guān)分子模式PAMP 而參與先天免疫, 有關(guān)的研究在蝦蟹C-型凝集素已有許多報(bào)道(Guoet al, 2011; Zhanget al, 2013;Huanget al, 2014b)。本研究中, 我們分別使用不同濃度的兩種重組蛋白與LPS、PGN、GLU 及LTA 進(jìn)行孵育, 然后進(jìn)行ELISA 檢測(cè), 結(jié)果表明, 兩種重組蛋白均能夠結(jié)合不同的 PAMPs, 結(jié)合強(qiáng)弱依次為L(zhǎng)PS>GLU>LTA>PGN, 這種廣譜的結(jié)合活性說(shuō)明三疣梭子蟹CTL 在抵抗多種病原微生物中發(fā)揮重要的免疫作用。就濃度依賴性來(lái)看, 兩種重組蛋白與四種PAMPs 的結(jié)合均具有濃度依賴性, 即它們與PAMPs的結(jié)合活性隨著蛋白濃度的升高而更強(qiáng)。但同濃度的CTL-ATT 與四種 PAMPs 的結(jié)合活性均高于CTL-ACT 與相應(yīng)PAMPs 的結(jié)合。進(jìn)而ELISA 方法測(cè)定了兩種重組蛋白與溶藻弧菌的結(jié)合活性, 結(jié)果表明兩者的結(jié)合活性同樣具有濃度依賴性, 且同濃度下CTL-ATT 的結(jié)合活性要高于CTL-ACT, 該結(jié)果表明SNP E4-205 C/T 位點(diǎn)非同義突變改變了編碼蛋白的生物學(xué)功能, 增強(qiáng)了機(jī)體抗感染的能力, 因此更進(jìn)一步證明了T/T 基因型與抗溶藻弧菌的相關(guān)性。上述研究結(jié)果將為SNP E4-205 C/T 標(biāo)記的輔助選擇應(yīng)用, 加速三疣梭子蟹抗病品系育種進(jìn)程提供有力的科學(xué)依據(jù), 同時(shí)將對(duì)其他水產(chǎn)動(dòng)物抗病分子標(biāo)記的機(jī)制研究提供有用的借鑒手段。

4 結(jié)論

本研究對(duì)三疣梭子蟹C-型凝集素即CTL 基因SNP E4-205 C/T 位點(diǎn)非同義突變(ACT-ATT)導(dǎo)致的一個(gè)氨基酸改變(Thr-Ile)的兩種蛋白進(jìn)行了體外重組表達(dá)與純化, 并從體內(nèi)外研究了CTL 的T/T 基因型梭子蟹在抗溶藻弧菌感染中的作用, 結(jié)果表明T/T 基因型三疣梭子蟹抗感染能力明顯優(yōu)于C/C 基因型, 該結(jié)果為選擇T/T 基因型作為抗溶藻弧菌的分子標(biāo)記培育三疣梭子蟹抗病品系提供了科學(xué)依據(jù)。