鏈狀裸甲藻所產(chǎn)麻痹性貝類毒素在翡翠貽貝體內(nèi)的累積、轉(zhuǎn)化和排出*

許翠婭

(1.福建省水產(chǎn)研究所 福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門(mén) 361013; 2.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心 福建廈門(mén) 361013)

鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum)屬于甲藻門(mén)裸甲藻屬, 為廣溫廣鹽種, 主要分布于北美、歐洲、意大利和日本, 我國(guó)珠江口海域和東南沿海也有分布。鏈狀裸甲藻是高毒性赤潮種, 可產(chǎn)生麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PST) (郭皓, 2004)。2017 年6月, 在福建省漳州、泉州海域發(fā)生了鏈狀裸甲藻赤潮,這是福建省首次記錄的鏈狀裸甲藻赤潮, 造成了赤潮海域的貽貝、牡蠣、扇貝等濾食性貝類體內(nèi)PST 含量超標(biāo), 并通過(guò)食物鏈傳遞, 導(dǎo)致多地民眾因食用翡翠貽貝(Perna viridis)中毒的事件發(fā)生(陳火榮, 2018)。

PST 廣泛分布于世界各地的海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)中(Peacocket al, 2018), 被認(rèn)為是嚴(yán)重危害人類健康的藻源毒素之一(Etheridge, 2010), 它不但直接影響生物活性, 威脅海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定, 還通過(guò)食物鏈傳遞到貝類、魚(yú)類等生物體內(nèi), 尤其是通過(guò)雙殼貝類作為食物鏈傳遞媒介, 對(duì)世界各地民眾健康和安全造成嚴(yán)重威脅。目前, 已有一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)PST 在貝類體內(nèi)的累積、轉(zhuǎn)化和排出進(jìn)行研究, 其中關(guān)于亞歷山大藻產(chǎn)生的PST 相關(guān)報(bào)道較多(顏天等,2001; Lassuset al, 2007; Murrayet al, 2009; 田華等,2010; Andreset al, 2019; 張海濤等, 2023)。研究表明,貝類對(duì)PST 的累積和排出能力差異很大, 這與貝類種類、對(duì)產(chǎn)毒藻的敏感性, 以及產(chǎn)毒藻的種類、密度、細(xì)胞毒性等有較大關(guān)系(Chenet al, 2001; 朱明遠(yuǎn)等,2003)。來(lái)自不同海域的鏈狀裸甲藻不同株系間的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)毒能力也存在很大差異(Yamamotoet al,2002), 關(guān)于鏈狀裸甲藻產(chǎn)生的PST 在貝類體內(nèi)的累積、轉(zhuǎn)化和排出研究國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。

弄清貝類對(duì)PST 的累積、分布及排出的過(guò)程, 了解毒素生成及組分轉(zhuǎn)化, 是正確解析貝類中PST 危害形成的前提和基礎(chǔ)。貽貝作為世界性分布的沿岸底棲雙殼類, 由于其分布廣、活動(dòng)性低、有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和對(duì)污染物有較強(qiáng)的生物富集能力, 已被廣泛地用于海洋污染的生物監(jiān)測(cè)中(張少娜等, 2004)。與其他貝類相比, 貽貝對(duì)PST 具有更高的累積能力(De Carvalhoet al, 2019)。本文以鏈狀裸甲藻為產(chǎn)毒藻, 研究其產(chǎn)生的PST 在翡翠貽貝體內(nèi)的累積、轉(zhuǎn)化和排出規(guī)律, 以期為貝類脫毒與凈化、赤潮減災(zāi)和水產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試生物

試驗(yàn)用鏈狀裸甲藻和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)藻液均由廈門(mén)大學(xué)海洋微型生物保種中心提供, 鏈狀裸甲藻藻種于2017 年6 月分離自泉州海域。翡翠貽貝來(lái)自漳州東山烏礁灣海域, 選擇活力好、健康、無(wú)外傷的貽貝, 運(yùn)送至福建省水產(chǎn)研究所生態(tài)試驗(yàn)場(chǎng)。將貽貝置于規(guī)格25 L 的玻璃水槽中, 按試驗(yàn)密度進(jìn)行馴養(yǎng)(2 只/L)。馴養(yǎng)3 d, 期間每日定時(shí)換水, 并投喂中肋骨條藻(水體中藻液初始密度5×106cells/L)兩次, 全天充氣。馴養(yǎng)期間貽貝活力良好、攝食正常, 死亡率0.3%。馴養(yǎng)后貽貝取樣測(cè)定PST 含量作為本底值。試驗(yàn)前隨機(jī)抽取30 只貽貝進(jìn)行生物性狀測(cè)量, 試驗(yàn)貽貝殼長(zhǎng)(3.2±0.1) cm, 殼高(7.0±0.3) cm,全重(25.1±2.7) g。

1.2 試驗(yàn)藥劑與主要試驗(yàn)儀器

1.2.1 試驗(yàn)藥劑 主要化學(xué)試劑包括: 乙腈(色譜純), 德國(guó)Sigma公司生產(chǎn); 甲酸(色譜純), 美國(guó)ACS公司生產(chǎn); 甲酸銨(分析純), 上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn); 乙酸(分析純)、氨水(分析純), 西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)。PST標(biāo)準(zhǔn)品包括石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、脫氨基甲?；惗舅?dcSTX、dcGTX2&3)、N-磺酰胺基甲酰類毒素(GTX5、C1&2)、膝溝藻毒素(GTX1&4、GTX2&3), 均購(gòu)自加拿大海洋生物研究所。

1.2.2 主要試驗(yàn)儀器 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(TSQ Quantis, 美國(guó)賽默飛世爾公司)、冷凍離心機(jī)(5804R, 德國(guó)艾本德公司)、超純水系統(tǒng)(Elixs3+A10,美國(guó)密理博公司)、手持式勻漿機(jī)(T10, 德國(guó)IKA公司)、超聲波細(xì)胞破碎儀(JY92-IIN, 寧波新芝公司)、超聲波清洗器(KQ-600DB, 江蘇昆山舒美公司)、渦旋振蕩器(MS3, 德國(guó)IKA 公司)、多管渦旋混合儀(U14005-826, 美國(guó)VWR 公司)、固相萃取裝置(Visiprep 24 DL, 美國(guó)Supelco公司)、全自動(dòng)正置熒光顯微鏡(DM6B, 德國(guó)萊卡公司)。

1.3 試驗(yàn)方法與條件

試驗(yàn)所用海水來(lái)自廈門(mén)海域。試驗(yàn)期間海水鹽度30.0±0.1, 水溫(23±1) °C, pH 值8.00～8.12, 溶解氧7.19～7.38 mg/L。

1.3.1 短期累積試驗(yàn) 短期累積試驗(yàn)周期12 h。設(shè)置3 個(gè)試驗(yàn)組和1 個(gè)對(duì)照組, 各組均設(shè)3 個(gè)平行。從馴養(yǎng)3 d 的貽貝中選出大小一致、健康的貽貝, 每組24 只貽貝×3 個(gè)平行, 分別置于盛有12 L 海水的玻璃水槽中。試驗(yàn)組投喂處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的鏈狀裸甲藻,設(shè)置3 個(gè)試驗(yàn)梯度, 藻液初始密度分別為2.5×105、5.0×105和1.0×106cells/L。對(duì)照組投喂處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的中肋骨條藻, 藻液初始密度為5.0×106cells/L。投喂后0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 取貽貝樣品用于檢測(cè)PST 含量, 每次每缸分別隨機(jī)取3 只貽貝。

1.3.2 長(zhǎng)期累積試驗(yàn) 自然海域環(huán)境條件下, 鏈狀裸甲藻赤潮周期為7 d 左右, 長(zhǎng)期累積試驗(yàn)周期適當(dāng)延長(zhǎng), 設(shè)置為10 d。試驗(yàn)設(shè)置1 個(gè)試驗(yàn)組和1 個(gè)對(duì)照組, 各組均設(shè)3 個(gè)平行。從馴養(yǎng)3 d 的貽貝中選出大小一致、健康的貽貝, 每組40 只貽貝×3 個(gè)平行, 分別置于盛有20 L 海水的玻璃水槽中, 試驗(yàn)組和對(duì)照組分別投喂處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的鏈狀裸甲藻和中肋骨條藻, 試驗(yàn)密度分別為5.0×105和5.0×106cells/L。每日投喂藻液2 次、換水1 次, 試驗(yàn)過(guò)程中隨貽貝的減少相應(yīng)減少所投喂的藻量和更換的水體積。試驗(yàn)開(kāi)始后分別在1、2、4、6、8 和10 d 取貽貝樣品, 每次每缸分別隨機(jī)取3 只貽貝用于檢測(cè)PST 含量, 并在換水前取混合均勻的海水樣品0.8 L 用于檢測(cè)水體PST含量, 該水樣包括海水、貽貝濾食后剩余的藻細(xì)胞和糞便等混合物。

1.3.3 排出試驗(yàn) 長(zhǎng)期累積試驗(yàn)結(jié)束后, 停止投喂鏈狀裸甲藻, 徹底換水后投喂中肋骨條藻(藻液初始密度5.0×106cells/L), 開(kāi)始排出試驗(yàn), 試驗(yàn)周期28 d。每4 d 取一次貽貝樣品(每次每缸3 只)和混合均勻的海水樣品(每次每缸0.8 L), 分別用于檢測(cè)貽貝和水體中PST 含量。

1.3.4 PST 的提取與分析 PST 的測(cè)定采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。貽貝、藻及水體中PST 的前處理方法參考相關(guān)文獻(xiàn)(岳亞軍等, 2017; Liuet al, 2020a),液相色譜及質(zhì)譜條件參考GB 5009.213-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中麻痹性貝類毒素的測(cè)定》。貽貝分不同部位取樣檢測(cè), 包括內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織(外套膜、鰓和足等) 3 部分。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PST 各組分毒素含量換算成PST 總毒力(STXeq)進(jìn)行比較, 計(jì)算公式為:。式中,Xi為各種PST 組分的含量,ri為毒性因子。

應(yīng)用SPSS 22 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(LSD 多重比較法)和T檢驗(yàn)(α=0.05), 利用Excel 2007 軟件作圖, 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 鏈狀裸甲藻PST 毒素組成和含量

經(jīng)檢測(cè), 在鹽度30.0±0.1、水溫(23±1) °C 的環(huán)境條件下, 鏈狀裸甲藻PST 含量為(7.41±0.79) pg/cell。共檢出9 種PST 毒素, 分別屬于氨基甲酸酯類毒素(STX、neoSTX、GTX3), N-磺氨甲酰基類毒素(C1-2、GTX5)和脫氨甲酰基類毒素(dcGTX2-3、dcSTX), 其中以低毒性的C2 物質(zhì)的量百分比最高, 占39.4%, 其次為neoSTX(26.9%)、GTX5(18.5%)和STX(9.0%)占比較高, dcSTX(2.9%)、C1(2.8%)、GTX3(0.4%)、dcGTX3(0.2%)和dcGTX2(0.1%)占比較低。與其他海域的鏈狀裸甲藻相比, 本試驗(yàn)藻株毒素組成存在較大差異。澳大利亞海域藻株中主要組分為 C 毒素(C1-4), 含少量的B1-2、GTX2-3、dcSTX、STX 和neoSTX, 西班牙和葡萄牙藻株含有B1-2(Negriet al,2001); 新加坡海域藻株所產(chǎn)毒素主要組分為GTX1和GTX4, 含少量的GTX2/3、neoSTX 和STX(Holmeset al, 2002); 香港藻株主要組分為C 毒素(C1-2)、GTX5(B1)、dcGTX2-3 和dcSTX, 以C 毒素和GTX5為主(胡蓉等, 2012)。

2.2 PST 在翡翠貽貝體內(nèi)的短期累積

在貽貝的濾食作用下, 鏈狀裸甲藻細(xì)胞密度隨著時(shí)間的推移逐漸降低。在投喂0.5 h 后, 不同組別的藻液密度均下降了1 個(gè)數(shù)量級(jí), 1 h 后下降了約2 個(gè)數(shù)量級(jí), 1 h 后藻液密度下降的速度有所放緩, 12 h 后各試驗(yàn)組藻液密度均下降至很低的水平, 在102～103cells/L 的數(shù)量級(jí)(圖1)。

圖1 短期累積試驗(yàn)鏈狀裸甲藻細(xì)胞密度和翡翠貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量的變化Fig.1 Variations in cell density of Gymnodinium catenatum and content of PST in Perna viridis in the short-term accumulation experiment

對(duì)照組貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織(外套膜、鰓和足等)均未檢出PST。試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量基本呈波浪形上升的變化趨勢(shì), 累積0.5 h 后各試驗(yàn)組內(nèi)臟團(tuán)均可檢出PST (圖1)。2.5×105cells/L 試驗(yàn)組內(nèi)臟團(tuán)PST 含量波動(dòng)范圍為(111.9±8.7)～(236.2±0.8)μg/kg, 累積12 h 達(dá)到最大值; 閉殼肌和其他組織未檢出PST。5.0×105cells/L 試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量波動(dòng)范圍為(290.9±48.0)～(515.5±18.8) μg/kg, 累積2 h 達(dá)到峰值, 次高峰出現(xiàn)在累積 10 h, 為(457.8±21.0) μg/kg; 閉殼肌和其他組織未檢出PST。1.0×106cells/L 試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量波動(dòng)范圍為(339.2±6.5)～(1 068.6±62.0) μg/kg, 累積8 h 達(dá)到最大值, 超過(guò)食用貝類毒素安全標(biāo)準(zhǔn)(800 μg/kg), 次高峰出現(xiàn)在累積2 h, 為(775.4±20.8) μg/kg; 閉殼肌和其他組織分別在累積2 h 和0.5 h 后檢出PST, 含量均較低。短期累積期間, 內(nèi)臟團(tuán)PST 含量顯著高于閉殼肌和其他組織。累積12 h 后, 1.0×106cells/L 試驗(yàn)組內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織的 PST 含量分別占貽貝PST 總含量的91.9%、2.7%和5.4%。

3 個(gè)試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)均檢出7 種PST 組分, 包括: STX、neoSTX、C1、GTX5、dcSTX、dcGTX2 和dcGTX3, 在產(chǎn)毒藻中占比最高的C2(39.4%)和占比較低的 GTX3(0.4%)未檢出。產(chǎn)毒藻中主要組分neoSTX(26.9%)在貽貝體內(nèi)占比較低, 累積12 h 后在內(nèi)臟團(tuán)中占比為4.1%～6.1%。各試驗(yàn)組內(nèi)臟團(tuán)PST均主要以dcSTX、dcGTX2、C1 和GTX5 的形式存在。累積12 h 后, 各試驗(yàn)組內(nèi)臟團(tuán)主要毒素組分占比為:dcSTX(30.3%～38.0%) 、 dcGTX2(19.2%～22.8%) 、C1(14.9%～17.5%)和 GTX5(14.1%～15.0%) (圖2)。1.0×106cells/L 試驗(yàn)組閉殼肌和其他組織毒素組分與內(nèi)臟團(tuán)相比少了占比最低的dcGTX3, 其他PST 組分占比與內(nèi)臟團(tuán)相似。

圖2 短期累積試驗(yàn)各試驗(yàn)組翡翠貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 組分的變化Fig.2 Variations of PST components in visceral mass of Perna viridis during the short-term accumulation experiment

2.3 PST 在翡翠貽貝體內(nèi)的長(zhǎng)期累積和排出

長(zhǎng)期累積和排出試驗(yàn)中, 對(duì)照組貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織均未檢出PST。隨著累積時(shí)間的延長(zhǎng),試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織的PST 含量均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。內(nèi)臟團(tuán)的毒素累積速率顯著高于閉殼肌和其他組織, 內(nèi)臟團(tuán)PST 含量累積2 d 即超過(guò)食用貝類毒素安全標(biāo)準(zhǔn), 達(dá)到(1 223.8±64.7) μg/kg; 累積8 d 達(dá)到峰值(3 590.4±545.7) μg/kg,超過(guò)限量標(biāo)準(zhǔn)3.5 倍, 平均累積速率為448.8 μg/(kg·d);累積10 d 后PST 含量為(2 763.1±173.4) μg/kg。長(zhǎng)期累積期間試驗(yàn)組閉殼肌和其他組織PST 均未超標(biāo),含 量 范 圍 分 別 為(46.5±8.3)～(396.1±11.3)和(54.5±2.2)～(405.3±16.8) μg/kg。累積期間內(nèi)臟團(tuán)PST 含量顯著高于閉殼肌和其他組織, 閉殼肌和其他組織在同一時(shí)間則無(wú)顯著差異(圖3)。累積10 d 后, 內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織PST 含量分別占貽貝PST 總含量的88.4%、4.4%和7.2%。

圖3 長(zhǎng)期累積和排出試驗(yàn)翡翠貽貝不同組織PST 含量的變化Fig.3 Variations of PST content in different tissues of Perna viridis in the long-term accumulation and depuration experiment

排出過(guò)程貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織的PST含量均呈下降的變化趨勢(shì), 內(nèi)臟團(tuán)PST 含量在排出16 d 后低于食用貝類毒素安全標(biāo)準(zhǔn), 排出28 d 后內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織仍檢出 PST, 含量分別為(329.6±12.3)、(65.2±4.7)和(68.4±4.4) μg/kg。排出期間內(nèi)臟團(tuán)的PST 含量顯著高于閉殼肌和其他組織,閉殼肌和其他組織在同一時(shí)間則無(wú)顯著差異(圖3)。排出28 d 后貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織的排出率分別為88.1%、79.1%和76.3%?？傮w來(lái)看, 排出速率先快后慢, 前8 d 排出速率較快, 內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織平均每天毒素排出率分別為7.5%、6.6%和6.1%, 其中內(nèi)臟團(tuán)排出速率為207.4 μg/(kg·d), 后20 d 排出速率較慢, 內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織的平均每天毒素排出率分別為3.5%、2.8%和2.7%。內(nèi)臟團(tuán)的毒素排出速率顯著高于閉殼肌和其他組織, 閉殼肌和其他組織則無(wú)顯著差異。

長(zhǎng)期累積期間試驗(yàn)組貽貝閉殼肌和其他組織共檢出8 種PST 組分: STX、neoSTX、C1、C2、GTX5、dcGTX2、dcGTX3 和dcSTX, 內(nèi)臟團(tuán)多檢出GTX2,共9 種PST 組分。與短期累積試驗(yàn)相比, 內(nèi)臟團(tuán)多檢出2 種組分: C2 和GTX2, 與鏈狀裸甲藻相比少了GTX3、多了GTX2, 占比均較低。長(zhǎng)期累積過(guò)程中貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織中dcSTX 物質(zhì)的量百分比均呈增加的趨勢(shì)。累積10 d 后, 貽貝不同組織PST 均以dcSTX(41.2%～45.6%)物質(zhì)的量百分比最高,其次為GTX5(19.0%～21.4%)、dcGTX2(13.8%～14.4%)和C1(9.5%～11.7%), 不同組織這4 種組分所占比例較接近。試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)在排出4 d 后未檢出GTX2,排出28 d 未檢出C2。排出過(guò)程中dcSTX 占比繼續(xù)呈增加的趨勢(shì), 在閉殼肌和其他組織中占比增加得尤為顯著, 其余PST 組分占比總體下降。排出28 d 后,貽貝不同組織PST 均以dcSTX(51.1%～67.4%)占比最高, 其次為 dcGTX2(12.9%～16.1%)和 GTX5(8.8%～15.4%) (圖4)。

圖4 長(zhǎng)期累積和排出試驗(yàn)翡翠貽貝不同組織PST 組分的變化Fig.4 Variations of PST components in different tissues of Perna viridis during the long-term accumulation and depuration experiment

2.4 試驗(yàn)水體PST 毒素組成和含量

試驗(yàn)水體包括海水、貽貝濾食12 h 后剩余的少量藻細(xì)胞(102～103cells/L)和糞便等混合物。長(zhǎng)期累積試驗(yàn)對(duì)照組水體未檢出PST。試驗(yàn)組水體中PST 含量基本呈先上升后下降的變化趨勢(shì), 波動(dòng)范圍為(560.4±7.3)～(1 874.8±20.6) ng/L, 累積6 d 時(shí)PST 含量最高, 累積10 d PST 含量為(1 416.5±54.4) ng/L。排出試驗(yàn)水體中PST 含量呈下降的變化趨勢(shì), 下降速度先快后慢, 排出16 d 后下降速度緩慢。排出過(guò)程水體中PST 含量波動(dòng)范圍為(90.9±2.7)～(1 416.5±54.4)ng/L, 排出28 d PST 含量最低, 相比排出初始降低了93.6% (圖5)。

圖5 長(zhǎng)期累積和排出試驗(yàn)水體中PST 含量的變化Fig.5 Variations of PST content of seawater during the long-term accumulation and depuration experiment

長(zhǎng)期累積期間試驗(yàn)組水體中共檢出8 種PSTs 組分,分別為STX、neoSTX、dcSTX、dcGTX2、dcGTX3、GTX5、C1、C2, 貽貝內(nèi)臟團(tuán)中微量的GTX2 組分在水體中未檢出。累積試驗(yàn)期間水體中PST 各組分占比相對(duì)穩(wěn)定, 主要以C2(21.0%～24.8%)、GTX5 (17.6%～21.5%)、C1(17.6%～20.6%)和dcGTX2(12.6%～ 15.0%)形式存在, 累積10 d 主要PST 組分為C2(22.9%)、GTX5(21.5%)、C1(20.1%)和dcGTX2 (13.9%)。與累積試驗(yàn)結(jié)束時(shí)相比, 排出4 d 后水體中微量的dcGTX3未檢出, 排出20 d 后dcSTX 未檢出。排出期間水體中 PST 各組分占比波動(dòng)較大, 主要以 dcGTX2(12.9%～33.6%)、STX(11.2%～33.3%)、GTX5 (12.5%～25.8%)、C2(0～22.9%)和 C1(2.2%～20.1%)形式存在,其中dcGTX2 和STX 基本呈上升趨勢(shì), C1 則呈下降趨勢(shì)。排出28 d 水體中主要PST 組分為STX (28.7%)、dcGTX2(27.7%)、C2(18.1%)和GTX5(12.5%) (圖6)。

圖6 長(zhǎng)期累積和排出試驗(yàn)水體中PST 組分的變化Fig.6 Variations of PST components of seawater during the long-term accumulation and depuration experiment

3 討論

3.1 翡翠貽貝對(duì)PST 的累積和排出

短期累積試驗(yàn)結(jié)果表明, 試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST含量基本呈波浪形上升的變化趨勢(shì), 說(shuō)明毒素的累積并不是一個(gè)不斷累加的過(guò)程, 而是一個(gè)累積和排出同時(shí)進(jìn)行的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過(guò)程。PST 主要累積在貽貝內(nèi)臟團(tuán)中, 隨著產(chǎn)毒藻密度的成倍數(shù)增加, 內(nèi)臟團(tuán)PST含量也呈一定的倍數(shù)增加, PST 含量峰值出現(xiàn)的時(shí)間也相應(yīng)提前, 貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量與產(chǎn)毒藻密度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)投喂高密度(1.0×106cells/L)鏈狀裸甲藻時(shí), 貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量在累積2 h 后已達(dá)(775.4±20.8) μg/kg, 接近食用貝類毒素安全標(biāo)準(zhǔn), 累積8 h 后超標(biāo), 達(dá)到(1 068.6±62.0) μg/kg, 說(shuō)明翡翠貽貝具有較強(qiáng)的毒素累積能力。本試驗(yàn)產(chǎn)毒藻投喂頻率是12 h 一次, 鏡檢數(shù)據(jù)顯示, 投喂1 h 后藻細(xì)胞密度由1.0×106cells/L 下降至4.5×104cells/L, 下降了接近2 個(gè)數(shù)量級(jí)。而在自然海域中, 如果發(fā)生鏈狀裸甲藻赤潮, 產(chǎn)毒藻會(huì)持續(xù)維持在高密度水平, 當(dāng)藻細(xì)胞密度達(dá)到1.0×106cells/L 時(shí), 推測(cè)累積時(shí)間不到2 h, 貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量就會(huì)超過(guò)食用貝類毒素安全標(biāo)準(zhǔn)。

長(zhǎng)期累積期間, 試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織的PST 含量均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。試驗(yàn)期間投喂產(chǎn)毒藻的密度和頻率是保持一致的,貽貝的清濾率沒(méi)有顯著變化, 推測(cè)當(dāng)貽貝體內(nèi)PST累積到一定濃度時(shí), 其排出速度也會(huì)加快, 當(dāng)排出速度大于累積速度時(shí), 貽貝體內(nèi)PST 含量將下降。試驗(yàn)組貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量在累積2 d 超過(guò)食用貝類毒素安全標(biāo)準(zhǔn), 累積8 d 達(dá)到峰值(3 590.4±545.7) μg/kg。已有研究表明, 毛蚶(Scapharca subcrenata)攝食初始密度為 400 cells/mL 的鏈狀裸甲藻24 h 后, PST 含量為 207 μg/kg (林卓如等, 2022); 紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)攝食鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella) 7 d 后, 內(nèi)臟團(tuán)PST 含量高達(dá)6 815.36 μg/kg(張海濤等, 2023); 櫛孔扇貝(Chlamys farreri)在攝食塔瑪亞歷山大藻(A.tamarense) 5 d 后, 體內(nèi)毒素總量為1 903 μg/kg (邴曉菲等, 2017); 近江牡蠣(Ostrea rivularis)攝食微小亞歷山大藻(A.minutum) 5 d 后, 體內(nèi)毒素累積量為(3 069.2±178.2) MU/100g (解萬(wàn)翠等,2013)。可以看出, 不同試驗(yàn)中貝類體內(nèi)毒素累積情況差異顯著, 這與產(chǎn)毒藻的種類、毒性大小、投喂?jié)舛纫约霸囼?yàn)貝類的品種密切相關(guān)。

貽貝PST 含量在累積8 d 達(dá)到最大值, 貽貝全貝PST 含量為1 836.7 μg/kg, 1 只貽貝肉重的平均值為8.94 g, 因此累積8 d 后平均每只貽貝毒素累積量為16.42 μg。鏈狀裸甲藻PST 含量為7.41 pg/cell, 累積8 d 每只貽貝攝食的毒素總量為29.58 μg, 因此貽貝對(duì)PST 的整體吸收效率為55.5%。根據(jù)試驗(yàn)水體中PST 含量計(jì)算得出, 累積8 d 平均每只貽貝通過(guò)糞便排出的PST 總量為2.50 μg (含少量藻細(xì)胞毒素), 因此每只貽貝累積和排出的毒素總量為18.92 μg, 與攝入毒素總量存在差異, 毒素總量約減少了36%。導(dǎo)致這種差異的原因應(yīng)該主要是由于毒素在貽貝體內(nèi)的代謝消除造成的, 產(chǎn)毒藻進(jìn)入貽貝體內(nèi)后發(fā)生了毒素轉(zhuǎn)化, 一些高毒性的PST 組分轉(zhuǎn)化為低毒性的組分, 導(dǎo)致毒素總量下降。

累積和排出前8 d 貽貝內(nèi)臟團(tuán)平均毒素累積速率和排出速率分別為448.8 和207.4 μg/(kg·d), 累積速率為排出速率的2.2 倍, 排出28 d 貽貝各組織仍檢出PST, 說(shuō)明貽貝對(duì)PST 具有累積快排出慢的特點(diǎn), 與其他貝類的相關(guān)研究結(jié)果一致(朱明遠(yuǎn)等, 2003; 田華等, 2010; 邴曉菲等, 2017)。貝類的毒素排出過(guò)程分為兩個(gè)階段: 前期的快速階段和后期的慢速階段?？焖匐A段是通過(guò)內(nèi)臟排出未吸收的毒素, 慢速階段中則大多排出內(nèi)臟和其他組織中吸收的毒素(Lassuset al,1989; Silvertet al, 1995; Briceljet al, 1998)。PST 毒素排出速率先快后慢的特點(diǎn)也可能與貝類在毒素水平較高時(shí), 其自凈排出率也會(huì)保持在較高水平有關(guān)(陳光, 2008)。本試驗(yàn)的排毒過(guò)程很明顯分為兩個(gè)階段,前8 d 排毒速率較快, 貽貝內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌和其他組織的排出速率＞6%/d, 后20 d 排毒速率較慢, 排出速率在3%/d 左右, 這與雙階段排毒理論相符。根據(jù)Bricelj 等(1998)對(duì)雙殼貝類毒素排出速率的劃分, 快/中速排毒者毒素排出率一般為(6%～17%)/d, 慢速排毒者排出率則通常為(0.3%～4%)/d, 多數(shù)貽貝和牡蠣與部分扇貝和蛤?qū)儆谇罢? 而大多數(shù)蛤與扇貝屬于后者。本項(xiàng)目組2017 年6 月對(duì)鏈狀裸甲藻赤潮海域貝類的跟蹤監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示, 翡翠貽貝PST 含量可高達(dá)74 472 MU/100g(小鼠生物法), 超標(biāo)185 倍(限量值為400 MU/100g), 赤潮消亡后7 d 內(nèi), PST 毒素的排出速率約為10%/d, 表明翡翠貽貝屬于快/中速排毒者。本試驗(yàn)鏈狀裸甲藻藻株的毒性水平不高, 投喂量不大, 累積試驗(yàn)結(jié)束時(shí)貽貝體內(nèi)PST 含量遠(yuǎn)未達(dá)到累積飽和點(diǎn), 排放初始貽貝PST 含量較低, 因此排出速率也相對(duì)較低。貽貝體內(nèi)PST 含量在下降到較低水平后并未全部排出, 而是維持了相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間,原因可能為低濃度的PST 基本不影響貽貝的正常生理狀態(tài), 因此貽貝對(duì)其的排出速率也大大下降。

3.2 翡翠貽貝不同組織對(duì)PST 的累積和排出差異

短期累積和長(zhǎng)期累積試驗(yàn)結(jié)果表明, 貽貝內(nèi)臟團(tuán)對(duì)PST 的累積能力顯著高于閉殼肌和其他組織(外套膜、鰓和足等), PST 主要累積在內(nèi)臟團(tuán)中, 內(nèi)臟團(tuán)PST 含量可占貽貝PST 總含量的90%左右, 閉殼肌和其他組織的PST 含量則無(wú)顯著差異。已有研究結(jié)果表明, 櫛孔扇貝、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)不同組織對(duì)PST 累積能力由大到小順序?yàn)閮?nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌, 以內(nèi)臟團(tuán)累積能力最強(qiáng)(朱明遠(yuǎn)等,2003; 汪娜等, 2013; 邴曉菲等, 2017), 紫貽貝不同組織對(duì)PST 的累積能力為內(nèi)臟遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肌肉(顏天等,2001), 與本研究結(jié)果基本一致。排出試驗(yàn)結(jié)果表明,內(nèi)臟團(tuán)的毒素排出速率顯著高于閉殼肌和其他組織,內(nèi)臟團(tuán)PST 毒素排出速率較高, 可能是由于貝類毒素累積主要在內(nèi)臟進(jìn)行, 其自凈排除率也會(huì)保持在較高水平。

3.3 PST 在累積和排出過(guò)程中的轉(zhuǎn)化

雙殼貝類中, PST 代謝過(guò)程中的轉(zhuǎn)化作用包括差向異構(gòu)體間轉(zhuǎn)化以及不同毒素種類間轉(zhuǎn)化。一般來(lái)說(shuō),生物體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)間的轉(zhuǎn)化是等分子數(shù)轉(zhuǎn)化。Oshima(1995)提出, 雙殼貝類中C11 位有羥基硫酸基團(tuán)的PST 可以通過(guò)熱力學(xué)平衡發(fā)生差向異構(gòu)化, 因此, 毒藻中穩(wěn)定的β 型(GTX3/4 和C2)毒素在雙殼貝類中逐漸轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的α 型(GTX2/1 和C1), 直至兩者比例達(dá)到1 ∶3 (Mizutaet al, 1999; Choiet al,2006)。邴曉菲等(2017)依據(jù)PST 在櫛孔扇貝體內(nèi)的代謝分析得出, 其發(fā)生的主要轉(zhuǎn)化反應(yīng)包括羥基化和去磺酸化, 可能的轉(zhuǎn)化趨勢(shì)為 C1→GTX2, C1→dcGTX2, C2→GTX3。本試驗(yàn)鏈狀裸甲藻中C2(39.4%)物質(zhì)的量百分比最高, 其次為 neoSTX (26.9%),dcSTX(2.9%)、dcGTX2(0.1%)和C1(2.8%)占比較低。而短期累積和長(zhǎng)期累積過(guò)程中貽貝dcSTX 和dcGTX2占比最高, 其中5.0×105cells/L 試驗(yàn)組累積12 h 后,貽貝內(nèi)臟團(tuán)中dcSTX 和dcGTX2 占比分別為30.3%和 22.8%, 產(chǎn)毒藻中占比最高的 C2 組分未檢出,neoSTX 和C1 占比分別為6.1%和17.5%。累積10 d貽貝內(nèi)臟團(tuán)中dcSTX 和dcGTX2 占比分別為45.6%和14.0%, C2、neoSTX 和C1 占比分別為2.4%、1.9%和9.5%。dcSTX、dcGTX2 和C1 在內(nèi)臟團(tuán)中占比顯著高于其在產(chǎn)毒藻中占比, C2 和neoSTX 占比則顯著下降。排出期間貽貝主要PST 組分與累積期間相似,排出28 d 內(nèi)臟團(tuán)中dcSTX 和dcGTX2 占比分別為51.1%和12.9%, C2 未檢出, neoSTX 和C1 占比分別為4.8%和5.9%, dcSTX 占比繼續(xù)顯著升高。累積期間貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 組分與產(chǎn)毒藻相比少了GTX3, 多了GTX2, 貽貝與攝入的產(chǎn)毒藻之間PST 組分的差異,以及累積和排出過(guò)程中貽貝毒素組成和占比的差異,說(shuō)明毒素進(jìn)入貽貝體內(nèi)后發(fā)生了代謝轉(zhuǎn)化(Blancoet al, 2003; Yuet al, 2007)。推測(cè)貽貝中C11 位有羥基硫酸基團(tuán)的PST 發(fā)生差向異構(gòu)化, 從β 型轉(zhuǎn)化成α 型毒素, 即GTX3→GTX2, C2→C1; 部分C1 毒素可能通過(guò)去磺酸化轉(zhuǎn)化成dcGTX2, 即: C2→C1→dcGTX2。此外, dcSTX 占比在累積和排放過(guò)程中的顯著升高,以及neoSTX 和STX 占比的顯著下降, 表明貽貝可能在氨甲酰水解酶的作用下將藻細(xì)胞中高毒的STX 轉(zhuǎn)化為較低毒的dcSTX(包振民等, 2021), 同時(shí)說(shuō)明貽貝對(duì)dcSTX 有較強(qiáng)的累積能力且排出能力較弱。而neoSTX 是否轉(zhuǎn)化為dcneoSTX 或M 類毒素還有待進(jìn)一步研究。

累積和排出過(guò)程試驗(yàn)水體與貽貝、試驗(yàn)水體與產(chǎn)毒藻之間PST 各組分占比均差異顯著。導(dǎo)致試驗(yàn)過(guò)程中水體組分差異的主要原因是貽貝糞便組分的變化。累積10 d 水體中主要PST 組分為C2(22.9%)、GTX5(21.5%)、C1(20.1%)和dcGTX2(13.9%), 排出階段水體中STX 和dcGTX2 占比持續(xù)升高, C1 則持續(xù)下降, GTX5 也顯著下降, 排出28 d 水體中主要PST組分為STX(28.7%)、dcGTX2(27.7%)、C2(18.1%)和GTX5(12.5%)。推測(cè)貽貝代謝過(guò)程中, 消化道中C1通過(guò)去磺酸化轉(zhuǎn)化成dcGTX2, 而GTX5 則可能水解轉(zhuǎn)化為STX, 再通過(guò)糞便排放到水體中。已有研究表明, 雙殼貝類中普遍存在N-磺胺甲?；愊虬被姿狨ヮ惗舅氐霓D(zhuǎn)化, 如無(wú)齒蚌(Anodonta cygnea)攝入柔細(xì)束絲藻(Aphanizomenon issatschenkoi)、蝦夷扇貝攝入太平洋亞歷山大藻(Alexandrium pacificum)后,GTX5 轉(zhuǎn)化成為高毒性的STX(Pereiraet al, 2004; Liuet al, 2020b; 包振民等, 2021)。無(wú)論在累積還是排出階段, dcSTX 在水體中占比均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其在內(nèi)臟團(tuán)中占比, 而STX 在水體中占比則顯著高于內(nèi)臟團(tuán), 水體中dcSTX 和STX 占比均與其在產(chǎn)毒藻中占比較接近。本試驗(yàn)內(nèi)臟團(tuán)主要包含了消化道(食道、胃、腸道等)、肝胰腺、腎等, 試驗(yàn)水體PST 則主要來(lái)自貽貝腸道中糞便和少量產(chǎn)毒藻, 二者毒素組分占比差異表明dcSTX 在腸道中占比較低, 可能主要存在于肝胰腺和腎中。已有研究表明, 肝胰腺和腎是PST 累積的主要部位, 也是毒素代謝和轉(zhuǎn)化最活躍的組織(Lassuset al, 1996; Luet al, 2002)。

4 結(jié)論

翡翠貽貝具有較強(qiáng)的毒素累積能力, 內(nèi)臟團(tuán)是PST 累積的主要部位, PST 含量與鏈狀裸甲藻的密度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)鏈狀裸甲藻密度為 1.0×106cells/L 時(shí), 貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量累積2 h 已接近食用貝類毒素安全標(biāo)準(zhǔn), 累積8 h 超標(biāo)。當(dāng)產(chǎn)毒藻密度為5.0×105cells/L 時(shí), 貽貝內(nèi)臟團(tuán)PST 含量累積2 d 超標(biāo),累積8 d 達(dá)到峰值(3 590.4±545.7) μg/kg。當(dāng)自然海域發(fā)生赤潮時(shí), 產(chǎn)毒藻會(huì)持續(xù)維持在高密度水平, 因此貽貝體內(nèi)PST 含量超標(biāo)的累積用時(shí)會(huì)短于試驗(yàn)用時(shí)。

貽貝對(duì)PST 具有累積快排出慢的特點(diǎn), 內(nèi)臟團(tuán)PST含量在排出16 d 達(dá)標(biāo), 排出速率先快后慢。內(nèi)臟團(tuán)對(duì)PST 的累積和排出速率顯著高于閉殼肌和其他組織,閉殼肌和其他組織則無(wú)顯著差異。PST 進(jìn)入貽貝體內(nèi)后發(fā)生了代謝轉(zhuǎn)化, 貽貝可能將產(chǎn)毒藻中GTX3 轉(zhuǎn)化為GTX2, C2 轉(zhuǎn)化為C1, 部分C1 轉(zhuǎn)化為dcGTX2, 并將高毒的STX 轉(zhuǎn)化為較低毒的dcSTX。貽貝對(duì)dcSTX有較強(qiáng)的累積能力且排出能力較弱, 肝胰腺和腎可能是PST 累積的主要部位。目前, 雙殼貝類體內(nèi)PST組分間的轉(zhuǎn)化機(jī)制許多尚未明確, PST 各組分間復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過(guò)程, 以及累積、轉(zhuǎn)化、排出過(guò)程中的重要分子途徑以及關(guān)鍵基因功能尚有待進(jìn)一步研究和揭示。

致謝 福建省水產(chǎn)研究所的陳小紅、楊芳、錢(qián)卓真、羅冬蓮、陳財(cái)珍、王雪玲等參與了本試驗(yàn), 謹(jǐn)致謝忱。