分裂內(nèi)含肽： 一種高效的無痕多肽片段連接工具

韓東陽， 任宇祥， 楊子毅， 黃 赫， 鄭基深

（1. 清華大學化學系， 北京100084； 2. 中國科學技術(shù)大學生命科學與醫(yī)學部， 合肥 230027）

翻譯后修飾極大地豐富了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的多樣性［1］. 這些修飾蛋白在藥物開發(fā)［2］、 蛋白質(zhì)組學［3］以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系解析［4～8］等方面具有重要的應用. 目前， 翻譯后修飾蛋白可以通過天然提取和生物表達等方法獲取. 但這些方法仍存在一系列問題， 例如， 天然提取難以獲得均一修飾的蛋白樣品， 而生物表達獲取含多種翻譯后修飾的蛋白樣品依然存在困難等. 蛋白質(zhì)化學合成技術(shù)是獲得翻譯后修飾蛋白的一種新興技術(shù)， 該技術(shù)基于固相多肽合成技術(shù)和多肽片段連接技術(shù). 固相多肽合成技術(shù)［9］可以直接將各種非天然氨基酸及帶有修飾基團的氨基酸方便地引入多肽鏈中特定的位點. 盡管固相多肽合成技術(shù)的合成能力上限一直在不斷提高［10］， 但大部分蛋白仍然難以通過固相合成一次性獲取. 因此， 使用多肽片段連接技術(shù)能夠?qū)⒑囟ㄐ揎椀亩嚯钠芜M行連接， 極大地擴展了蛋白樣品的獲取范圍（圖1）. 通過多肽片段連接， 研究者們已經(jīng)合成了帶有熒光標記［11］， C13和N15等同位素標記［12］， 磷酸化、 甲基化及泛素化等翻譯后修飾［13］， 以及含非天然氨基酸［14］等功能的蛋白質(zhì).

Fig.1 Ligation of protein fragments

目前， 應用最廣泛的化學連接技術(shù)是自然化學連接（NCL）. 該技術(shù)由芝加哥大學的Kent 等［15］于1994年提出， 通過一個多肽片段的C-端硫酯與另一個N-端Cys多肽片段的選擇性化學反應， 在連接位點處形成天然酰胺鍵. 早期， C-端硫酯的合成受到穩(wěn)定性差的困擾； 近年來通過酰肼氧化的C-端硫酯原位合成及連接策略極大地促進了這一方法的應用［16～20］. 然而， 由于NCL反應依靠隨機碰撞， 其連接效率受底物濃度的制約， NCL通常需要mmol/L級別的底物濃度. 當?shù)孜餄舛鹊陀? mmol/L時連接效率低， 使得NCL在脂蛋白、 膜蛋白等難溶蛋白片段連接時產(chǎn)生困難. 為增加NCL在低濃度條件下的反應效率， 研究者們提出了多種解決方案， 主要有： 向反應體系加入有機溶劑或者去垢劑以增加片段溶解度［21］； 在主鏈上引入可移除的增溶修飾以打破氫鍵網(wǎng)絡(luò)、 削弱聚集傾向［22，23］； 通過DNA-DNA、 蛋白-蛋白/小分子等強相互作用模板輔助片段連接， 使片段連接在近似分子內(nèi)反應的條件下進行［24］等. 此外，使用活性更高的硒酯代替硫酯作為酰基供體的方案也能使得反應在更低濃度下進行［25］. 雖然這些策略有助于合成具有挑戰(zhàn)性的目標， 但也存在增加安裝和移除標簽或模板的額外操作、 標簽最佳安裝位置難以預測及硒酯的穩(wěn)定性較低等固有問題， 導致這些方法在穩(wěn)健性和操作便捷性方面存在不足.

另一方面， 化學酶法因其能夠在低濃度下高效反應， 在蛋白質(zhì)合成中也被廣泛應用［26～28］. 但這類連接反應通常需要在底物中引入酶特異性識別序列， 這些識別序列在反應后往往會保留在產(chǎn)物蛋白的序列中， 留下序列“疤痕”， 如Sortase A酶的殘留序列LPXTG［29］. 雖然可以通過選擇目標蛋白質(zhì)固有存在的酶的識別序列作為連接位點， 但這些情況是極其偶然的；通過高通量篩選技術(shù)對Sortase A進行序列進化［30～33］， 以及使用預先制備成硫酯的蛋白片段作為連接底物［34］等策略可以減少Sortase A酶的序列依賴性， 并減少反應的可逆性［35］， 但要實現(xiàn)完全無痕的片段連接仍然困難.

因此， 尋找一種能夠高效連接蛋白片段且連接后無痕的蛋白連接工具， 成為研究者關(guān)注的方向.NCL反應和Sortase A 酶連接過程中都經(jīng)歷了硫酯和?；鵖-N遷移過程； 在生命進化過程中， 泛素化酶級聯(lián)反應等過程中也觀察到硫酯中間體和?；鵖-N遷移過程［36］， 由此可見這是生成新的肽鍵的一種有效途徑. 事實上， 人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一類能夠通過硫酯中間體和酰基遷移路徑實現(xiàn)對蛋白質(zhì)片段的高效無痕連接的蛋白： 內(nèi)含肽（Intein）. 內(nèi)含肽可以分為順式內(nèi)含肽（Cis-intein）與分裂內(nèi)含肽（Split intein）兩大類. 其中， 分裂內(nèi)含肽可以與需要進行連接的蛋白片段分別相連， 已經(jīng)在大量蛋白質(zhì)連接與合成中展現(xiàn)出應用價值， 受到了研究者的廣泛關(guān)注. 本文主要介紹分裂內(nèi)含肽作為一種蛋白質(zhì)合成工具，結(jié)合分裂內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)合成修飾領(lǐng)域的應用案例， 分析了分裂內(nèi)含肽相比其它方法的優(yōu)勢， 總結(jié)分裂內(nèi)含肽的發(fā)展現(xiàn)狀， 并展望了其未來的發(fā)展前景.

1 分裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)

1.1 內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)

1990 年， Stevens 等發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）TFP1 基因的翻譯產(chǎn)物會在翻譯后被切割成2個蛋白， 中央的序列剪切產(chǎn)生分子量為50000的蛋白， 兩端的片段拼接形成分子量為69000的蛋白. 此后研究者在更多物種中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［37，38］. 后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)， 這種插入宿主蛋白序列的蛋白可以催化自身從宿主蛋白中斷裂， 同時使兩側(cè)的宿主蛋白片段通過肽鍵連接起來形成成熟蛋白［39］. 這種具有剪接兩側(cè)蛋白片段能力的蛋白被命名為內(nèi)含肽（Intein）， 而兩端被剪接的蛋白片段被命名為外顯肽（Extein）（圖2）.

Fig.2 Sequence characteristics of Inteins

1.2 分裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)

分裂內(nèi)含肽是分裂為2個獨立存在的前體片段的內(nèi)含肽， 每個片段分別與1個外顯肽融合（圖3）.2個前體片段非共價結(jié)合并組裝成典型的內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)， 從而恢復分裂內(nèi)含肽的剪接活性， 催化兩側(cè)的外顯肽發(fā)生蛋白質(zhì)反式剪接（PTS）. 其可以來源于天然連續(xù)內(nèi)含肽的人工分裂， 也在自然進化中存在.

Fig.3 Principle of protein trans-splicing by split intein

1969年， Anfinsen 等［40］發(fā)現(xiàn)在特定的條件下， 分裂成2個片段的酶能夠非共價結(jié)合并恢復完整酶的催化功能. 1998年， Perler 等［41］將這一思想運用到內(nèi)含肽的設(shè)計改造中. 他們將PspPol-1內(nèi)含肽中的一個肽鍵切斷， 將其分裂為N-端片段（IntN）和C-端片段（IntC）， 將2個片段分別表達純化后在體外共復性， 結(jié)果表明2個片段通過非共價作用形成復合物并恢復剪接活性.

同年， Paulus 等［42］將MtuRecA 內(nèi)含肽分裂為N-端和C-端2 個片段， 并各自融合到相應的外顯肽上， 分別表達純化后共復性， 2個片段結(jié)合形成了具有剪接功能的復合物. 探究了剪接反應過程對氧化還原環(huán)境和pH值的依賴性， 并指出這種剪接系統(tǒng)是一種有潛力的蛋白質(zhì)連接工具. 此后， 研究者對天然連續(xù)內(nèi)含肽進行了大量的人工斷裂嘗試， 發(fā)展出多種人工分裂內(nèi)含肽（表1）.

Table 1 Previously reported artificial split intein

1998年， Liu等［49］在SspDnaE（藍藻的DNA聚合酶Ⅲ的催化亞基A）蛋白中鑒定出首個天然的分裂內(nèi)含肽. DnaE 的N-端和C-端部分由2 個單獨的基因DnaE-N 和DnaE-C 分別編碼. 在大腸桿菌中測試時， 2個分裂內(nèi)含肽片段通過非共價作用結(jié)合形成內(nèi)含肽復合物. 該復合物不僅具有類似內(nèi)含肽的序列特征， 而且表現(xiàn)出蛋白質(zhì)反式剪接活性， 剪接后得到完整的DNA聚合酶Ⅲ亞基A. 這一發(fā)現(xiàn)表明， 分裂內(nèi)含肽是天然存在的. 與人工分裂內(nèi)含肽相比， 天然分裂內(nèi)含肽具有可在非變性條件下組裝及剪接效率更高等優(yōu)勢.

2009年， Mootz等［50］發(fā)現(xiàn)了另一種新的天然分裂內(nèi)含肽NpuDnaE.NpuDnaE具有極高的剪接反應活性， 在37 ℃下反式剪接反應的半衰期（即反應物的濃度消耗一半時所需的時間t1/2， s）僅為63 s， 剪接反應速率常數(shù)k（s-1）＞3.5×10-3s-1. 此后， 研究者們通過基因數(shù)據(jù)比對和實驗驗證等手段， 發(fā)現(xiàn)了更多來自不同物種的天然分裂內(nèi)含肽（表2）， 進一步擴大了分裂內(nèi)含肽作為蛋白質(zhì)連接工具的可行性與應用前景.

Table 2 General naturally split intein from different species

1.3 分裂內(nèi)含肽的分類

分裂內(nèi)含肽可以根據(jù)其寄主基因歸類為具有遺傳同源關(guān)系的家族類. 此外， 不同的分裂內(nèi)含肽在反應過程中中間體存在差異， 也可以據(jù)此對分裂內(nèi)含肽進行類別劃分. 在結(jié)構(gòu)上， 內(nèi)含肽一般呈現(xiàn)多個β片層的結(jié)構(gòu)， 分裂的位點一般在β片層之間的Loop區(qū)， 從不同區(qū)域斷裂的內(nèi)含肽具有不同的特性，能夠豐富分裂內(nèi)含肽的應用場景， 因此研究者也根據(jù)分裂內(nèi)含肽的分裂位點對其進行歸納.

約70%的內(nèi)含肽的宿主蛋白與DNA復制和DNA修復有關(guān)［60］， 并且在進化發(fā)展過程中表現(xiàn)出基因水平遷移的特征［61］. 因此分裂內(nèi)含肽可以按照其來源的宿主基因進行分類， 來源于同類基因的分裂內(nèi)含肽的序列同源性較高， 并且具有類似的特征. 來源于不同物種的Dna E分裂內(nèi)含肽都能在相同的外顯肽序列進行切割， 并且研究也發(fā)現(xiàn)其間存在交叉反應性， 如NpuDnaE 的IntN片段和SspDnaE 的IntC片段也可以非共價結(jié)合并形成具有剪接反應活性的復合體［62］. 研究者對于源于DnaE， GyrB和DnaB等家族的分裂內(nèi)含肽已經(jīng)進行了系統(tǒng)的研究， 并且開發(fā)了多種應用.

分裂內(nèi)含肽催化的剪接反應過程涉及多步關(guān)鍵的酰基轉(zhuǎn)移反應， 關(guān)鍵氨基酸殘基在這些?；D(zhuǎn)移過程中形成硫酯或者氧酯中間體， 對反應性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響. 一般而言， 硫酯中間體穩(wěn)定性較差， 在體外應用中經(jīng)常觀察到中間體硫酯鍵水解導致的副產(chǎn)物， 而采用氧酯中間體的分裂內(nèi)含肽則反應速率較慢. 因此研究者根據(jù)分裂內(nèi)含肽1位和C端外顯肽+1位的氨基酸， 將其分為CC和CS（T）兩類. CC類分裂內(nèi)含肽（如SspDnaE 及SceVMA 等）1位和C端外顯肽+1位的氨基酸均為半胱氨酸， 反應經(jīng)歷2個硫酯中間體過程. CS（T）類分裂內(nèi)含肽（如SspDnaB， gp41等）1位為半胱氨酸， C端外顯肽+1位為絲氨酸或蘇氨酸， 反應中經(jīng)歷1個硫酯中間體和1個氧酯中間體過程. 除此兩大類外， 還有少數(shù)分裂內(nèi)含肽在反應中經(jīng)歷2個氧酯中間體過程， 如NeqDNA polymerase分裂內(nèi)含肽［55］.

分裂內(nèi)含肽一般分為2個片段， 2個片段非共價結(jié)合后在結(jié)構(gòu)和功能上接近于連續(xù)的內(nèi)含肽. 無論是人工分裂的內(nèi)含肽還是天然來源的分裂內(nèi)含肽， 其分裂位點均位于結(jié)構(gòu)上的環(huán)區(qū)（Loop）， 從而避免影響結(jié)合和剪接反應活性. 根據(jù)分裂位點不同， 內(nèi)含肽可以被分為S0， S1和S11內(nèi)含肽［63］. S0內(nèi)含肽從原始內(nèi)含肽中歸巢核酸內(nèi)切區(qū)域位點切割， 如SspDnaE和NpuDnaE等. S1內(nèi)含肽從接近N端的位置切割， 如SspDnaB和M86 DnaB等. S11內(nèi)含肽從接近C端的位置切割， 如SspGyrB S11和SspDnaB S11等. 此外， Liu等［63］將DnaB從S1和S0位點分為3段， 依然保留結(jié)合及剪接功能.

2 分裂內(nèi)含肽的反應原理

2.1 分裂內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)

分裂內(nèi)含肽可以看作是完整內(nèi)含肽的分裂形式， 其復合物的結(jié)構(gòu)與完整內(nèi)含肽相似［64］， 是偽C2對稱性的馬蹄形蛋白， 主要由β折疊組成. 兩組反平行的β折疊成馬蹄的平面， 平面上下各有一組2個β折疊和一條α螺旋形成的結(jié)構(gòu)域（ββαmotif）， 其中一側(cè)的β折疊延伸并垂直穿過馬蹄中央的loop， 與N端外顯肽相連. 馬蹄中央另一對垂直于平面的β折疊與C端外顯肽相連. 兩段外顯肽位于平面的同一側(cè)［圖4（A）和（C）］［65］.

分裂內(nèi)含肽有多種可能的分裂方式， 多數(shù)分裂內(nèi)含肽分裂成一大一小2個片段， 分裂位點可能在靠近C端的一側(cè)， 也可能在靠近N端的一側(cè). 其中， 靠近C端的分裂被稱為經(jīng)典（Typical）分裂， 其小片段一般包括中央垂直的一組β折疊和繞平面β折疊的一部分. 靠近N端的分裂被稱為非經(jīng)典（Atypical）分裂， 其小片段一般包括中央垂直的loop和平面一側(cè)ββαmotif的一部分. 此外， Liu等［63］通過人工篩選SspDnaB可能的分裂位點， 實現(xiàn)了3段分裂內(nèi)含肽的剪切反應. 已經(jīng)在NpuDnaE上實現(xiàn)類似的3片段分裂內(nèi)含肽剪切反應， 說明通過改造得到多于2片段的分裂內(nèi)含肽是可能的［圖4（B）和（C）］.

Fig.4 General structure and different split sites of split intein complex

分裂內(nèi)含肽需要各組分結(jié)合后才能折疊成正確的構(gòu)象. 2013 年， Muir 等［66］通過核磁共振波譜（NMR）觀測了溶液中NpuDnaE分裂內(nèi)含肽結(jié)合前后的構(gòu)象， 發(fā)現(xiàn)分裂內(nèi)含肽片段結(jié)合前， 小片段處于無序狀態(tài)， 大片段處于構(gòu)象動態(tài)變化的狀態(tài). 兩片段的相互作用誘導小片段從無序結(jié)構(gòu)折疊為穩(wěn)定構(gòu)象， 并誘導大片段形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu). 類似的NMR信號特征也在SspDnaE和Cat兩種分裂內(nèi)含肽上被驗證［67，68］. 2018 年， Ribó 等［64］解析了NeqB-type DNA polymerase1（NeqPol1） N 端大片段和兩片段復合物的晶體結(jié)構(gòu)， 發(fā)現(xiàn)IntC單獨存在的結(jié)構(gòu)與形成復合物后的結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別. 這些結(jié)果說明分裂內(nèi)含肽各組分無法獨立穩(wěn)定折疊成正確的構(gòu)象.

2.2 分裂內(nèi)含肽的結(jié)合模式

靜電相互作用被認為是分裂內(nèi)含肽兩片段識別和結(jié)合的重要動力. 2007年， Muir等［69］通過序列比對發(fā)現(xiàn)不同物種DnaE 分裂內(nèi)含肽顯示出保守的電荷分離特征： C 端小片段含有堿性殘基集中片段，N 端大片段含有酸性殘基集中片段. 2 個電性相反的片段介導的靜電相互作用模式在SspDnaE 及NeqPol1的晶體結(jié)構(gòu)中都得到了驗證［52，64］.

非經(jīng)典分裂內(nèi)含肽兩片段的結(jié)合面與經(jīng)典分裂內(nèi)含肽不同. 2018年， Muir等［67］通過NMR 解析了一種非經(jīng)典分裂內(nèi)含肽Cat的結(jié)構(gòu)， 發(fā)現(xiàn)2個內(nèi)含肽片段的相互作用界面主要是疏水殘基， 多數(shù)帶電殘基暴露在溶劑中. 生化實驗結(jié)果也表明， Cat兩個片段的結(jié)合強度受溶液離子強度的影響很小， 表明疏水相互作用在一些非經(jīng)典分裂內(nèi)含肽的結(jié)合中起更主要的作用（圖5）.

Fig.5 Combination of split intein

2.3 分裂內(nèi)含肽的剪切機理

分裂內(nèi)含肽的剪接是自發(fā)過程， 不需要其它的活化能來源. 整個反應包括N-S?；w移、 硫酯交換、 天冬酰胺環(huán)化及S-N?；w移等4個過程（圖6）.

第一步， 內(nèi)含肽N-端的Cys側(cè)鏈巰基進攻主鏈酰胺鍵， 發(fā)生N-S?；w移， 使N-端外顯肽通過硫酯鍵連接在內(nèi)含肽上. 在此過程中， 分裂內(nèi)含肽中至少有3個氨基酸起到催化作用， 包括與巰基相互作用的F-Block Asp以及與酰胺鍵相互作用的B-Block His和B-Block Thr. F-Block Asp起到堿催化作用， 促進Cys 側(cè)鏈巰基的去質(zhì)子化， 增強了巰基親核性， 點突變實驗表明該氨基酸對N-S ?；w移是必要的［70］. 上述機理與NMR觀測到的巰基pKa變化以及理論計算的結(jié)果相吻合［71，72］. 質(zhì)子化的B-Block His起到酸催化作用， 在質(zhì)子化后成為氫鍵供體， 與酰胺鍵羰基氧相互作用， 增強了羰基的親電性. 這一相互作用得到了理論計算的支持［72］， 并進一步在SspDnaB M86 內(nèi)含肽的晶體結(jié)構(gòu)中得到了確認［73］.B-Block Thr起到堿催化作用， 與酰胺鍵的氨基氫相互作用， 使酰胺鍵偏離理想鍵參數(shù)， 通過提升底物能量降低了活化能. 這一機理得到了SspDnaE內(nèi)含肽晶體結(jié)構(gòu)的支持［74］， 點突變實驗表明該氨基酸對N-S?；w移是必要的［圖7（A）］［75］.

第二步， C-端外顯肽的Cys側(cè)鏈巰基進攻N-端外顯肽與N-端內(nèi)含肽之間的硫酯鍵， 通過硫酯交換使兩段外顯肽通過硫酯鍵相連， 從線性硫酯中間體轉(zhuǎn)化為支鏈硫酯中間體. QM/MM 計算結(jié)果表明，F(xiàn)-Block Asp在此過程中同樣起到堿催化的作用， 促進了C-端外顯肽的Cys的去質(zhì)子化. 點突變實驗表明， 將這個Asp突變?yōu)镚lu， Asn， Ala或Gly都會顯著抑制支鏈中間體的形成［圖7（B）］［76］.

第三步， C-端內(nèi)含肽的C-端Asn側(cè)鏈酰胺進攻C-端內(nèi)含肽與C-端外顯肽之間連接的酰胺鍵， 形成二酰亞胺五元環(huán)， 內(nèi)含肽與外顯肽脫離. F-Block 和G-Block 中的2 個His 起到了催化作用. 其中，F(xiàn)-Block His促進了C-端Asn側(cè)鏈酰胺的去質(zhì)子化， 起到堿催化作用. 質(zhì)子化后的G-Block His與酰胺鍵羰基氧相互作用， 起到了增強羰基親電性的酸催化作用. 上述相互作用在SspDnaB的晶體結(jié)構(gòu)中得到了觀測［77］， 也得到了計算結(jié)果的支持［78］. 此外， Muir等［79］發(fā)現(xiàn)對于NpuDnaE內(nèi)含肽， 在無法形成支鏈中間體的C1A突變體中， Asn環(huán)化速率會降低至突變前的1/200， 說明支鏈中間體的形成促進了Asn的環(huán)化［圖7（C）］.

最后， 在內(nèi)含肽從體系中脫離后， 兩段外顯肽間的硫酯鍵通過S-N?；w移形成天然肽鍵， 進而得到剪切產(chǎn)物. 該過程不需要其它輔助， 在中性條件下能夠自發(fā)進行［80］.

在一些分裂內(nèi)含肽中， 上述機理中的Cys 被Ser 和Thr 替代， 反應過程中形成相應的氧酯中間體（表1和表2）. 此外， 部分內(nèi)含肽第一步剪切的親核氨基酸位于內(nèi)含肽內(nèi)部而不是N端， Mootz 等［58］報道了第一個遵循這種機理的天然分裂內(nèi)含肽NrdHF， NrdHF參與第一步N-S酰基遷移的Cys位于IntC序列的中間部位.

除了內(nèi)含肽序列內(nèi)部氨基酸的催化作用， 分裂內(nèi)含肽還表現(xiàn)出對外顯肽序列的敏感性： 靠近剪接位點的外顯氨基酸突變對反應效率和產(chǎn)率有明顯影響， 暗示外顯序列可能與關(guān)鍵氨基酸存在相互作用. Muir等［81］將Npu*內(nèi)含肽（SspDnaE-N和NpuDnaE-C的組合）C-端外顯肽從天然的CFN改為SGV， 發(fā)現(xiàn)C端剪接效率明顯下降. 通過定向進化， 得到了可以更有效剪接SGV作為C-端外顯肽的mNpu*， 其中包括F-Block D124Y 突變. 晶體結(jié)構(gòu)研究顯示， C 端外顯肽CFN 中的Phe 與促進Asn 環(huán)化的F-Block His125存在π-π堆疊作用， 使His125處于有利于催化的取向， 而D124Y突變使Tyr代替了Phe的作用，從而減輕了分裂內(nèi)含肽對C-端外顯肽的敏感性. Mootz 等［82］發(fā)現(xiàn)將SspDnaB N-端外顯肽的Gly改變?yōu)長-Ala會導致剪接效率明顯下降， 而改變?yōu)镈-Ala的效率下降幅度較小. 通過觀察晶體結(jié)構(gòu)， 認為N-外顯肽的氨基酸側(cè)鏈可能與B-Block His側(cè)鏈產(chǎn)生位阻沖突， 干擾His的催化功能， 而其它朝向的側(cè)鏈（如D-Ala）產(chǎn)生的位阻沖突較小. 這些實驗結(jié)果說明外顯肽與內(nèi)含肽之間存在互作， 可能是外顯序列敏感性的重要原因.

3 分裂內(nèi)含肽的工程化改造與性能優(yōu)化

分裂內(nèi)含肽已經(jīng)成為一種廣泛應用的蛋白質(zhì)連接工具， 但在其應用過程中依然存在一些挑戰(zhàn)， 因此研究者希望能獲得具有更優(yōu)性能的內(nèi)含肽， 包括剪切活性和穩(wěn)定性高、 對外顯肽剪接位點附近氨基酸序列的耐受性強， 不同分裂內(nèi)含肽間的反應正交， 分裂內(nèi)含肽序列短， C-端或N-端長度在固相合成范圍內(nèi)等. 為獲得具有上述特性的分裂內(nèi)含肽， 研究者們進行了廣泛的探究與嘗試.

3.1 分裂內(nèi)含肽的剪切活性和穩(wěn)定性

2016年， Muir等［83］使用理性設(shè)計方法獲得了具有強穩(wěn)定性和高剪切活性的分裂內(nèi)含肽. 通過分析DnaE家族的Npu（快）和Ssp（慢）分裂內(nèi)含肽之間剪接效率的差異發(fā)現(xiàn)， 大多數(shù)關(guān)鍵殘基在空間結(jié)構(gòu)上與活性位點直接鄰近. 以這些關(guān)鍵氨基酸殘基作為對齊位點， 對73 個DnaE 家族的內(nèi)含肽進行比對，最終得到了一個新型分裂內(nèi)含肽Cfa. Cfa顯示出快速的蛋白質(zhì)剪接活性以及高的熱穩(wěn)定性和變性穩(wěn)定性. 在30 ℃下， Cfa 的剪切速率比此前報道的DnaE 家族中最快的NpuDnaE 快2.5 倍， 其t1/2僅為20 s.同時， Cfa 對變性條件具有很強的耐受性， 在3～4 mol/L Gn·HCl 或8 mol/L 尿素等強變性體系中都保持良好的剪接活性， 剪接反應平衡常數(shù)K＞1×10-2s-1.

3.2 分裂內(nèi)含肽對剪接位點的兼容性

2011年， Liu等［84］通過定向進化技術(shù)， 得到了具有高外顯肽剪接位點兼容性的內(nèi)含肽. 將SspDnaB內(nèi)含肽基因插入到卡那霉素抗性蛋白質(zhì)（KanR）的基因中， 使得含內(nèi)含肽的KanR蛋白前體沒有卡那霉素抗性， 只有發(fā)生了蛋白剪接反應得到完整KanR 蛋白， 卡那霉素抗性恢復的菌株才能在含卡那霉素的培養(yǎng)基中存活. 對存活菌株的質(zhì)粒進行測序， 即可獲得能夠在該插入位點發(fā)生剪接反應的內(nèi)含肽基因序列（圖8）. 經(jīng)過多個篩選循環(huán)， 進化得到了多個新型內(nèi)含肽， 能夠在多個不同的外顯肽剪接位點和不同的蛋白質(zhì)中都顯示出高剪接活性. 其中， M86突變體內(nèi)含肽具有最好的剪接反應性能. 將M86通過人工分裂為N端由11個氨基酸組成的分裂內(nèi)含肽. 與突變前的分裂DnaB內(nèi)含肽相比， M86催化蛋白質(zhì)反式剪接反應的速率增加了60倍， 反應常數(shù)kM86=2.5×10-3s-1， 并且分裂內(nèi)含肽片段的Kd值提高了一個數(shù)量級.

Fig.8 Sequence evolution process

2017年， Muir等［85］報道了外顯肽序列耐受性明顯提高的自然分裂內(nèi)含肽. His125是蛋白質(zhì)剪接最后一步中Asn137 環(huán)化的關(guān)鍵催化殘基， 通過設(shè)計His125 所在的環(huán)（殘基122～124）， 可以有效地改變His125構(gòu)象動力學， 從而顯著增加剪切反應對+2與+3位置的外顯肽序列耐受性， 并提高了剪切速率.基于對蛋白質(zhì)剪接關(guān)鍵的催化位點的理解， Muir等對分裂內(nèi)含肽His125所在的環(huán)進行了飽和突變， 然后使用基于細胞的選擇系統(tǒng)來鑒定能夠在不同外顯肽剪接位點下催化有效剪接的突變體， 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌落在殘基122～124處含有GXP 基序（GRP， GEP 或GPP， 代替天然ERD 序）， 其中GEP 序列具有最高的剪接活性（圖9）.

Fig.9 Compatibility of extein+2 position

研究表明，NpuDnaE 內(nèi)含肽的外顯肽序列偏好主要局限于C 端外顯肽+1 位的催化半胱氨酸和+2位的大位阻疏水殘基， 將天然+2位Phe外顯肽序列殘基突變?yōu)轶w積較小的殘基（例如Ala）會導致剪接率顯著降低［79］. Muir等［85］以GFP蛋白作為模型， 表征了對于不同外顯肽位點的剪接活性. 經(jīng)過GEP序列改造的NpuDnaE內(nèi)含肽與未改造的NpuDnaE內(nèi)含肽相比， 對不同的+2和+3位外顯肽序列的剪接產(chǎn)率均有顯著提高（圖10）.

Fig.10 Compatibility of extein+2 position

3.3 分裂內(nèi)含肽的反應正交性

分裂內(nèi)含肽的N端和C端片段之間具有強烈的電荷-電荷相互作用. 2019年， Iwa?等［86］基于對分裂內(nèi)含肽2個片段結(jié)合過程“捕獲和折疊機制”中的靜電相互作用， 將2個分裂內(nèi)含肽片段結(jié)合關(guān)鍵位置的氨基酸電荷網(wǎng)絡(luò)進行改造， 實現(xiàn)了2種DnaB家族分裂內(nèi)含肽結(jié)合的正交性. 這一策略也適用于從其它順式剪接內(nèi)含肽中產(chǎn)生新的分裂內(nèi)含肽.

2020年， Wang等［87］篩選檢測了天然存在的分裂內(nèi)含肽的剪接反應， 建立了包含15種分裂內(nèi)含肽的正交分裂內(nèi)含肽庫. 研究結(jié)果表明， 正交分裂內(nèi)含肽可以與多個分裂轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合， 以在活生物體中實現(xiàn)復雜的邏輯表達過程， 還可以用于多片段蛋白的體外連接. 作者以SasG 蛋白重復片段進行展示， 使用正交分裂內(nèi)含肽組合， 一鍋完成了6個片段的拼接（圖11）， 證明了正交分裂內(nèi)含肽擴展庫的多功能性和巨大潛力.

Fig.11 The application of the orthogonal split intein in the multi-segment one-pot ligation[87]

盡管分裂內(nèi)含肽介導的PTS在蛋白質(zhì)半合成上取得了一定的成功， 但也存在一些局限， 如修飾基團的選擇性引入位點通常只能位于目標蛋白的N端或C端. 隨著越來越多的分裂內(nèi)含肽被鑒定或設(shè)計出來， 分裂內(nèi)含肽工具箱逐漸豐富， 在同一目標蛋白的半合成中同時利用2種相互正交的分裂內(nèi)含肽進行多次PTS的策略成為可能.

Muir等［88］首次開發(fā)了通過2種正交分裂內(nèi)含肽實現(xiàn)一鍋三片段反式剪接的策略， 該方法被稱為串聯(lián)蛋白反式剪接（tPTS）. 目標蛋白分為3個片段， 即POIN和POIC以及一個通過表達或化學合成獲取的帶有所需修飾基團的較短中心多肽片段X（圖12）. 所使用的2 個正交分裂內(nèi)含肽（A 和B）與POIN和POIC融合表達（POIN+IntN-A及IntC-B+POIC）， 而X與A和B的另外2個片段融合（IntC-A+X+IntN-B）. 這種新穎的系統(tǒng)可以實現(xiàn)3個多肽片段的一鍋化組裝， 合成了304個殘基大小的c-CrkII蛋白， 其由一個SH2結(jié)構(gòu)域和2個SH3結(jié)構(gòu)域組成， 每個結(jié)構(gòu)域分別與相應分裂內(nèi)含肽構(gòu)成tPTS的前體片段. 反應在22 ℃下進行了48 h， 以約48%的收率完成了三片段剪接. 該方法為較大的多結(jié)構(gòu)域蛋白的半合成及蛋白序列中央特定位點引入化學修飾提供了一種方便的方法.

Fig.12 The tPTS strategy implements three-segment splicing

3.4 分裂內(nèi)含肽的使用便捷性

天然斷裂的gp41-1內(nèi)含肽是目前報道的最小的分裂內(nèi)含肽之一， 具有非常高的反式剪接活性［56］，gp41-1內(nèi)含肽由88個殘基的IntN和37個殘基的IntC組成. 為了使內(nèi)含肽對外顯肽性質(zhì)的干擾更小， 人們通常希望使內(nèi)含肽盡可能小. Iwa?等［86］嘗試從gp41-1內(nèi)含肽的自然分裂位點處截短2個殘基， 從而獲得更小的分裂內(nèi)含肽. 然而， 這種缺失使內(nèi)含肽的蛋白質(zhì)剪接效率降低了約40%， 作者后續(xù)試圖優(yōu)化內(nèi)含肽的氨基酸序列以恢復截短的gp41-1 內(nèi)含肽的剪接活性到原有水平， 但沒有成功. 這表明gp41-1內(nèi)含肽的大小可能已達到實現(xiàn)功能的最小值.

Neq，Npu和SspDnaE等大部分天然分裂內(nèi)含肽都在常規(guī)的內(nèi)含肽分裂位點S0處斷裂， 該位點也充當歸巢核酸內(nèi)切酶插入的標準位置. 該位點靠近內(nèi)含肽C 端， 斷裂產(chǎn)生約100 個氨基酸殘基的IntN和35個氨基酸殘基的IntC. IntC較短， 便于與C端外顯肽片段共同固相合成， 因此這樣的分裂內(nèi)含肽為蛋白質(zhì)C端半合成以及標記提供了方便. 然而， 由于蛋白質(zhì)固相合成能力的限制， 通過固相合成與N-內(nèi)含肽相連的蛋白是相對困難的， 這也限制了分裂內(nèi)含肽在N端半合成蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)N端修飾等場景的應用. 因此， 研究者們希望尋找或開發(fā)具有更短N端片段的分裂內(nèi)含肽.

2004年， Liu等［63］將SspDnaB迷你內(nèi)含肽從非常規(guī)的分裂位點切割， 報道了3個新的分裂位點S1，S8和S11， 從這3種位點切斷， 都產(chǎn)生了能夠進行蛋白質(zhì)反式剪接的兩段式分裂內(nèi)含肽（圖13）. 其中S1分裂內(nèi)含肽的N端僅有11個氨基酸. 由于不同的內(nèi)含肽具有相似的結(jié)構(gòu)， 這些新的分裂位點可以推廣到其它內(nèi)含肽. Liu等［63］還首次證明了分裂為3段的分裂的內(nèi)含肽依然可以組成復合物并恢復蛋白質(zhì)剪接活性.

Fig.13 Potential divisible sites in the intein sequence

2014年， Mootz等［59］從宏基因組數(shù)據(jù)中鑒定并表征了新的分裂內(nèi)含肽AceL-TerL. 這是首次發(fā)現(xiàn)存在天然非典型分裂的內(nèi)含肽. 只有25個氨基酸的N端片段是迄今為止最短的天然IntN片段， 易于通過固相合成獲取. 在8 ℃的低溫下， 該內(nèi)含肽具有最高達90%的蛋白質(zhì)反式剪接效率. 作者通過定向蛋白質(zhì)進化選擇了進一步改進的突變體. 工程化的內(nèi)含肽突變體在37 ℃下具有更高的剪接效率， 反應速率常數(shù)k＞1.8×10-3s-1， 并在化學標記多種蛋白質(zhì)應用中展現(xiàn)出天然序列最高50倍的效率.

4 分裂內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)離體與在體合成中的應用

4.1 離體蛋白質(zhì)半合成

分裂內(nèi)含肽介導的PTS 為蛋白質(zhì)半合成提供了一種新途徑. 不同于NCL［15］和表達蛋白連接（EPL）［89～92］等標準蛋白質(zhì)化學連接反應需要較高濃度（因其依賴于多肽片段的隨機碰撞）， PTS能夠在μmol/L濃度條件下反應， 顯示出較低濃度依賴性（因其由2個片段之間緊密的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用促成）［69］， 這使得分裂內(nèi)含肽成為蛋白質(zhì)半合成的有吸引力的工具.

通過PTS完成半合成的目標蛋白（POI）將被拆分為N端（POIN）與C端（POIC）2個前體片段， 其作為外顯肽分別與相應的分裂內(nèi)含肽片段相連接， 由此組成的融合體片段分別都可以在PTS反應之前單獨制備并將所需的修飾引入相應的片段中. 由于許多經(jīng)過優(yōu)化的分裂內(nèi)含肽片段較小， 故含有較小分裂內(nèi)含肽片段的目標蛋白前體片段（POIN-IntN或 IntC-POIC）可通過固相多肽合成獲得， 從而可以容易地將修飾基團選擇性引入目標蛋白的N-端或C-端.

Mootz 等［11］將SspDnaB 分裂內(nèi)含肽用于蛋白質(zhì)半合成以實現(xiàn)N端修飾. 該IntN片段僅含11個氨基酸， 便于通過固相多肽合成同時制備IntN與含修飾基團的目標蛋白片段［圖14（A）］. 為證明PTS在N-端修飾蛋白質(zhì)半合成中的效果， 對2種蛋白質(zhì)底物進行了N-端熒光素標記. 合成肽5-Fl-SEFSG-IntN與融合表達的蛋白片段IntC-Trx-His6以等摩爾濃度（62 μmol/L）在25 ℃下反應22 h， 經(jīng)純化后的半合成產(chǎn)物Fl-Trx-His6總收率約為30%. 第二個例子是分子量30700的β-內(nèi)酰胺酶（βLac）. 融合表達蛋白片段IntCβLac-His6與5-Fl-SEFSG-IntN在25 ℃， 12 μmol/L 濃度下共孵育42 h， 以約30%的收率得到剪接產(chǎn)物 FlβLac-His6.

Fig.14 N-terminal(A) or C-terminal(B) modification of proteins via the split intein peptide-mediated PTS

Liu 等［93］報道了一種新型工程化S11SspGyrB 分裂內(nèi)含肽. 其分裂位點在C-端附近， 產(chǎn)生長度約150個氨基酸殘基的IntN片段和長度僅為6個氨基酸殘基的IntC片段， 可用于將合成肽連接到表達蛋白的C端［圖14（B）］［94］. 這些新穎的包含非常短的N端或C端片段的分裂內(nèi)含肽顯著擴展了其在蛋白質(zhì)半合成中的應用， 使得將修飾基團添加到目標蛋白的N端或C端更加方便.

利用分裂內(nèi)含肽還可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的位點選擇性修飾. 為了克服對含有多個半胱氨酸的目標蛋白難以實現(xiàn)選擇性修飾的限制， 即在其中一個特定半胱氨酸位點的側(cè)鏈巰基引入修飾而不影響其余半胱氨酸殘基， Mootz等［13］將半胱氨酸修飾與PTS結(jié)合使用. 具體來說， 人工分裂的SspDnaB和MxeGyrA的IntC片段的外顯肽+1位點分別由絲氨酸或蘇氨酸而非半胱氨酸來介導PTS. 將這些分裂內(nèi)含肽片段與具有單個半胱氨酸的短肽序列（稱為CysTag）融合表達， 在該片段中引入熒光團、 生物素及聚乙二醇（PEG）等修飾后， 經(jīng)PTS獲得全長的目標蛋白. 該方法實現(xiàn)了在含有多個半胱氨酸的目標蛋白， 如硫氧還蛋白［13］、β-內(nèi)酰胺酶［13］、 人生長激素和非核糖體肽合成酶TycA［95］等蛋白質(zhì)中的單一半胱氨酸位點的選擇性修飾.

近期， Pless等［96］將該策略應用于體內(nèi)蛋白質(zhì)修飾， 允許將多種修飾（包括磷酸化、 乙?；M物和非天然氨基酸等）同時引入活的真核細胞中. 通過體內(nèi)tPTS策略， 在NaV1.5離子通道的胞內(nèi)域和P2X2受體的胞外域中引入了修飾， 研究了翻譯后修飾在離子通道功能以及受體與配體結(jié)合中的作用. 正交分裂內(nèi)含肽介導的串聯(lián)蛋白反式剪接在體外和體內(nèi)的蛋白多片段剪接都展現(xiàn)了良好的效果， 有望在蛋白質(zhì)半合成中得到更多的應用.

4.2 片段同位素標記

在目標蛋白質(zhì)中引入具有NMR 效應的15N 及13C 等重原子核的同位素標記可看作是上述通過PTS將化學修飾引入蛋白質(zhì)的一個具體例子， 這一技術(shù)最重要的應用是用于核磁共振波譜研究來表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學. 然而對于較大蛋白質(zhì)來說， 全長同位素標記的樣品中顯著的峰重疊使得核磁共振譜的解析變得困難.

使用分裂內(nèi)含肽介導的PTS可以將具有重同位素標記的蛋白質(zhì)片段與無標記的片段連接起來， 生成部分片段標記的全長蛋白質(zhì)樣品， 顯著簡化核磁共振波譜. Nakamura 等［46］于1998年使用了來自古菌Pyrococcus furiosus的內(nèi)含肽（PI-PfuI）， 并將其人為分為2個片段， 分別與作為核磁共振表征的靶蛋白RNA聚合酶α亞基的C端結(jié)構(gòu)域（αC）的2個片段融合（圖15）. 經(jīng)同位素標記的片段與另一未標記片段在體外混合并發(fā)生反式剪接反應， 首次獲得了用于核磁共振表征的部分片段同位素標記的蛋白質(zhì)樣品.

Fig.15 Split intein-mediated protein fragment isotope labeling

盡管最初標記的目標蛋白質(zhì)僅有約9000 Da， 但該系統(tǒng)后來成功地用于制備分段同位素標記的麥芽糖結(jié)合蛋白（42000 Da）［97］及F0F1ATP 酶β亞基（52000 Da）［98］， 證明了通過分裂內(nèi)含肽實現(xiàn)的分段同位素標記可用于更大目標蛋白質(zhì)的NMR結(jié)構(gòu)分析.

Iwa?等［12］開發(fā)了一種通過三片段蛋白質(zhì)剪接來實現(xiàn)片段同位素標記的新策略. 利用具有相同序列但分裂位點不同的NpuDnaE工程化分裂內(nèi)含肽， 對來自Lyngbya majuscula的Curacin A（CurA）蛋白通過三片段蛋白剪接來實現(xiàn)部分片段同位素標記. 該蛋白包含3個順序的?；d體蛋白（ACP）結(jié)構(gòu)域. 這3個結(jié)構(gòu)域之間高度的序列同一性（93%～100%）導致其所有3個結(jié)構(gòu)域均被同位素標記的樣品的NMR信號嚴重重疊. 因此， 選擇性地對該三結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的中心結(jié)構(gòu)域進行了同位素標記， 通過分裂內(nèi)含肽介導的PTS， 以約40%的收率獲取了用于NMR 分析的部分片段同位素標記的全長CurA 蛋白. 該方法將部分片段同位素標記策略在核磁共振研究中的應用拓展到了多結(jié)構(gòu)域蛋白中的結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用研究.

Iwa?等［99］還開發(fā)了將同位素標記的片段與未標記的片段在同一細菌培養(yǎng)物中一次生成， 隨后直接發(fā)生剪接反應來體內(nèi)獲取分段同位素標記的全長蛋白的策略. 其基本原理是在單個細胞培養(yǎng)過程中的不同時間表達含分裂內(nèi)含肽的蛋白片段前體， 并在各個表達步驟之間更換未標記或同位素標記條件的培養(yǎng)基. 這樣， 只有一種前體蛋白片段是被同位素標記的， 剪接反應后得到的即是只有一個片段被同位素標記的目標蛋白， 實現(xiàn)了分段同位素標記蛋白質(zhì)的直接體內(nèi)獲?。?8］.

4.3 多肽和蛋白質(zhì)的環(huán)化

基于細胞的環(huán)肽篩選方法相對于噬菌體展示等體外篩選方法， 可以更為穩(wěn)健地得到具有體內(nèi)活性的環(huán)肽， 并兼具較低的細胞毒性、 較好的溶解度等性質(zhì). 分裂內(nèi)含肽介導的PTS因其片段可以直接通過表達獲取并且可以將兩側(cè)的多肽片段連接起來的特性， 可被用來在細胞內(nèi)生成環(huán)肽. 即通過2個分裂內(nèi)含肽片段的結(jié)合， 迫使其兩側(cè)連接的線性多肽的N 端和C 端通過肽鍵頭-尾連接， 完成環(huán)化（圖16）.

Fig.16 Split intein-mediated peptide cyclization

為此， Benkovic等［2］開發(fā)了分裂內(nèi)含肽介導的多肽和蛋白質(zhì)環(huán)狀連接（SICLOPPS）技術(shù). 這項技術(shù)可以實現(xiàn)體內(nèi)的環(huán)肽文庫構(gòu)建， 并結(jié)合功能篩選， 得到了許多具有生物活性的環(huán)肽， 如酪氨酸酶抑制劑pseudostellarin F［2］及甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等［100］.

為了增加生成環(huán)肽的功能基團多樣性， Schultz 等［101］通過與遺傳密碼擴展技術(shù)將非天然氨基酸插入到系統(tǒng)生成的環(huán)肽中， 豐富了可生成環(huán)肽文庫的多樣性， 且篩選出了HIV 蛋白酶環(huán)肽抑制劑.Lindquist 等［102］構(gòu)建了第一個酵母兼容的環(huán)肽文庫， 并篩選出了可在酵母及動物模型中特異性降低α-synuclein毒性的環(huán)肽分子.

為了開發(fā)可以調(diào)控蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的環(huán)肽分子， Benkovic等［103］整合了SICLOPPS與反向雙雜交系統(tǒng)（RTHS）2種技術(shù). 在宿主細胞中經(jīng)SICLOPPS 技術(shù)產(chǎn)生的環(huán)肽文庫通過RTHS 系統(tǒng)直接進行篩選， 鑒定出了調(diào)節(jié)FKBP12-雷帕霉素-FRAP相互作用和HIV-1蛋白酶和核糖核苷酸還原酶相互作用的環(huán)肽分子， 展示了SICLOPPS技術(shù)構(gòu)建環(huán)肽文庫并用于獲取可調(diào)控蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的環(huán)肽的潛力.

另外， 研究者們還開發(fā)了將分裂內(nèi)含肽與連續(xù)內(nèi)含肽聯(lián)用來構(gòu)建環(huán)肽的方法［104］， 以及通過PTS形成肽鍵完成肽環(huán)化后， 再利用半胱氨酸殘基形成大環(huán)肽內(nèi)部的二硫鍵來構(gòu)建雙環(huán)肽產(chǎn)物的策略［105］， 這體現(xiàn)了分裂內(nèi)含肽相關(guān)方法用于構(gòu)建環(huán)肽類分子的良好效果及廣泛應用.

基于分裂內(nèi)含肽的多肽環(huán)化還可與其他新興篩選技術(shù)結(jié)合， Park 等［106］開發(fā)了一種稱為CWCPS（Custom-designed warhead-armed cyclic peptide screening）的策略， 將可與靶蛋白活性位點結(jié)合的彈頭化學基團引入由分裂內(nèi)含肽介導的PTS生成的環(huán)肽抑制劑， 再通過酵母雙雜交進行細胞內(nèi)篩選. 構(gòu)象穩(wěn)定的環(huán)肽中的彈頭化學基團與活性位點結(jié)合后的的解離更慢， 親和力顯著增強. 通過該方法發(fā)現(xiàn)了一種針對癌癥靶點HDAC8 有效的抑制劑CY5-6Q， 其表現(xiàn)出很強的結(jié)合親和力（KD=15.1 nmol/L）和抑制作用（IC50=0.61 μmol/L）. 這表明基于分裂內(nèi)含肽的方法是細胞內(nèi)構(gòu)建環(huán)肽的一個相對穩(wěn)健的策略， 在有前途的環(huán)肽藥物前體的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮作用.

4.4 條件性蛋白剪接

條件性蛋白剪接（CPS）即通過一個外源調(diào)節(jié)器來激活或抑制蛋白剪接. 基于分裂內(nèi)含肽的CPS系統(tǒng)的基本原理是將人工設(shè)計的不能自發(fā)結(jié)合的分裂內(nèi)含肽融合到目標蛋白的2個片段中， 通過引入特定外源分子或光照等方式重建其剪接活性；或是在活性位點殘基處或附近進行化學修飾， 隨后通過光誘導、 酶切等方式去除修飾， 從而使其恢復剪接活性. 因此， 可以通過控制內(nèi)含肽的活性， 來得到一種隨意“激活”任何蛋白質(zhì)的方法， 甚至在體內(nèi)也可以適用.

人工分裂的SceVMA 內(nèi)含肽在IntN和 IntC片段之間僅表現(xiàn)出非常低的親和力， 在蛋白質(zhì)剪接中幾乎無活性. Muir等［107］將雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域FKBP12和FRB融合到2個分裂內(nèi)含肽片段后， 加入雷帕霉素， 可誘導2個片段相互靠近并結(jié)合， 進而導致分裂內(nèi)含肽片段相互靠近并折疊成具有PTS活性的復合物［圖17（A）］. 通過實現(xiàn)模型蛋白MBP和His-tag的CPS， 首次完成了蛋白質(zhì)反式剪接反應的小分子激活調(diào)控. Mootz等［108］利用類似的思路， 將分裂內(nèi)含肽片段分別與FKBP12的F36M突變體融合， 該突變體無需外加小分子即可發(fā)生同源二聚化， 進而介導分裂內(nèi)含肽發(fā)生PTS. 而此時再加入雷帕霉素等小分子， 會通過與該結(jié)構(gòu)域結(jié)合而阻斷其二聚化， 進而實現(xiàn)PTS反應的條件性抑制， 提供了一種潛在的較為通用的手段用于翻譯后的蛋白質(zhì)功能調(diào)控. 除小分子響應的CPS系統(tǒng)外， Muir等［109］還開發(fā)了光響應性CPS體系， 將源于擬南芥的會在光照下發(fā)生二聚的光敏色素B（PhyB）與光敏色素相互作用因子3（PIF3）與SceVMA分裂內(nèi)含肽兩端片段分別融合［圖17（B）］. 類似于FKBP12與FRB對雷帕霉素的響應， PhyB與PIF3在光照下發(fā)生二聚， 使得VMA分裂內(nèi)含肽也相互靠近并恢復剪接活性. 利用這一體系， 以MBP-Flag tag作為模型剪接產(chǎn)物在酵母中實現(xiàn)了光響應性CPS. 此外， Silver等［110］還將人工設(shè)計的互相之間具有較強親和力的卷曲螺旋（Coiled coil， CC）引入VMA分裂內(nèi)含肽， 實現(xiàn)了熒光素酶的CPS.

Fig.17 Small molecule induced CPS system(A) and light induced CPS system(B)

上述CPS 系統(tǒng)都是通過將具有在一定條件下具有較高結(jié)合力的外加結(jié)構(gòu)域與本身結(jié)合力較低的VMA分裂內(nèi)含肽融合實現(xiàn)的. 而Muir等［111］報道了通過引入其它基團， 抑制本身就具有較高結(jié)合力的分裂內(nèi)含肽的活性， 再在一定條件下移除抑制基團完成脫籠， 從而實現(xiàn)CPS的新策略（圖18）. 合成了在PTS 的關(guān)鍵絲氨酸殘基上通過β-羥基形成的酯鍵而非常規(guī)的通過α-氨基的酰胺鍵連接后續(xù)片段的SspDnaE內(nèi)含肽片段類似物， 且其α-氨基基團被外加的保護基團修飾. 這阻斷了該片段的O-N?；D(zhuǎn)移過程， 使得剪接反應無法發(fā)生. 保護基團可以通過紫外線照射或蛋白酶剪切去除， 從而恢復該片段的剪接反應活性. 通過制備抗菌肽magainin 的類似物展示了該CPS系統(tǒng)的潛在應用. Mootz等［112］將迄今已知剪接反應速率最快的gp41-1 分裂內(nèi)含肽N 端片段中保守的苯丙氨酸通過遺傳密碼擴展技術(shù)突變?yōu)榭晒饣罨泥徬趸S基酪氨酸［O-（2-Nitrobenzyl）-Ltyrosine， ONBY］. 在365 nm 的紫外線照射下， 鄰硝基芐基保護基被脫除， 剪接反應以與野生型gp41-1分裂內(nèi)含肽幾乎相同的速率發(fā)生. 越來越多的CPS策略的出現(xiàn)， 使得該方法有望成為可以在時空層面上調(diào)控體內(nèi)蛋白質(zhì)功能的手段.

Fig.18 Reactivation of CPS system

5 總結(jié)與展望

經(jīng)過研究者的持續(xù)探索， 分裂內(nèi)含肽介導的蛋白質(zhì)反式剪接已經(jīng)由一種有趣的蛋白質(zhì)翻譯后現(xiàn)象發(fā)展成為一種應用廣泛的高效連接方法. 對蛋白質(zhì)反式剪接的化學過程的解析， 使人們更好地理解分裂內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系. 快速反式剪接分裂內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)、 內(nèi)含肽的序列進化、 內(nèi)含肽無痕剪接策略的開發(fā)、 正交內(nèi)含肽庫的建立等， 都大大改進了基于內(nèi)含肽的連接技術(shù)， 使其成為日漸成熟的蛋白質(zhì)連接工具， 分裂內(nèi)含肽介導的蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)的應用已經(jīng)蓬勃發(fā)展. 分裂內(nèi)含肽系統(tǒng)促進了結(jié)構(gòu)生物學的發(fā)展， 特別是核磁共振波譜結(jié)構(gòu)解析中的應用； 分裂內(nèi)含肽系統(tǒng)也促進了合成或半合成更大、 更復雜、 帶有多種修飾的蛋白質(zhì)； 此外， 基于分裂內(nèi)含肽技術(shù)的環(huán)狀肽庫也已成為藥物發(fā)現(xiàn)的有效策略.

然而， 人們也必須認識到目前對分裂內(nèi)含肽的理解和研究尚不完善. 雖然對于分裂內(nèi)含肽結(jié)合以及后續(xù)反應過程已經(jīng)進行了研究， 但是對于反應過程中更細致的結(jié)構(gòu)變構(gòu)與催化功能變化的分析還比較粗糙. 更好地理解硫酯交換過程中2 個巰基如何靠近， 支鏈硫酯如何對天冬酰胺環(huán)化過程產(chǎn)生促進， 都有助于更好地協(xié)調(diào)剪接反應的各個步驟的動力學， 從而提高整體的連接效率， 避免C-端或N-端水解副產(chǎn)物的出現(xiàn). 此外， 目前對分裂內(nèi)含肽在強變性、 高溫、 氧化性等條件下的穩(wěn)健性研究尚不充足， 可能在與其它化學反應聯(lián)用時帶來不確定性.

隨著更多的微生物基因組被測序， 分裂內(nèi)含肽的數(shù)量將迅速增長， 未來有望發(fā)現(xiàn)具有獨特性質(zhì)（例如能夠耐受高溫、 高鹽等極端條件）的新型分裂內(nèi)含肽， 豐富人類對分裂內(nèi)含肽的認識， 揭示現(xiàn)今尚未認識到的潛力， 為分裂內(nèi)含肽技術(shù)的發(fā)展帶來新的機遇， 并最終獲得通用型內(nèi)含肽， 能夠?qū)θ魏瓮怙@肽序列均具有剪快速接動力學， 產(chǎn)率高， 分裂片段易于通過化學合成技術(shù)獲取， 且連接活性易于通過外源刺激控制等.