縊蟶(Sinonovacula constricta)耐氨氮關聯SNP 驗證及相關基因NKA 在氨氮脅迫下的表達特征分析*

胡晨馨 呂麗媛 孫改改,3 姚韓韓 林志華,① 董迎輝①

(1.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院 浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室 浙江寧波 315100; 2.浙江萬里學院寧海海洋生物種業(yè)研究院 浙江寧波 315604; 3.寧波大學海洋學院 浙江寧波 315832)

氨氮是水環(huán)境中常見的非生物脅迫因子之一,當水生動物體內氨氮積累到一定程度時會導致組織受損和退化、離子調節(jié)失衡、氧化應激、炎癥反應、生長減緩和高死亡率(Renet al, 2014; Chenget al,2015; Zhanget al, 2018)。水環(huán)境中的氨氮主要有離子態(tài)氨(N)和非離子態(tài)氨(NH3)兩種形式, 二者可以相互轉化, 并處于動態(tài)平衡, 機體內的氨氮大多以N的形式存在(付瑩等, 2018)。由于NH+4脂溶性極低且可與水結合形成水合離子, 不易透過細胞膜, 因此水生動物機體內的大多數氨氮的跨膜運輸是通過各種轉運蛋白來實現的(Weineret al, 2019)。細胞外的氨氮主要通過銨轉運體(AMT)和Rhesus (Rh)糖蛋白促進擴散, 也可由 K+轉運蛋白如 Na+/K+-ATP 酶(NKA)、Na+-K+-2Cl 共轉運蛋白(NKCC)和K+通道蛋白(KCN)等進行跨膜運輸(Tresguerreset al, 2020)。有研究表明, 鈉氫交換蛋白(NHE)、囊泡相關蛋白(VAMP)以及水通道蛋白(AQP)家族的某些成員也可能參與氨的跨膜轉運(Walker, 2014)。總之, 水生動物具有非常復雜的氨氮運輸調控網絡, 而NKA 是參與氨排泄的重要通道之一。

NKA 是一種重要的陽離子泵蛋白, 由α 亞基、β亞基及調節(jié)亞基組成, 其中α 亞基包含陽離子、核苷酸以及配體結合位點(Caoet al, 2021)。NKA 可以在ATP 和Mg2+的催化下轉運Na+和K+, 從而控制細胞質膜上的Na+、K+濃度梯度, 維持細胞內外液的滲透壓(?echováet al, 2016)。此外, 由于NH4+在水溶液中具有與K+幾乎相同的物理特性, 因此NH4+可以取代K+通過NKA 進行跨膜運輸(Tresguerreset al, 2020)。目前, 在印度囊鰓鲇(Heteropneustes fossilis) (Chewet al, 2020)、龜殼攀鱸(Anabas testudineus) (Ipet al,2012)、首長黃道蟹(Metacarcinus magister) (Martinet al, 2011)、岸蟹(Carcinus maenas) (Fehsenfeldet al,2016)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii) (Shenet al,2021)、鱗硨磲(Tridacna squamosa) (Ipet al, 2015)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans) (Adlimoghaddamet al, 2015)等多種動物中已證明NKA 參與氨氮的排泄過程。

近年來, 隨著貝類基因組信息的豐富、高通量單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片的開發(fā)以及基因分型技術的快速發(fā)展, 全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)已廣泛應用于貝類生長、抗逆和品質等重要經濟性狀的遺傳位點鑒定。例如, 利用GWAS 技術, 在蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)中篩選出了2 個與生長顯著關聯的SNP 位點(Ninget al, 2019), 在皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)中發(fā)掘了27 個與耐高溫性狀相關的遺傳標記(Menget al,2020), 在長牡蠣(Crassostrea gigas)中定位了一批與脂肪酸、糖原、鋅等營養(yǎng)性狀相關的SNP(Shiet al,2020)。在耐氨氮關聯SNP 研究方面, Xu 等(2019)已用GWAS 分析在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)中鑒定出25 個與耐氨氮性狀相關的SNP 及7 個候選基因; Lv 等(2023)利用GWAS 分析在縊蟶(Sinonovacula constricta)中鑒定出11 個與耐氨氮性狀顯著相關的SNP 位點, 并進一步發(fā)掘了5 個關聯候選基因, 包括NKA、β-半乳糖苷酶(GLB1)、四肽重復蛋白 28(TTC28)、微管蛋白β (TUBB)和真核翻譯延伸因子1a(eEF1A)。GWAS 關聯的SNP 位點和候選基因作為重要的遺傳標記, 對進一步研究氨氮耐受的分子調控機制和基因組選擇育種具有重要意義。

縊蟶是我國重要的海水養(yǎng)殖貝類, 是蝦(蟹)-貝混養(yǎng)模式的主要養(yǎng)殖種類, 該養(yǎng)殖系統(tǒng)中的大量殘餌、糞便等有機廢物會增加底泥中的氨氮含量, 而縊蟶是一種典型的底棲穴居雙殼貝類, 其面臨的氨氮環(huán)境尤為嚴峻(Conget al, 2021; 柴欣如等, 2022)。已有大量研究表明, 縊蟶機體對于過量的氨存在特定的解毒方式和代謝途徑(陳凱鋒等, 2020; 張歡等,2020; Sunet al, 2021; Lvet al, 2022)。本研究對課題組前期通過全基因組關聯分析獲得的與氨氮耐受性狀顯著關聯的SNP 位點(g.21062868T>A)進行了驗證,并開展了位點關聯基因NKA的時間表達譜和蛋白組織定位分析, 探究氨氮脅迫下NKA基因在縊蟶鰓中的表達特征, 同時通過檢測NKA基因干擾后NKCC1基因的mRNA 表達量及血淋巴氨濃度, 探討NKA 在縊蟶氨氮排泄中發(fā)揮的作用, 為深入研究NKA 在貝類氨氮解毒過程中的功能及調控機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從寧波市海洋與漁業(yè)科技創(chuàng)新基地采集健康的1齡縊蟶[濕重(15.38±1.84) g, 殼長(59.36±2.52) mm],實驗前暫養(yǎng)7 d, 海水鹽度為20±1, pH 值為8.1±0.1,溫度為(19.4±0.4) °C。每12 h 更換1/2 海水, 每天08:00 和18:00 投喂小球藻(Chlorella vulgaris)。

1.2 氨氮脅迫實驗

在進行氨氮脅迫實驗前, 先隨機取6 顆縊蟶的鰓、肝胰腺、腸、足、外套膜、水管和閉殼肌, 液氮速凍后保存于–80 °C 超低溫冰箱中, 用于組織表達分析。參考Zhang 等(2020)縊蟶氨氮急性脅迫96 h 的半致死濃度(LC50-96 h), 以氨氮濃度180 mg/L 作為實驗組, 并設置對照組(正常海水)。每組120 顆縊蟶, 設置三個平行, 即每個平行40 顆。分別在實驗開始后0、3、6、12、24、48、72 和96 h 隨機采集6 顆縊蟶, 取其鰓, 液氮速凍完全后, 保存于–80 °C 超低溫冰箱中,用于實時熒光定量PCR (qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(western blotting, WB)檢測。在脅迫96 h 時, 分別從兩組中取6 顆縊蟶, 剪取鰓組織進行常規(guī)石蠟切片和NKA 蛋白組織定位研究。

1.3 耐氨氮性狀關聯SNP 位點的驗證

選取180 mg/L 作為縊蟶氨氮脅迫實驗的濃度,每2 h 對死亡個體進行采樣, 實驗共持續(xù)180 h, 取150 顆最早死亡的個體(氨氮敏感組, SG, 18～96 h)和死亡率到達約80%時剩余的150 顆存活個體(氨氮耐受組, TG, 180 h)的足經液氮速凍后儲存在-80 °C 超低溫冰箱中。使用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN, 北京)提取總DNA, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性, 并使用Nano Drop2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, 美國)檢測DNA 濃度。

利用競爭性等位基因特異性PCR (KASP)分析技術進行基因分型。使用PolyMarker 設計SNP 位點(g.21062868T>A) 的 KASP 引 物 (http://www.polymarker.info/)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。使用384 孔板進行KASP 測定, 反應體系為10 μL, 包括5 μL FLu-Arms 2×PCR 混合物、0.5 μL KASP 引物混合物、1 μL 基因組DNA (濃度為20 ng/μL)和3.5 μL 去離子水。PCR 程序在LightCycler?480II PCR 儀(Roche, 瑞士)中進行, 每次運行均包括非模板對照(NTC)。反應程序為: 94 °C, 15 min; 94 °C,20 s, 61 °C, 1 min, 共10 個循環(huán); 94 °C, 20 s, 55 °C,1 min, 共26 個循環(huán)。PCR 擴增后使用Intellics 軟件(LGC Douglas Scientific, 美國)讀取每個樣本的基因型。

表1 本實驗所用引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences used in this study

1.4 qRT-PCR 分析

使用Trizol 法提取總RNA, 1%瓊脂糖電泳檢測其完整性, 使用Nano Drop2000 分光光度計(Thermo Fisher Scientific, 美國)檢測 RNA 濃度。使用PrimeScript?RT reagent kit with gDNA eraser (TaKaRa,日本)合成cDNA。根據本實驗室縊蟶基因組數據庫中的NKA(GenBank 登錄號: MN052993.1)、NKCC1(GenBank 登錄號: OQ244851)以及 18S ribosomal RNA (18S) (GenBank 登錄號: AY695800.2)基因序列(Donget al, 2020), 通過Primer Premier 5.0 軟件設計PCR 引物(表1), 并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。每對引物在進行熒光定量前都通過普通PCR 驗證。使用LightCycler?480II PCR 儀(Roche, 瑞士)進行qRT-PCR 反應, 總體系為20 μL, 包括cDNA和ddH2O 共8 μL, 10 μmol/L 上下游引物各1 μL,2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme,南京) 10 μL。反應程序為: 95 °C 預變性10 min, 95 °C 10 s, 60 °C 退火1 min, 循環(huán)40 次, 72 °C 延伸7 min,運行結束后對PCR 產物進行溶解曲線分析, 確保只有單一的PCR 產物得到擴增。選擇18S基因作為內參基因(表1), 用2–ΔΔCt法計算縊蟶NKA 基因(Sc-NKA)的相對表達量(Sunet al, 2022)。

1.5 Sc-NKA 多克隆抗體制備及氨氮脅迫后Sc-NKA蛋白免疫印跡檢測

根據Sc-NKA基因序列設計引物(表1), 擴增開放閱讀框(ORF)區(qū)域。將獲得的 PCR 產物連接到pET-32A(+)質粒(TaKaRa, 日本), 構建含有His-tag 的融合蛋白表達重組質粒 pET-32A-Sc-NKA。將陰性pET-32A 質粒和陽性重組質粒分別轉化到大腸桿菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)進行原核蛋白表達,挑選陽性菌體接種至含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中,37 °C 振蕩培養(yǎng)過夜。使用1 mmol/L IPTG 在37 °C下誘導4 h, 收集誘導表達后的菌體重懸并超聲, 利用Ni-NTA 樹脂對蛋白進行純化。隨后將抗原與等體積的佐劑完全乳化后對新西蘭白兔進行多點皮下注射。采集全血后進行抗體純化和ELISA 測定效價, 并將制備好的抗體保存于–20 °C 冰箱中。

利用RIPA 裂解液(碧云天, 上海)裂解縊蟶鰓組織, 通過總蛋白定量測定試劑盒(南京建成)測定各樣品的蛋白濃度, 并用裂解液稀釋到同樣濃度, 加入5×loading buffer 沸水煮沸10 min。配置合適濃度的凝膠(12%分離膠和 5%濃縮膠), 等量上樣后進行SDS-PAGE 電泳, 將凝膠中含有的目標蛋白轉移到PVDF 膜上(60 mA, 3 h), 利用TBST 溶解的10%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。然后分別利用兔抗Sc-NKA 多克隆抗體(HuaBio, 杭州, 1︰500 比例稀釋)和兔抗GAPDH 多克隆抗體(上海生工, 1︰3 000 比例稀釋)在4 °C 下孵育過夜, 再用HRP 標記的驢抗兔IgG 在室溫下進行二抗孵育(上海生工, 1︰2 000 比例稀釋)1 h。最后, 將增強化學發(fā)光液(ECL)滴加至PVDF 膜上, 在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國)下觀察和拍攝圖像。以GAPDH 作為內參蛋白, 利用ImageJ2 軟件對結果進行灰度值計算(Sunet al, 2022)。

1.6 Sc-NKA 蛋白免疫熒光檢測

鰓樣品用 4%多聚甲醛固定, 然后在梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、100%)中脫水, 置于二甲苯中透明, 石蠟包埋切片(厚度為4 μm)。將烤片后的組織切片用二甲苯脫蠟, 梯度乙醇復水, 置于0.01 mol/L 檸檬酸鈉溶液中進行抗原修復; 用5%牛血清白蛋白(BSA,生工生物工程, 上海)室溫封閉1 h, 甩干后滴加兔抗Sc-NKA 多克隆抗體(HuaBio, 杭州, 1︰400 比例稀釋)于4 °C 濕盒中孵育過夜; 滴加FITC 標記的驢抗兔IgG二抗(1︰150 比例稀釋)室溫避光孵育1 h; 滴加DAPI染色液(碧云天, 上海)對細胞核進行染色, 在Eclipse 80i 熒光顯微鏡(Nikon, 日本)下觀察并拍攝鰓組織。

1.7 RNA 干擾實驗

Sc-NKA和陰性對照(NC, 非特異性的siRNA 對照)的siRNA 序列由生工生物工程(上海)股份有限公司制備(表1, 利用無 RNase 水將干擾鏈配制成0.22 μg/μL。將240 顆縊蟶隨機分為氨氮脅迫組(AG,180 mg/L)和對照組(CG, 正常海水), 使用50 μL 微量進樣器將siRNA-NKA干擾鏈、NC 鏈及無RNase 水(空白對照) 18.45 μL 分別注射到兩組40 顆縊蟶的閉殼肌中。在注射后0、6、12、24 和48 h 隨機收集各缸中6 顆縊蟶, 采集其鰓和血淋巴用于qRT-PCR 檢測和血氨濃度測定。

1.8 血氨濃度測定

依據血氨測定試劑盒(A086-1-1, 南京建成)說明書檢測樣品反應后的吸光值。其原理主要是用蛋白質沉淀劑將血清中的蛋白沉淀以抑制酶活性, 防止游離氨產生, 并去除大部分干擾呈色的物質。通過Berthelot 反應在630 nm 處測定吸光值, 與標準溶液比較計算血淋巴中的氨濃度。根據公式計算樣品中的血氨濃度:

1.9 數據分析

使用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著，所有實驗數據均以平均值±標準差(SD)表示。用卡方(χ2)檢驗計算SNP 位點在SG 組和TG 組間基因型頻率的差異。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 耐氨氮性狀關聯SNP 位點的驗證與分析

應用KASP 分析方法在驗證群體中對SNP 位點(g.21062868T>A)進行基因分型, 并與縊蟶耐氨氮性狀進行關聯分析, 分別在TG 組和SG 組中檢測到148和150 個熒光信號。分析結果表明, 該SNP 位點存在3 種基因型, 其中純合子TT 為優(yōu)勢基因型, 在TG 組有92 個個體, SG 組有74 個個體, 在兩組中的基因型頻率分別為62.16%和49.33%; 雜合子TA 在TG 組有18 個個體, SG 組有37 個個體, 在兩組中的基因型頻率分別為12.16%和24.67%; 純合子AA 在TG 組有38 個個體, SG 組有39 個個體, 在兩組中的基因型頻率分別為25.68%和26.00%。對TG 組和SG 組的基因型頻率進行卡方檢驗后發(fā)現, 該SNP 位點在兩組間差異顯著(P<0.05) (表2)。

表2 TG 和SG 組SNP 基因型頻率的比較Tab.2 Comparison in genotype frequency of the SNP between the TG and SG groups

2.2 Sc-NKA 基因對氨氮脅迫的響應

利用qRT-PCR 和WB 技術檢測了Sc-NKA基因在縊蟶不同組織中的表達量以及在氨氮脅迫下鰓中mRNA 和蛋白的表達水平。結果顯示,Sc-NKA基因在鰓、肝胰腺、腸、足、外套膜、水管和閉殼肌中均有表達, 且在鰓組織中的表達量最高(P<0.05), 其次是腸和肝胰腺, 在外套膜、閉殼肌和足中的表達量最低(圖1a)。在180 mg/L 的高氨脅迫后, 鰓中Sc-NKA基因mRNA 表達水平在6～48 h 相比0 h 顯著升高(P<0.05), 總體呈現先升高后降低的趨勢, 且在24 h達到最大值, 約為0 h 的2 倍(圖1b)。通過對Sc-NKA蛋白印跡灰度值分析發(fā)現, WB 的結果與qRT-PCR 基本一致(圖1c)。

圖1 縊蟶Sc-NKA 基因的組織表達分析及在氨氮脅迫下鰓中mRNA 和蛋白的表達變化Fig.1 Expression of Sc-NKA in different tissues and the mRNA and protein expression in the gill of S. constricta under ammonia stress

2.3 Sc-NKA 蛋白的組織細胞定位

縊蟶的鰓絲由單層上皮細胞(柱狀細胞和扁平細胞)以及其圍繞的血腔組成。DAPI 染色顯示, 鰓組織纖毛處含有大量排列整齊的單層柱狀細胞, 而靠近鰓內腔的約一半區(qū)域為扁平細胞。免疫熒光結果顯示,Sc-NKA 在鰓組織的柱狀細胞和扁平細胞中均有表達(FITC 綠色熒光信號), 且其在柱狀細胞中的熒光信號強于其他部位。同時, 與CG 組相比, TG 組表現出更強烈的陽性信號(圖2)。

圖2 縊蟶鰓組織Sc-NKA 蛋白的免疫熒光分析Fig.2 Immunofluorescence of Sc-NKA in the gill

2.4 Sc-NKA 基因RNA 干擾對NKCC1 基因表達和血氨含量的影響

利用RNAi 技術檢測了Sc-NKA基因表達受到抑制后對NKCC1基因表達和血氨含量的影響。qRT-PCR 結果表明, 注射siRNA-NKA干擾鏈6、12、24 和48 h 后, AG 組和CG 組Sc-NKA的mRNA 表達水平顯著下調(P<0.05), 其中AG 組干擾效率分別為23%、84%、83%和80%, CG 組分別為33%、78%、85%和79% (圖3a, 3b)。對Sc-NKA基因的干擾影響了Sc-NKCC1的mRNA 表達水平。在12～48 h, AG 和CG 兩組中siRNA-NKA實驗組的Sc-NKCC1表達量相較陰性和空白對照組均顯著降低(P<0.05), 其中AG組在12、24 和48 h 分別下降37%、99%和99%, CG組分別下降44%、80%和95%。同時, 整個干擾實驗期間siRNA-NKA實驗組的Sc-NKCC1mRNA 表達水平總體呈現下降趨勢, 與Sc-NKA的表達量變化趨勢一致(圖3c, 3d)。

圖3 RNAi 后鰓組織中Sc-NKA 和Sc-NKCC1 基因mRNA 相對表達量和血氨濃度的變化Fig.3 Relative expression of Sc-NKA and Sc-NKCC1 gene in the gill and ammonia concentration in the hemolymph after RNAi

使用血氨測定試劑盒測定Sc-NKA基因RNAi后縊蟶血淋巴中的氨濃度。結果表明, AG 組和CG組的siRNA-NKA實驗組中血氨濃度在6～48 h 均顯著高于陰性和空白對照組(P<0.05), 其中 AG 組血氨濃度在48 h 達到最大值(5 163.16 μmol/L), 約為對照組的2.32 倍; CG 組血氨濃度在6 h 達到最大值(161.03 μmol/L), 約為對照組的1.23 倍(圖3e, 3f)。此外, 在實驗期間, 陰性和空白對照組的上述指標之間均沒有顯著差異(P>0.05) (圖3a～3f)。

3 討論

氨氮是水產養(yǎng)殖環(huán)境中最常見的脅迫因子之一,氨氮水平的升高是水生動物健康和生命的主要威脅(Zhaoet al, 1997; Harriset al, 2001)。氨氮濃度過高會對機體產生多種危害, 因此需要將其轉化成毒性較小的分子或迅速排出, 以避免有害物質在體內積聚(Larsenet al, 2014)?？O蟶作為一種底棲濾食性貝類,經常面臨高濃度的氨氮環(huán)境, 是研究氨氮解毒分子機制的重要模式物種(Penget al, 2016)。本課題組Lv等(2023)對縊蟶耐氨氮性狀進行了GWAS 分析, 發(fā)現了一個位于NKA基因(Chr8: 21038162-21054270)下游8.6 kb 基因間區(qū)內的顯著性SNP 位點(g.21062868T>A)(P<0.05), 本實驗通過KASP 技術驗證了其與縊蟶氨氮耐受性狀之間存在顯著關聯(P<0.05), 推測該SNP可能通過影響與其相鄰的NKA基因的表達參與氨氮脅迫下的調控過程。近年來, 許多研究表明, 基因間區(qū)包含非編碼RNA 如miRNA、rRNA、snRNA 和tRNA等尚未鑒定的重要功能元件(Hesset al, 2007; Zhonget al, 2014; Caiet al, 2016; Kanwalet al, 2019)?；蜷g區(qū)含有的增強子DNA 序列可以控制相距幾千個堿基對以上的離散基因的表達(Ingvarssonet al, 2016;Bakhtiarizadehet al, 2018)。這一發(fā)現也在水產動物中得到廣泛驗證, 如在對刺參(Apostichopus japonicus)疣足數量進行GWAS 分析中, 篩選并驗證了與PATS1基因相鄰的位于基因間區(qū)的顯著性SNP 位點, 證明其在細胞生長和增殖中的重要作用(Zhuet al, 2022);在對長牡蠣脂肪酸品質性狀的GWAS 分析中, 選取了7個與不飽和脂肪酸含量顯著相關的SNP 位點, 這些位點均位于基因間區(qū), 最后通過分析與這些SNP 相鄰的NFYA基因的mRNA 表達水平等方式證明該基因可能參與調控牡蠣飽和脂肪酸代謝(史瑞輝, 2020)。

研究表明, 絕大多數水生生物, 包括兩棲動物、硬骨魚和大多數無脊椎動物的大部分含氮廢物都是直接以NH4+的形式排出, 這是因為NH3在水環(huán)境中很容易轉化為NH4+并通過離子轉運系統(tǒng)由鰓排泄到體外(Cragget al, 1961; Woodet al, 1989; Wright, 1995;Weihrauchet al, 2009; Wrightet al, 2009)。水生動物的鰓是一個多功能器官, 是進行多種生理過程的場所,包括氨排泄、離子轉運、酸堿平衡和氣體交換等(涂翰卿等, 2019)。作為離子調節(jié)系統(tǒng)中的重要成員,NKA 通常在鰓中發(fā)揮作用(Henryet al, 2012)。在對遮目魚(Chanos chanos)鰓中的NKA 蛋白進行免疫熒光檢測后發(fā)現, NKA 位于鰓上皮細胞的基底外側膜上(Tanget al, 2011)。同樣, 在黑小鯢(Hynobius nigrescens)的鰓扁平細胞和富含線粒體的細胞基底外側膜上觀察到了NKA 的免疫陽性反應(Uchiyamaet al, 2011)。本研究發(fā)現, NKA 定位于縊蟶鰓的扁平細胞與柱狀細胞中, 與參與滲透調節(jié)的水通道蛋白(AQP)在鰓中的定位結果較為一致(Ruanet al, 2022)。此外, 氨氮脅迫后的NKA 陽性信號較未脅迫的對照組明顯更強, 且高氨脅迫下鰓中NKA基因的mRNA和蛋白表達水平均有顯著上調(P<0.05), 這一現象在印度囊鰓鲇(Chewet al, 2020)和龜殼攀鱸(Ipet al,2012)中也有發(fā)現, 表明NKA對氨氮刺激具有明顯的響應。在亞致死氨氮濃度(1.5 mg/L 和3 mg/L)脅迫下菲律賓蛤仔(Tapes philippinarum)鰓中的NKA 酶活性明顯增強(P<0.05), 且用相同濃度的K+或NH+4進行體外實驗時, NKA 均受到最大程度的激活, 表明NH+4可以替代K+從而被NKA 運輸(Pagliaraniet al,2008)。暴露于高氨下,NKA基因的高表達可能是調節(jié)機體對氨氮應激的適應性反應: NKA 可以像結合K+一樣結合NH+4, 然后直接將其從細胞中轉運出來(Tresguerreset al, 2020)。在本研究中, 高氨脅迫6～48 h,NKA基因的持續(xù)高表達表明, 短期氨氮脅迫下縊蟶可通過誘導NKA基因mRNA 的轉錄水平和蛋白豐度上調, 來促進鰓中NH+4的跨膜轉運。

NH+4在水溶液中不能通過自由擴散的方式穿過細胞膜, 而需要轉運蛋白參與(Henryet al, 2012)。由于NH+4與K+的離子半徑、遷移率等物理特性相似,NH+4可以競爭性結合K+轉運蛋白, 如NKA、NKCC和KCN (Kinneet al, 1986; Choeet al, 2000; Weineret al, 2007)。研究發(fā)現, 紅鰭東方 鲀(Takifugu rubripes)、熱帶雀鱔(Atractosteus tropiccus)、許氏齒彈涂魚(Periophthalmodon schlosseri)在氨氮脅迫下鰓中NKA和NKCC1的mRNA 表達水平均上調, 表明二者在氨排泄過程中均發(fā)揮作用(Nawataet al, 2010; Chewet al, 2015; Aranda-Moraleset al, 2021)。本實驗通過對Sc-NKA基因進行RNAi 后發(fā)現, 縊蟶血淋巴氨濃度在干擾后顯著升高, 證實了NKA 在氨氮轉運中的重要作用。同時, qRT-PCR 檢測Sc-NKA基因干擾后Sc-NKCC1的mRNA 表達量發(fā)現, 對NKA基因的抑制會下調NKCC1基因的轉錄水平, 表明兩者之間可能存在著協(xié)同作用。水生生物通過鰓細胞基底外側膜上的NKCC1替代K+運輸NH+4的生理活動將導致流入上皮細胞的Na+增加, 因此, 增強NKA 酶的活性對于維持Na+電化學梯度至關重要(Chewet al, 2020)。也有研究推測,NKA 能夠維持Na+梯度進而驅動NKCC1 (任琴, 2015)。結合本研究的實驗結果, 當NKA表達水平降低時, 細胞內的Na+濃度將增加, 影響細胞內外的Na+濃度梯度,進而使NKCC1的表達受到抑制。

4 結論

本研究在縊蟶氨氮耐受和敏感群體中驗證了位于NKA基因下游的SNP 位點(g.21062868T>A)與氨氮耐受性狀存在顯著關聯性(P<0.05), 分析了該基因在高氨脅迫下的時空表達規(guī)律, 發(fā)現氨氮刺激可以誘導Sc-NKA的高表達。Sc-NKA 蛋白定位于縊蟶鰓的柱狀細胞和扁平細胞中, 并且在氨氮脅迫后蛋白豐度增加。此外, 干擾Sc-NKA使血淋巴中的氨濃度升高, 并下調了同為K+轉運蛋白的Sc-NKCC1基因的轉錄水平, 這表明Sc-NKA 在氨運輸過程中具有重要作用。后續(xù)將深入探究NKA 與其他轉運蛋白在氨氮排泄中的互作關系, 為進一步闡明縊蟶氨氮脅迫響應分子機制奠定理論基礎, 也為耐氨氮新品種的分子標記輔助選育工作提供候選基因。