油梨突臍蠕孢葉斑病病原菌鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選

王曉宇,徐冬英,王彤彤,盧艷春,譚德錦,楊志強(qiáng),蔣 婷

(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,廣西崇左,532200)

油梨Perseaamericana,即鱷梨,又稱牛油果等,原產(chǎn)于拉丁美洲[1],我國于1918年引進(jìn),現(xiàn)在廣西、廣東、海南等地均有廣泛種植[2]。油梨果實(shí)富含多種蛋白質(zhì)、維生素,因其營養(yǎng)價(jià)值極高,近年來市場需求量逐年增加[3]。隨著油梨種植面積不斷增大,病害對(duì)油梨產(chǎn)業(yè)造成的影響也日益嚴(yán)重。目前,已報(bào)道的油梨病害主要有樟疫霉(Phytophthoracinnamomi)根腐病[4]、擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)梢枯病[5]、小穴殼(Dothiorellasp.)潰瘍病[6]、南方靈芝(Ganodermaaustrale)莖腐病[7]、可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)果腐病[8]、果實(shí)炭疽病(Colletotrichumjiangxiense)[9]、多主棒孢(Corynesporacassiicola)葉斑病[10]等。

2021年,在廣西崇左市油梨種植區(qū)發(fā)現(xiàn)1種葉斑病,對(duì)其進(jìn)行病原菌分離、致病性測定及病原菌鑒定后,確定其病原菌為突臍蠕孢Exserohilumrostratum,此前未見相關(guān)報(bào)道,將該病害命名為油梨突臍蠕孢葉斑病?，F(xiàn)對(duì)該病害進(jìn)行病原菌生物學(xué)特性研究及防治藥劑篩選,為其防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和供試藥劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),北京三藥科技開發(fā)公司制作;麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MA),青島日水生物科技有限公司制作。PSA、Czapek、CMA、OMA、V8培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)配制[11]。

殺菌劑包括250 g/L吡唑醚菌酯乳油,巴斯夫植物保護(hù)(江蘇)有限公司產(chǎn);10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑,先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司產(chǎn);40%百菌清懸浮劑,日本史迪士生物科學(xué)株式會(huì)社產(chǎn);430 g/L戊唑醇懸浮劑,拜耳股份公司產(chǎn); 40%腈菌唑可濕性粉劑,美國陶氏益農(nóng)公司產(chǎn)。

1.2 樣品采集與病原菌分離

2021—2022年在廣西崇左市彬橋及龍北的油梨種植基地,采集發(fā)病葉片帶回試驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離及純化[12-14]。采用組織分離法從病健交界處切取5 mm×5 mm組織塊,用75%酒精消毒10 s,0.1%升汞消毒1 min,無菌水沖洗3次,每次60 s,用滅菌濾紙吸干水分,放入PDA平板中培養(yǎng)。挑取菌落邊緣純化,從多個(gè)生長相同的純化菌株中選擇生長良好的菌株1株,編號(hào)ZSQ001,保存于4 ℃冰箱備用。

1.3 致病性測定

菌絲塊接種法:將分離菌株ZSQ001在PDA上培養(yǎng)5 d后,用直徑8 mm打孔器從菌落邊緣取菌絲塊,分別進(jìn)行嫩葉和老葉致病性測定。使用75%酒精消毒健康無病葉片,設(shè)置有傷和無傷兩個(gè)處理,接種病菌菌絲塊,以接種無菌PDA作為對(duì)照,每處理接種5片葉,重復(fù)2次。孢子懸浮液接種法:將菌株ZSQ001在PDA上培養(yǎng)7 d,用無菌水沖洗孢子,無菌紗布過濾菌絲后制成104個(gè)/mL孢子懸浮液,噴霧法噴霧幼苗孢子懸浮液10 mL接種,以噴霧無菌水作為對(duì)照,每處理接種3株,重復(fù)3次。兩種方法接種后觀察癥狀,分離接種后發(fā)病葉片病原菌,對(duì)比接種菌株,進(jìn)行科赫氏法則驗(yàn)證。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定 參照文獻(xiàn)[15]的方法,觀察菌落形態(tài),從PDA培養(yǎng)基上挑取孢子,在顯微鏡下觀察、拍照并測量其分生孢子大小。

1.4.2 分子鑒定 使用OMEGA Fungla DNA Kit試劑盒提取供試真菌DNA,使用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)、引物L(fēng)ROR(5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’)和LR5(5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’)、引物gpd1(5’-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3’)和gpd2(5’-GCCAAGCAGTTGGTTGTG- C-3’)分別對(duì)ITS、LSU和GAPDH基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]。50 μL PCR反應(yīng)體系,2×FastTaq Premix 25 μL、菌株DNA模板2 μL 、10 μmol/L引物各2 μL,加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s(退火溫度根據(jù)不同引物進(jìn)行調(diào)整),72 ℃延伸30 s,30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測,將擴(kuò)增產(chǎn)物送至?？诨Ｉ锟萍加邢薰緶y序。將所獲得序列在NCBI上Blast比對(duì),并提交序列,使用Sequence Matrix軟件進(jìn)行序列拼接,使用MEGA6.0軟件以最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 病原菌生物學(xué)特性測定

不同溫度的影響:病原菌培養(yǎng)5 d后,用直徑8 mm打孔器從菌落邊緣取菌塊,將菌塊接種在PDA培養(yǎng)基上,分別放置于15、20、25、28、30、32、35、40 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),每處理重復(fù)4次,5 d后使用十字交叉法測量菌落直徑。

不同培養(yǎng)基的影響:病原菌培養(yǎng)5 d后,用直徑8 mm打孔器從菌落邊緣取菌塊,將菌塊分別接種于PDA、PSA、CMA、OMA、V8、Czapek和MA培養(yǎng)基上,放置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),每處理重復(fù)4次,5 d后使用十字交叉法測量菌落直徑。

不同pH值的影響:使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH值至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,分別接種菌塊后置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),每處理重復(fù)4次,5 d后使用十字交叉法測量菌落直徑。

不同光照條件的影響:將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上,在相同培養(yǎng)溫度條件下分別設(shè)置光照24 h、黑暗24 h和光照12 h+黑暗12 h 3個(gè)處理,每處理重復(fù)4次,5 d后使用十字交叉法測量菌落直徑。

1.6 藥劑室內(nèi)篩選

設(shè)置250 g/L吡唑醚菌酯乳油100、50、20、10、5 mg/L,10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑1、0.5、0.1、0.01、0.005 mg/L,40%百菌清懸浮劑5、1、0.5、0.1、0.01 mg/L,430 g/L戊唑醇懸浮劑10、1、0.5、0.1、0.01 mg/L,40%腈菌唑可濕性粉劑10、1、0.5、0.1、0.01 mg/L,使用菌絲生長速率法[17]測定5種供試殺菌劑對(duì)病原菌的抑制效果。在超凈工作臺(tái)中將不同濃度供試藥液加入PDA培養(yǎng)基中,配置成不同濃度含藥培養(yǎng)基,選取培養(yǎng)5 d的病原菌,用直徑8 mm打孔器從菌落邊緣取菌塊,將菌塊接種至含藥培養(yǎng)基上,以不加藥液的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照,放置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),每處理重復(fù)4次,5 d后使用十字交叉法測量菌落直徑,計(jì)算各殺菌劑的抑菌率。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2021整理數(shù)據(jù),使用DPS 9.0進(jìn)行差異顯著、毒力回歸方程、EC50、相關(guān)系數(shù)等分析計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 油梨突臍蠕孢葉斑病癥狀

油梨突臍蠕孢葉斑病主要為害油梨下層葉片,發(fā)病初期,葉片出現(xiàn)近圓形小黑點(diǎn),斑點(diǎn)大小約2 mm,邊緣不整齊;隨后病斑擴(kuò)大,近圓形,邊緣深褐色,中間褐色,病部有黑褐色霉?fàn)钗?發(fā)病后期,病斑擴(kuò)展為不規(guī)則形(見圖1)。經(jīng)調(diào)查該病害在廣西崇左市彬橋、龍北等地油梨種植園的發(fā)病率為40%～55%。

圖1 油梨突臍蠕孢(Exserohilum rostratum)葉斑病發(fā)病癥狀

2.2 致病性測定

嫩葉接種病菌菌塊4 d后,刺傷接種和無傷接種均發(fā)病,接種部位變褐;7 d后病斑逐漸擴(kuò)展,與田間發(fā)病癥狀相同,對(duì)照(滅菌PDA)無明顯變化。老葉接種病菌菌塊7 d后,刺傷接種部位發(fā)病變黑,與田間發(fā)病癥狀相同,對(duì)照(滅菌PDA)無明顯變化;無傷接種部位未發(fā)病。噴施病菌孢子懸浮液7 d后,葉片上出現(xiàn)小黑點(diǎn),與田間發(fā)病初期癥狀一致(見圖2)。取接種后發(fā)病葉片分離病原菌,分離菌株與供試菌株ZSQ001形態(tài)一致,表明菌株ZSQ001為該病害的病原菌。

圖2 菌株ZSQ001致病性測定

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定 在PDA培養(yǎng)基上,菌株ZSQ001菌落圓形,邊緣整齊,中間灰黑色,邊緣灰白色,菌絲濃密。分生孢子棒狀,褐色,大小(64.36～85.10) μm×(10.77～17.92) μm,有假隔膜5～10個(gè),基部鈍圓,臍點(diǎn)從基細(xì)胞明顯突出。分生孢子梗黑褐色,單生,柱狀,不分枝,多隔膜(見圖3)。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定菌株ZSQ001為突臍蠕孢屬(Exerohilumsp.)真菌[18]。

圖3 菌株ZSQ001形態(tài)特征

2.3.2 分子鑒定 測序后獲得菌株ZSQ001的ITS序列為541 bp(登錄號(hào):ON248467),GAPDH序列為539 bp(登錄號(hào):ON489077),LSU序列為857 bp(登錄號(hào):ON366383)。將上述序列在NCBI上進(jìn)行BLAST對(duì)比,結(jié)果顯示,該菌的ITS序列與Exserohilumrostratum(登錄號(hào):MT524320.1)的同源性達(dá)到100%,GAPDH序列與E.rostratum(登錄號(hào):MW091458.2)的同源性達(dá)到99.42%,LSU序列與E.rostratum(登錄號(hào):MT516299.1)的同源性達(dá)到99.66%。將所獲得3個(gè)基因序列按照GAPDH-ITS-LSU順序進(jìn)行拼接,并在NCBI數(shù)據(jù)庫中選取相關(guān)基因序列(見表1),共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果,將該菌確定為突臍蠕孢Exserohilumrostratum。

表1 Exserohilum sp.,Setosphaeria sp.和Bipolaris setariae菌株及其相關(guān)基因序列登錄號(hào)

圖4 菌株ZSQ001基于GAPDH-ITS-LSU序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病原菌生物學(xué)特性

菌株ZSQ001在15～40 ℃均能生長,最適生長溫度28 ℃;7種培養(yǎng)基中,PDA和OMA培養(yǎng)5 d時(shí)菌落直徑最大,但OMA培養(yǎng)基上菌落菌絲稀薄,說明PDA培養(yǎng)基為該病原菌最適培養(yǎng)基;pH值2～11培養(yǎng)基上該病原菌均可生長,最適pH值7;不同光照條件下,該病原菌的菌落直徑差異顯著,黑暗24 h條件下菌落直徑最大,說明該病原菌適合在黑暗條件下生長(見表2)。

表2 不同培養(yǎng)條件下菌株ZSQ001(Exserohilum rostratum)菌落生長情況

2.5 防治藥劑篩選

5種藥劑對(duì)菌株ZSQ001均有不同程度的抑制效果,其中,10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、430 g/L戊唑醇懸浮劑和40%腈菌唑可濕性粉劑對(duì)菌株ZSQ001生長的抑制效果最好,其EC50分別為0.02、0.04和0.11 mg/L,與250 g/L吡唑醚菌酯乳油和40%百菌清懸浮劑的EC50差異顯著(見表3)。

表3 5種殺菌劑對(duì)菌株ZSQ001(Exserohilum rostratum)的室內(nèi)毒力比較

3 討論與結(jié)論

突臍蠕孢(E.rostratum)屬絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Moniliales)突臍蠕孢屬,在我國廣西、海南、山東、河南等地均有分布[19-22],可侵染香蕉、玉米、甘蔗、水稻、大豆等多種植物[23-25];鮮見突臍蠕孢侵染油梨的相關(guān)報(bào)道。突臍蠕孢除了侵染經(jīng)濟(jì)作物外,還具有開發(fā)微生物除草劑的潛力[26-27],明確致病范圍對(duì)該菌后續(xù)開發(fā)利用具有重要意義。

對(duì)廣西崇左油梨種植基地發(fā)現(xiàn)的油梨突臍蠕孢葉斑病病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性測定發(fā)現(xiàn),該病原菌菌落生長的最適溫度28 ℃,最適培養(yǎng)基為PDA,最適pH值7,黑暗條件有利于該菌生長。林善海等[19,28]研究發(fā)現(xiàn),突臍蠕孢(E.rostratum)最適生長溫度28 ℃,最適pH值6.5,燕麥、米糠、象草培養(yǎng)基對(duì)菌株的營養(yǎng)生長較PDA有利。不同菌株間最適pH值、培養(yǎng)基存在差異,可能與試驗(yàn)設(shè)計(jì)及病原菌的寄主及采集地點(diǎn)不同有關(guān)。室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果表明,10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、430 g/L戊唑醇懸浮劑和40%腈菌唑可濕性粉劑對(duì)菌株ZSQ001生長的抑制效果最好,這與戴利銘等[29]的研究結(jié)果基本相同,可將苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和腈菌唑作為防治油梨突臍蠕孢葉斑病的主選藥劑。

本研究主要從病原菌的分離鑒定、生物學(xué)特性及防治藥劑篩選等方面對(duì)油梨突臍蠕孢葉斑病進(jìn)行研究,研究結(jié)果對(duì)油梨突臍蠕孢葉斑病發(fā)生和防治具有參考價(jià)值。該病菌的寄主范圍,及其對(duì)不同品種油梨致病性有待進(jìn)一步研究。