火龍果愈傷組織誘導及再生體系的建立

陳華蕊,蓋江濤,何書強,馮振翠,陳業(yè)淵

(1 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所,?？?571101;2 中國熱帶農業(yè)科學院三亞研究院,海南三亞,572025)

火龍果屬于仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereusundatus)多漿類植物,是熱帶地區(qū)獨具特色的新奇特果樹?；瘕埞麑崰I養(yǎng)豐富,具有較高的經濟價值,是集水果、花卉、蔬菜、醫(yī)療保健等為一體的新型水果。生產中火龍果的種苗主要通過扦插或嫁接繁育,然而這些方法周期長、繁殖速度慢,并且在后代的遺傳中極易發(fā)生變異。開展火龍果的愈傷組織誘導及其再生體系的建立,既能有效提高種苗良種繁育系數(shù),也為火龍果的遺傳轉化研究提供支撐。彭思維等[1]研究認為,紫紅龍品種的幼嫩莖段通過添加TDZ、2,4-D 和NAA的組合配比能成功誘導出愈傷組織,誘導率高達89.1%。邢玉良等[2]以幼嫩莖段為試材,研究發(fā)現(xiàn),最適誘導愈傷組織的培養(yǎng)基是MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L,誘導率達92.7%。也有研究表明,以莖段和子葉作為外植體均能誘導出愈傷組織[3]。本研究在前人研究的基礎上探索利用紅皮紅肉品種“金都一號”不同成熟期莖段為外植體,通過對影響火龍果再生的諸多因素開展研究,篩選和優(yōu)化火龍果植株再生適宜的培養(yǎng)基配方,獲得高效的火龍果愈傷組織誘導及分化方法,建立穩(wěn)定的火龍果再生體系,為火龍果規(guī)模生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料火龍果品種:金都一號,取自中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所火龍果種質圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理 選取成年火龍果植株上無病害的幼嫩莖段、成熟莖在自來水下將表面的灰塵沖洗20 min,用毛刷經過洗潔精刷洗干凈后,去除莖段上的黏液,然后用手術刀將沖洗后的莖段沿髓部將3棱分開,切成2 cm左右的片段。幼嫩莖段經過75%酒精30 s+次氯酸鈉5 min+0.1 %升汞10 min處理,再用無菌水沖洗5次;成熟莖段采用75%酒精30 s+次氯酸鈉10 min+0.1%升汞15 min消毒,無菌水沖洗5次,備用。

將消毒滅菌的幼嫩莖段接入不定芽的誘導培養(yǎng)基上,待不定芽長到4～6 cm長時,將不定芽切下并切成2 cm左右的莖段,備用。培養(yǎng)條件(25±2)℃,光強2 000～2 500 lx,光照時間12 h/d。

1.2.2 不同成熟度莖段對愈傷組織的誘導影響 將以上處理好的幼嫩莖段、成熟莖段、幼苗莖段橫接在MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上,每個類型外植體接種10瓶,每瓶3個外植體,重復3次。觀察記錄不同外植體類型愈傷組織形態(tài)及誘導率。

將幼苗莖段切成1～2 cm以水平接和垂直接的方式接種于MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中,觀察比較2種接種方式對愈傷組織誘導的影響

1.2.3 不同基本培養(yǎng)基類型對愈傷組織誘導的影響 取備用的幼嫩莖段接入不同的培養(yǎng)基中:MS、1/2MS、1/4MS、B5,分別添加TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,每個類型的培養(yǎng)基中接15瓶,每瓶2個外植體,重復3次。觀察并統(tǒng)計愈傷組織生長形態(tài)及誘導率。

1.2.4 不同生長調節(jié)劑濃度及外植體類型對愈傷組織誘導的影響 將消毒滅菌后的成熟莖段、幼嫩莖段、幼苗莖段接種于以蔗糖(30 g/L)+卡拉膠(8 g/L)的MS為基本培養(yǎng)基,分別附加生長調節(jié)劑TDZ(0.2、0.6、1.0 mg/L)、KT(0.6、0.8、1.0 mg/L)、2,4-D( 0.5、1.0、2.0 mg/L)、6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)的培養(yǎng)基上培養(yǎng),每個處理接種10瓶,每瓶2個外植體,重復3次。接種后定期觀察愈傷組織的生長狀況,50 d后計算誘導率。

1.2.5 愈傷組織誘導不定芽生長調節(jié)劑的篩選 將初代培養(yǎng)誘導出來的黃綠色致密的愈傷組織切割成約0.5 cm×0.5 cm大小,接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基用MS基本培養(yǎng)基,附加6-BA、NAA生長調節(jié)劑組合設計。每處理接種10個外植體,重復5次,接種后40 d對不定芽數(shù)進行統(tǒng)計,初步篩選獲得最佳生長調節(jié)劑種類和濃度配比。

1.2.6 生根培養(yǎng) 當芽苗長至2～4 cm時,切下單個芽轉入生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng),以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,分別附加NAA 0.1～0.5 mg/L、 6-BA 0.5～1.5 mg/L,每種培養(yǎng)基接種10瓶,每瓶接種3株,重復3次。接種20 d后調查誘導生根情況。50 d后統(tǒng)計生根率(生根芽苗數(shù)/接種芽苗數(shù)×100%)及平均生根數(shù),并觀察生根苗長勢。待不定根平均3～4條時于室溫中煉苗7 d后移栽至營養(yǎng)土中。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理分析 愈傷組織誘導率(%)=出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100;愈傷組織分化率(%)=分化出芽的愈傷組織外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100。采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 不同成熟度莖段對愈傷組織誘導的影響

不同外植體接種10 d左右,切口慢慢膨大,隨后切口處逐漸產生黃白色或黃綠色的愈傷組織。從表1可知,“金都一號”火龍果的不同成熟度莖段均能誘導出愈傷組織,幼苗莖段誘導率為81.5%,顯著高于成熟莖段和幼嫩莖段,而成熟莖段的誘導率最低為38.9%。成熟莖段誘導的愈傷組織呈黃白色疏松狀,在后期培養(yǎng)過程中疏松狀愈傷組織會逐漸變褐色,甚至死亡。利用幼嫩莖段或幼苗莖段誘導愈傷組織,誘導率高,愈傷組織呈黃綠色堅硬致密狀,在后期培養(yǎng)中容易增殖并分化成苗。

表1 不同成熟度莖段對火龍果愈傷組織誘導的影響

2.2 不同接種方式對愈傷組織誘導的影響

莖段的接種方式主要有水平接和垂直接(見圖1)。水平接的莖段能較大面積地接觸培養(yǎng)基,莖段上的刺座及兩個切面均能誘導出愈傷組織,而垂直接只有莖段的單個切面接觸培養(yǎng)基,而愈傷組織一般在刺座和切口周圍萌發(fā),因此,水平接誘導的愈傷組織明顯多于垂直接,有利于愈傷組織的誘導。

注:A 水平接;B 垂直接。

2.3 不同基本培養(yǎng)基類型對愈傷組織誘導的影響

如表2所示,在MS、1/2MS、1/4MS、B5等4種不同的基本培養(yǎng)基中添加TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,愈傷組織的誘導率差異達顯著水平,其中以MS培養(yǎng)基的誘導率最高,達到76.7%,愈傷組織呈黃綠色致密狀,體積較大,誘導率最低的是B5培養(yǎng)基,未見愈傷組織產生。因此,本實驗采用MS為基本的培養(yǎng)基。

表2 不同基本培養(yǎng)基對火龍果愈傷組織誘導的影響

2.4 TDZ對愈傷組織誘導的效果

TDZ具有極強的細胞分裂活性,對誘導植物愈傷組織的效果顯著[1,4]。為篩選合適的濃度,研究了添加不同濃度TDZ對火龍果幼嫩莖段愈傷組織誘導的效果。由表3可看出,愈傷組織誘導率隨TDZ濃度增加而增加,TDZ濃度為0.1 mg/L時,愈傷組織誘導率為16.7%;TDZ濃度為0.6 mg/L時,誘導率達到56.7%,顯著高于其他濃度水平(p<0. 05);TDZ濃度升高為1.0～1.5 mg/L時,誘導率為50%～55%,略有下降,但是變化不大。TDZ濃度在0.6～1.0 mg/L之間有利于愈傷組織的誘導。

表3 不同濃度TDZ對火龍果幼嫩莖段愈傷組織誘導的影響

2.5 不同生長調節(jié)劑濃度及外植體類型對愈傷組織誘導的效果

成熟莖段在添加TDZ、KT和2,4-D的組合中均能誘導出愈傷組織,但并未見不定芽發(fā)生。愈傷組織形態(tài)特征主要表現(xiàn)為乳白色疏松、黃白色疏松,黃綠色致密、白色帶紅色疏松(見圖2)。當TDZ的濃度相同時,愈傷組織誘導率隨著KT和2,4-D濃度的增加而增加,而當2,4-D的濃度一定時,愈傷組織誘導率隨著TDZ和KT濃度的增加而增加。當TDZ 1.0 mg/L+KT 0.8 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L時愈傷組織誘導率最高,達到58.3%(見表4),誘導的愈傷組織大部分呈黃白疏松狀,只有少量的致密黃綠色愈傷組織產生。在后期的培養(yǎng)中,呈疏松狀的白色或黃白色帶紅色愈傷組織容易褐化死亡,很難分化成不定芽(見圖3)。

注:A 乳白色疏松愈傷組織;B 黃白色疏松愈傷組織;C 綠色致密愈傷組織;D 白色帶紅色疏松愈傷組織。

圖3 愈傷組織褐化和愈傷組織誘導不定芽

由表5可以看出,將幼嫩莖段接種于培養(yǎng)基20 d 后,莖段切口開始膨大誘導形成愈傷組織,同時刺座部位膨大隆起并冒出不定芽。愈傷組織形態(tài)呈綠色致密、黃綠色致密以及黃白色疏松狀。TDZ添加KT和2,4-D的效果明顯優(yōu)于TDZ單獨使用。隨著TDZ濃度的增加,愈傷組織誘導率逐漸升高,高濃度TDZ有利于愈傷組織誘導,0.2、0.6 mg/L TDZ添加KT、2,4-D后誘導的愈傷組織呈綠色或黃綠致密狀,愈傷組織的誘導率也隨著KT濃度的增加而增加,最高達到81.7%,顯著高于其他組合,不定芽再生率也隨著KT、2,4-D濃度的增加而增加,最高達到36.3%。當TDZ濃度為1.0 mg/L時,愈傷組織質地疏松,呈黃白色,誘導率隨著KT濃度增加而增加,不定芽誘導率隨著KT濃度增加而降低,KT增加到1.0 mg/L時,不定芽再生率為19.8%。由此可見,TDZ在一定范圍內能成功誘導出愈傷組織,但過高的濃度會致使愈傷組織質地疏松,不利于后期愈傷組織的分化。因此,較適宜幼嫩莖段誘導愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.6 mg/L+KT 0.8 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L。

表5 不同的生長調節(jié)劑濃度配比對火龍果幼嫩莖段愈傷組織誘導的影響

幼苗的莖段接種于含有不同生長調節(jié)劑配比的培養(yǎng)基上誘導愈傷組織,結果如表6所示。6-BA濃度在1.0～3.0 mg/L時配合2,4-D使用均能誘導出愈傷組織。愈傷組織的表現(xiàn)形態(tài)有差異,有白色疏松狀、黃綠色致密,綠色帶白疏松狀(見圖4)。經方差分析結果表明,不同濃度的6-BA和2,4-D配比對愈傷組織的誘導有顯著效果。當6-BA的濃度不變時,愈傷組織的誘導率隨著2,4-D濃度的增加而增加,最高可達到93.3%。6-BA增加至3.0 mg/L時,誘導的愈傷組織中間綠色邊緣泛白,疏松狀,后期培養(yǎng)的過程中容易增殖但不容易分化。當6-BA濃度為2.0 mg/L,2,4-D濃度為1.0 mg/L時愈傷組織的誘導率最高,達到91.7%。明顯高于幼嫩和成熟莖段的誘導率。

注:A 白色疏松狀;B:黃綠色致密;C:綠色帶白,疏松狀。

表6 不同生長調節(jié)劑濃度配比對火龍果幼苗莖段愈傷組織誘導的影響

2.6 愈傷組織誘導不定芽

接種10 d之后,呈致密狀黃綠色的愈傷組織逐漸膨大;培養(yǎng)40 d后,愈傷組織上有綠色的芽點產生(見圖4)。如表7所示,6-BA濃度在 1.0～4.0 mg/L 時配合NAA濃度 0.1～0.5 mg/L均能誘導不定芽的產生。不同濃度的6-BA、 NAA對愈傷組織誘導不定芽都有顯著影響,當較低濃度的6-BA(1.0 mg/L)與適當濃度的NAA組合時,不定芽的誘導率較低,誘導率5%～17%;當較高濃度的 6-BA(2.0～4.0 mg/L)與適當濃度的NAA組合時,愈傷組織不定芽的誘導率較高,可高達88%。在合適的范圍內,當 6-BA濃度相同時,不定芽誘導率基本隨著NAA濃度的提高而增加,但當NAA升高到0.5 mg/L時,愈傷組織誘導不定芽的誘導率有所下降,但是變化不大。綜上所述,不同濃度6-BA和NAA組合對愈傷組織不定芽誘導的影響不同,其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基的不定芽誘導效果最好,達到了88%。

表7 不同濃度6-BA與NAA組合的培養(yǎng)基對火龍果不定芽誘導的影響

2.7 生根培養(yǎng)

再生不定芽接種30 d后開始有根系的生成,60 d后即可煉苗移栽。由表8可知,不同處理組合間再生芽的生根率存在極顯著差異,且誘導形成的不定根長勢不一致。隨著 6-BA濃度的升高,莖段生根率極顯著提高,從23.3%上升到97.8%,且平均根數(shù)從2.3根增加到7.2根。6-BA的濃度增加到1.5 mg/L時,生根率顯著下降,降到62.2%。因此,在MS培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L,芽和根長勢較強壯,平均根長為8.8 cm,平均根數(shù)為7.2條,生根率為 97.8%。研究發(fā)現(xiàn),在添加6-BA和NAA的生根培養(yǎng)基上同時會誘導出腋芽,當6-BA的濃度大于0.5 mg/L時,誘導的腋芽明顯增多且長勢健壯,這與彭思維等的研究結果一致[1]。苗在室溫中煉苗5～7 d,移栽到營養(yǎng)盆中,成活率達到100%。

表8 不同生長調節(jié)劑配比對火龍果生根的影響

3 結論與討論

本研究發(fā)現(xiàn),火龍果不同的外植體類型誘導的愈傷組織主要有以下幾種形態(tài)類型:白色疏松狀、黃白色疏松狀、黃綠色疏松狀、白色帶紅色疏松狀、黃綠色致密顆粒狀,這與彭思維等的研究結果一致[5]。其中,白色疏松狀、黃白色疏松狀、白色帶紅色疏松狀愈傷組織在培養(yǎng)過程中容易褐化死亡,而黃綠色致密顆粒狀的愈傷組織在后期的培養(yǎng)中能夠增殖并誘導不定芽的發(fā)生。在試驗中發(fā)現(xiàn),為了抑制疏松狀愈傷組織褐化死亡,主要采用短時間內多次轉瓶或暗培養(yǎng)等措施來減少褐化率,但未得到良好的效果,愈傷組織最后還是會褐化死亡。Asmus B、彭思維等[1,6]認為,愈傷組織呈疏松狀是由于代謝活動過強引起的,而褐化現(xiàn)象可能是醌類物質擴散到培養(yǎng)基中而使其顏色變化引起的酶促變褐色。

關于火龍果愈傷組織再生方面的研究已有報道,主要是成熟莖段、幼嫩莖段、幼苗莖段、子葉或花粉作為外植體[2,7-10]?；瘕埞黄贩N不同類型外植體誘導愈傷組織的效果也不同。有研究學者認為,幼嫩莖段更容易誘導愈傷組織,誘導率達到89.1%[1]。本研究以不同成熟度的莖段為外植體作為研究對象,結果表明,幼芽誘導率(91.7%)明顯大于幼嫩莖段(81.7%)和成熟莖段(58.3%)。由此說明,愈傷組織的誘導率與外植體的類型有關,也與外植體本身的生理特性有關。采用幼芽莖段作為外植體,其生長狀態(tài)屬于幼嫩階段,再生能力較強。黃紅梅等[3]的研究也表明,幼芽誘導愈傷組織的誘導率更高,與本試驗的結果一致。

本試驗研究了不同質量濃度TDZ 、KT、2,4-D、6-BA的混合配比對愈傷組織的誘導效果,結果發(fā)現(xiàn),不同外植體對生長調節(jié)劑的敏感度不一樣,老熟莖段誘導的愈傷組織以疏松狀為主,在后期增殖分化培養(yǎng)基中容易褐化死亡,而以幼嫩莖段或幼苗莖段誘導的愈傷組織大部分呈黃綠色致密狀或綠色致密狀,在后期培養(yǎng)中容易分化成不定芽。因此,應選擇幼嫩或幼苗莖段作為外植體。研究還發(fā)現(xiàn),添加不同濃度TDZ對愈傷組織的誘導有顯著差異,在幼嫩莖段誘導愈傷組織過程中,愈傷組織的誘導率隨著TDZ濃度的增加而增加,當TDZ濃度大于1.0 mg/L時誘導率逐漸降低,誘導的愈傷組織質地變疏松,不利于后期的增殖和分化。

不同植物生長調節(jié)劑種類及配比是組織再生的關鍵。本實驗結果表明,不同濃度6-BA、NAA組合對火龍果愈傷組織分化不定芽均存在極顯著影響。一定濃度6-BA與低濃度NAA配合使用,愈傷組織分化的效果較好,但當NAA濃度提高到0.5 mg/L時,芽的分化率會降低。不同濃度6-BA和NAA組合對愈傷組織不定芽誘導的影響不同,其中以MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基的不定芽誘導效果最好。