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    PLGA-姜黃素納米顆粒的制備及體外抗炎性能評(píng)價(jià)

    2023-10-17 23:51:30賀超良田華雨
    關(guān)鍵詞:藥率黃嘌呤姜黃

    李 真, 郝 凱, 賀超良, 田華雨,4

    (1. 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所生態(tài)環(huán)境高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130022;2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)與工程學(xué)院, 合肥 230026;3. 廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 固體表面物理化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廈門 361005;4. 福建省能源材料科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室(IKKEM), 廈門 361005)

    姜黃素(Cur)是一種在姜科植物中含量較高的多酚類物質(zhì), 是姜黃的主要成分[1]. 姜黃素的來源廣泛, 不良反應(yīng)小, 價(jià)格低廉[2], 且經(jīng)研究證實(shí)其具有多種藥理作用, 包括對(duì)腫瘤的抑制作用、 抗氧化作用、 抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用[3]. 姜黃素可通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路抑制氧化反應(yīng),阻礙炎癥細(xì)胞因子、 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的分泌, 從而發(fā)揮抗炎作用[4,5]. 但因其親脂性強(qiáng)[6]、 水溶性和穩(wěn)定性差, 難以被細(xì)胞攝取和吸收, 不利于藥物發(fā)揮作用, 從而極大地限制了其生物利用[7]. 目前, 一些以脂質(zhì)體、 微球和聚合物膠束為載體的新型姜黃素制劑已被開發(fā), 用于提高其分散性和穩(wěn)定性[8]. 聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種生物相容性良好的材料, 已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床治療[9]. PLGA具有良好的藥物包封效果和優(yōu)良的成膜性能, 在藥物遞送領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用. 研究結(jié)果表明, PLGA可將藥物分子封裝在其形成的納米顆粒中, 在保留藥物活性的同時(shí)能夠起到藥物緩釋的效果[10~13].

    本文通過雙乳液法制備了一種具有較高Cur載藥率的PLGA@Cur納米顆粒(PLGA@Cur NPs), 顯著改善了Cur在水中的分散性和水溶性, 并對(duì)其抗氧化性和抗炎性進(jìn)行了詳細(xì)的表征. 結(jié)果表明, 在細(xì)胞水平上, PLGA@Cur NPs可有效清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS), 降低促炎細(xì)胞因子含量, 緩解細(xì)胞水平的炎癥. 該納米藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)為Cur用于炎癥疾病的治療奠定了基礎(chǔ), 為提高姜黃素的生物利用度提供了新的思路.

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    PLGA(貨號(hào)P133293)、 姜黃素(貨號(hào)C400222)、 聚乙烯醇(PVA, 貨號(hào)P139537)、 黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤、 二氫乙錠和2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH), 分析純, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 二氯甲烷、 無水乙醇和過氧化氫, 分析純, 上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司; 無水硫酸銅, 分析純, 北京伊諾凱科技有限公司; 甲醇(HPLC級(jí))和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB, 分析純), 北京百靈威科技有限公司; 冰乙酸(HPLC級(jí))和叔丁基過氧化氫溶液(TBHP, 分析純), 上海麥克林生化科技有限公司; RAW 264.7, 美國(guó)ATCC公司; 胎牛血清、 磷酸鹽緩沖液(PBS)和細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM),美國(guó)Gibco 公司; 活性氧測(cè)定試劑盒, 上海碧云天生物技術(shù)有限公司; TNF-αELISA 試劑盒, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司; CCK-8測(cè)定試劑盒, 大連美倫生物技術(shù)有限公司; CpG核酸, 上海生工生物工程有限公司, 其意義鏈序列為TCGTCGTTTCGGCGCGCCGCCCACAUAAAAAACAGUUG.

    UltiMate3000型超高效液相色譜儀(HPLC), 美國(guó)戴安公司; Zeiss GeminiSEM 500型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM), 美國(guó)蔡司公司; H1750R 型高速離心機(jī), 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SB-5200DTDN型超聲波細(xì)胞破碎機(jī), 寧波新芝生物科技股份有限公司; RO15型多點(diǎn)磁力攪拌器, 德國(guó)IKA 公司; LAMBDA 1050+型紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(UV-Vis-NIR), 美國(guó)PerkinElmer 公司;Varioskan LUX 型酶標(biāo)儀, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司; NanoBrook 173Plus 型動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(DLS), 美國(guó)Brookhaven公司.

    1.2 實(shí)驗(yàn)過程

    1.2.1 PLGA@Cur NPs 的制備 采用雙乳液法制備PLGA@Cur NPs. 將50 mg PLGA 和一定質(zhì)量的Cur 溶解在1 mL 二氯甲烷中形成混合溶液, 然后緩慢加入至3 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PVA 水溶液中, 用100 W 超聲波破碎儀超聲1 min, 得到初始乳液. 將該乳液緩慢加入至50 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PVA 水溶液中, 用100 W超聲波破碎儀超聲3 min, 得到復(fù)乳液. 通過在室溫下攪拌12 h除去復(fù)乳液中殘留的二氯甲烷. 然后用離心機(jī)以1200 r/min 的速度離心10 min, 分離得到PLGA@Cur NPs. 用15 mL超純水洗滌PLGA@Cur NPs 3次進(jìn)行純化.

    1.2.2 PLGA@Cur NPs的表征 將PLGA@Cur NPs分散在超純水中, 配制成約500 μg/mL的懸濁液, 采用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(DLS)對(duì)納米顆粒的粒徑、 多分散指數(shù)(PDI)和Zeta電位進(jìn)行測(cè)定[14,15]. 通過掃描電子顯微鏡觀察納米顆粒的形貌.

    1.2.3 PLGA@Cur NPs 包封率和載藥率的測(cè)定 采用雙乳液法制備PLGA@Cur NPs 色譜柱:Agilent Extend-C8 4.6×250 mm, 流動(dòng)相為甲醇-0.5%乙酸水溶液(體積比4∶1), 柱溫35 ℃, 流速1.0 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)425 nm, 進(jìn)樣量10 μL.

    Cur 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制: 將1 mg 姜黃素溶于1 mL 甲醇中, 用流動(dòng)相梯度稀釋為500, 250, 125,62.5, 31.25, 17.82, 3.91和1.95 μg/mL的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液, 進(jìn)行HPLC測(cè)試, 記錄峰面積, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

    精確稱取適量?jī)龈珊蟮腜LGA@Cur NPs, 加入一定量的乙醇, 超聲20 min, 使姜黃素充分提取至乙醇中, 取上清液經(jīng)過濾后用于HPLC檢測(cè). 按下式計(jì)算姜黃素的包封率(DLE, %)和載藥量(DLC, %):

    式中:m(Lg)為實(shí)際裝載姜黃素的質(zhì)量;m(Fg)為理論投入姜黃素的質(zhì)量;mN(g)為載藥納米顆粒的質(zhì)量.

    1.2.4 PLGA@Cur NPs的抗氧化性測(cè)試 通過硫酸銅與H2O2的芬頓(Fenton)反應(yīng)制得·OH. 首先將0.1 mL Cu2(+500 μg/mL)、 0.1 mL H2O(21 mmol/L)、 0.1 mL TMB(10 mmol/L)和0.1 mL 樣品(2 mg/mL)加入到0.6 mL Milli-Q水中, 室溫孵育1 h, 測(cè)定氧化后TMB在混合物中的UV-Vis吸光度值. 通過觀察樣品在650 nm處的峰值的變化考察其對(duì)·OH的清除作用. 黃嘌呤可在黃嘌呤氧化酶的作用下產(chǎn)生. 將0.1 mL 黃嘌呤氧化酶(5 EU/mL)、 0.1 mL 黃嘌呤(6 mmol/L)和0.1 mL PLGA@Cur NPs(2 mg/mL, 樣品組)或0.1 mL Milli-Q 水(空白組)混合在0.6 mL PBS 中, 于37 ℃孵育40 min. 然后加入0.1 mL 二氫乙錠(1 mg/mL), 混合均勻后, 轉(zhuǎn)移至熒光酶標(biāo)板中, 用酶標(biāo)儀測(cè)定二氫乙錠氧化產(chǎn)物乙錠的熒光強(qiáng)度.的相對(duì)含量(Content of O·2-, %)按下式計(jì)算:

    其中:Fs和Fb分別為處理后的樣品組和空白組的熒光強(qiáng)度.

    1.2.5 PLGA@Cur NPs 的細(xì)胞毒性測(cè)試 使用CCK-8 試劑盒評(píng)價(jià)PLGA@Cur 的細(xì)胞毒性. 將RAW 264.7 細(xì)胞在含10%的胎牛血清及100 U/mL 青霉素、 100 U/mL 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設(shè)定為5%(體積分?jǐn)?shù))CO2, 37 ℃. 當(dāng)RAW 264.7 細(xì)胞生長(zhǎng)到一定數(shù)量時(shí), 以1×104cell/孔的密度接種到96 孔板中, 并在37 ℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中黏附12 h[16~18]. 然后用不同濃度的樣品處理這些細(xì)胞. 在培養(yǎng)24 h后, 將培養(yǎng)基替換為含有10% CCK-8的生長(zhǎng)培養(yǎng)基, 培養(yǎng)1 h. 用酶標(biāo)儀測(cè)量孔板中溶液在450 nm處的光強(qiáng)度(OD 450 nm)計(jì)算細(xì)胞活力.

    1.2.6 PLGA@Cur NPs 的血液相容性測(cè)試 取1 mL新鮮小鼠血液, 以1200 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min分離血細(xì)胞. 用PBS洗滌離心沉淀物, 直至上清液澄清透明, 離心沉淀物為血細(xì)胞. 陽性組加入10 μL血細(xì)胞和90 μL 1% TritonX-100, 陰性組加入10 μL血細(xì)胞和90 μL PBS. 在樣品組中, 加入10 μL血細(xì)胞和90 μL PLGA@Cur, 使PLGA@Cur NPs 的終濃度為100 mg/mL. 各組于室溫下孵育2 h, 離心后拍照.取離心后的上清液, 測(cè)定其在450 nm處的吸光度值. 按下式計(jì)算溶血率(Hemolysis, %):

    其中:As,Ap和An分別為樣本組、 陽性組和陰性組的吸光度值.

    1.2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè) 將RAW 264.7 細(xì)胞以8000 cell/孔的密度接種到96 孔板中, 并在37 ℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中黏附12 h. 用10 μL 1 mmol/L的TBHP和10 μL 1.2 mg/mL的PLGA@Cur NPs 處理細(xì)胞24 h, 細(xì)胞用H2DCFDA染色后用PBS反復(fù)沖洗, 用熒光顯微鏡成像.

    1.2.8 細(xì)胞因子檢測(cè) 將RAW 264.7 細(xì)胞以2×104cell/孔的密度接種于96 孔板中. 將10 μL 20 μg/mL 的CpG 和12.5/15/20 μL 2 mg/mL 的PLGA@Cur NPs 加入至96 孔板中. 在37 ℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后, 用TNF-αELISA試劑盒評(píng)估培養(yǎng)基中TNF-α的含量.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 PLGA@Cur NPs的制備

    以PLGA 和Cur 的二氯甲烷溶液為油相, PVA 水溶液為水相, 通過雙乳液溶劑揮發(fā)法制備了PLGA@Cur NPs[19~21](Scheme 1). 通過控制Cur與PLGA的質(zhì)量比分別為1∶25, 1∶10, 1∶5, 3∶10和2∶5,得到PLGA@Cur 1~PLGA@Cur 5, 其中PLGA的質(zhì)量是固定的, 改變Cur的質(zhì)量. 通過SEM觀察了所制備的納米顆粒(圖1), 其形態(tài)呈均一的球形, 表面光滑, 粒徑大小一致. 經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(DLS)測(cè)定了載藥納米顆粒的Zeta電位、 粒徑和PDI, 結(jié)果列于表1. 與PLGA納米顆粒相比, PLGA@Cur NPs負(fù)電性增加; PLGA@Cur NPs保留了PLGA納米顆粒的尺寸, 其水動(dòng)力學(xué)尺寸約為300 nm, 與SEM結(jié)果相符; PLGA@Cur NPs的PDI<0.3, 具有良好的單分散性.

    Scheme 1 Schematic for the preparation of PLGA@Cur NPs

    Fig.1 SEM images of PLGA(A) and PLGA@Cur1—PLGA@Cur-5(B—F) nanoparticles

    Table 1 Characteristics of different nanoparticles

    2.2 包封率和載藥率

    通過HPLC方法[22,23]測(cè)定了所制備的系列載藥納米顆粒的Cur負(fù)載率. 由表2可見, 隨著Cur含量的增加, PLGA@Cur NPs 中Cur 的DLE 增加, DLC 先增加后減少. 當(dāng)Cur 與PLGA 的質(zhì)量比為1∶5 時(shí)(PLGA@Cur 3), 納米顆粒的載藥率高于其它體系. 當(dāng)加入的Cur過多時(shí), 藥物無法被載體包埋, 容易造成藥物的損失, 使載藥率下降. 當(dāng)Cur與PLGA的質(zhì)量比為2∶5時(shí), 在SEM圖像中觀察到有姜黃素顆粒的出現(xiàn), 此時(shí)載體的負(fù)載能力達(dá)到上限, 繼續(xù)增加藥物與載體的投料比也無法得到更高載藥量的納米顆粒. 基于藥物的包封率和載藥率的測(cè)定結(jié)果, 優(yōu)選PLGA@Cur 3(Cur與PLGA的質(zhì)量比為1∶5, 包封率為15.09%, 載藥率為34.85%)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn).

    Table 2 DLE and DLC of PLGA@Cur 1—PLGA@Cur 5 nanoparticles

    2.3 PLGA@Cur NPs的穩(wěn)定性

    納米顆粒的穩(wěn)定性對(duì)于藥物的儲(chǔ)存和運(yùn)輸至關(guān)重要, 通過測(cè)定納米顆粒在PBS中的粒徑變化考察了所制備PLGA@Cur NPs 的穩(wěn)定性. 由圖2 可見, 所制備的PLGA@Cur NPs 呈淡黃色, 均勻分散在水中. 室溫下放置7 d后, PLGA@Cur NPs溶液未發(fā)生明顯變化, 而經(jīng)過超聲分散的Cur在靜置1 h后就出現(xiàn)了聚集, 并且下沉到樣品瓶底部. DLS結(jié)果(圖3)也證實(shí)PLGA@Cur NPs保留了PLGA納米顆粒的穩(wěn)定性, 粒徑在7 d內(nèi)沒有顯著變化.

    Fig.2 Appearance of Cur and PLGA@Cur NPs solutions placed at different time points at room temperature

    Fig.3 Hydrodynamic size of PLGA, Cur and PLGA@Cur NPs to explore the stability

    2.4 PLGA@Cur NPs的抗氧化性

    首先, 利用H2O2和Cu2+之間的芬頓作用產(chǎn)生了·OH[24,25], 當(dāng)·OH 存在時(shí)可氧化·OH 的檢測(cè)探針TMB生成在652 nm處有吸收峰的oxTMB(圖4). 當(dāng)H2O(2H), TMB(T)和Cu2+同時(shí)存在時(shí), 652 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰. 加入PLGA@Cur NPs 后吸收峰消失, 而Cur的存在并未減少溶液中的·OH. 此外,利用黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶的氧化作用產(chǎn)生, 通過測(cè)量檢測(cè)探針二氫乙錠氧化產(chǎn)物氫乙錠的熒光強(qiáng)度[26,27]測(cè)定了PLGA@Cur NPs 對(duì)于O·2-的清除效率(圖5). 將對(duì)照組(加入等體積的PBS)的熒光強(qiáng)度值定義為含量100%. 隨著PLGA@Cur NPs 和Cur 濃度的增加, 溶液中的O·2-含量減少. 當(dāng)PLGA@Cur NPs 濃度為200 μg/mL 時(shí), 可以去除超過70%的, 且其清除效率強(qiáng)于Cur. 我們推測(cè)PLGA@Cur NPs清除·OH和的效率強(qiáng)于Cur的原因在于, PLGA@Cur NPs的分散性較好, 可更充分地發(fā)揮其抗氧化性, 清除溶液中的活性氧.

    Fig.4 ·OH scavenging capability after different treatments

    Fig.5 O·2- scavenging capability after different treatments

    2.5 PLGA@Cur NPs的生物相容性

    為了在細(xì)胞水平驗(yàn)證PLGA@Cur NPs 的性能, 首先通過CCK-8 檢測(cè)了PLGA@Cur NPs 對(duì)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性. 測(cè)試結(jié)果顯示(圖6), 當(dāng)濃度高達(dá)200 μg/mL 時(shí), PLGA, Cur 和PLGA@Cur NPs 均不會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響. 此外, 還測(cè)試了PLGA@Cur NPs 的溶血性能(圖7). 與陽性對(duì)照組相比, PLGA@Cur NPs并未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象, 表明其具有良好的細(xì)胞相容性.

    Fig.7 Hemolysis analysis of red blood cells(RBCs)

    2.6 PLGA@Cur NPs在細(xì)胞水平的抗氧化性能和抗炎性能

    驗(yàn)證了材料的細(xì)胞毒性后, 使用TBHP 預(yù)處理RAW 264.7 細(xì)胞, 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS[28], 然后用PLGA@Cur NPs 處理, 以2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)為探針評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS 水平. 在TBHP的刺激下, 細(xì)胞中觀察到亮綠色的熒光, 表明ROS的產(chǎn)生(圖8). 相反, PLGA@Cur NPs處理導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯下降, 而Cur 處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度下降不明顯. 為驗(yàn)證PLGA@Cur NPs 的抗炎性能, 使用免疫刺激劑CpG刺激RAW 264.7(圖9). PLGA@Cur NPs 保留了Cur的抗炎性能, 使細(xì)胞中的炎癥因子TNF-α恢復(fù)正常. 這些結(jié)果表明, PLGA@Cur NPs可在體外清除細(xì)胞內(nèi)ROS, 緩解細(xì)胞水平的炎癥.

    Fig.8 Intracellular ROS imaging of macrophages after different treatments

    Fig.9 TNF-α cytokine generated by macrophages after different treatments for 24 h

    3 結(jié) 論

    通過雙乳液溶劑揮發(fā)法成功制備了包載Cur的PLGA納米顆粒PLGA@Cur NPs. 經(jīng)測(cè)定, 所生成的PLGA@Cur3水動(dòng)力學(xué)尺寸為340 nm, 包封率為15.09%, 載藥率為34.85%. 該納米顆粒具有良好的分散性和穩(wěn)定性, 在水溶液中可穩(wěn)定存在7 d. 此外, PLGA@Cur NPs還可以有效清除·OH和O·2-兩種活性氧, 且清除效果強(qiáng)于Cur. PLGA@Cur NPs 具有良好的生物相容性, 能有效清除細(xì)胞內(nèi)ROS, 具有良好的抗炎性能, 可緩解細(xì)胞水平的炎癥. 可見, PLGA@Cur NPs 是一種具有優(yōu)異抗氧化性和抗炎性能的藥物遞送系統(tǒng), 其作為一種生物安全性材料有望應(yīng)用于炎癥疾病的治療.

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