壯腰通絡(luò)方對椎間盤退變大鼠髓核細(xì)胞焦亡的影響

馮蓬 ，朱立國 ，高春雨 ，張威 ，高景華 ，孫凱 ，李路廣 ，車穎 ，回瑾

1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100020； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是導(dǎo)致盤源性腰痛和其他脊柱退行性疾病的主要原因[1]，是大部分脊柱退行性疾病的重要病理基礎(chǔ)，往往在MRI影像中被早期識別[2]。國外研究表明，腰痛的終生患病率高達(dá)84%，慢性腰痛的患病率約為23%，有11%～12%患者因腰痛致殘[3]。隨著人們生活方式的改變，腰痛患病率逐年增加且有年輕化趨勢，與IDD的病理改變高度相關(guān)[4]。

細(xì)胞焦亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式。越來越多的研究表明，IDD與髓核細(xì)胞（NPCs）焦亡相關(guān)，腫瘤壞死因子（TNF）-α及其進(jìn)一步激活的核因子（NF）-κB信號通路可能是NPCs焦亡的中心環(huán)節(jié)[5]。在退變的NPCs中，TNF-α、NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶（Caspase）-1、白細(xì)胞介素（IL）-1β表達(dá)顯著上調(diào)，其水平能夠反映NPCs的焦亡程度[6]。焦亡的髓核組織進(jìn)一步釋放炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[7]。抑制NLRP3激活可以減少細(xì)胞外基質(zhì)降解，對NPCs起到保護(hù)作用，從而緩解IDD。

壯腰通絡(luò)方是朱立國教授在《外臺秘要》腰痛類方的證治特點及用藥規(guī)律基礎(chǔ)上總結(jié)而成[8]，具有補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)作用，用于治療脊柱退行性疾病所致腰痛及腰椎功能障礙，臨床應(yīng)用多年，療效顯著[9]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，該方能降低腰椎間盤退行性病變大鼠血清炎癥因子水平，增加椎間盤組織NPCs數(shù)量[10]。本研究觀察壯腰通絡(luò)方對IDD大鼠NPCs焦亡的影響，進(jìn)一步探究其延緩IDD的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物

8周齡SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，購于中國食品藥品檢定研究院，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2017-0005。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動物房，通風(fēng)良好，溫度20～25 ℃，濕度40%～50%，12 h/12 h光暗交替，自由攝食飲水，動物使用許可證號SYXK（京）2021-0017。本實驗經(jīng)北京隆安實驗動物中心倫理委員會審批（BJLongan-L-L-003）。

1.2 藥物及制備

壯腰通絡(luò)方由杜仲、熟地黃、當(dāng)歸、丹參、延胡索、獨活、川芎、秦艽、牛膝按15∶15∶12∶12∶10∶10∶10∶12∶12比例組成，飲片購于中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥房，由中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院骨傷科研究所制成原藥材濃度分別為25.2、12.6、6.3 g/mL濃縮液備用。TNF-α競爭性抑制劑依那西普，美國MedChemExpress，純度≥98.0%，貨號HY-108847，使用前用生理鹽水配制成1 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

BCA蛋白定量檢測試劑盒、RIPA裂解液、Cocktail蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF、蛋白上樣緩沖液、抗體稀釋液、ECL試劑盒（武漢Servicebio，貨號分別為G2026-200T、G2002-30ML、G2006-250UL、G2007-1ML、G2008-1ML、G2013-1ML、G2025-100ML、G2014-50ML），中性甲醛（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0099），10%EDTA脫鈣液（武漢Servicebio，貨號G1105），TNF-α、IL-18 ELISA試劑盒（英國Abcam，貨號分別為ab236712、ab213909），IL-1β ELISA試劑盒（美國Invitrogen，貨號ER5RBX5），Ⅱ型膠原（collagenⅡ）抗體（英國Abcam，貨號ab307674），聚集蛋白聚糖（aggrecan）抗體（美國Proteintech，貨號13880-1-AP），NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白（IκB）-α抗體（武漢Servicebio，貨號分別為GB114320、GB11383、GB11997、GB11212）。垂直電泳儀（武漢Servicebio，型號BV-2），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），顯微鏡（日本尼康儀器有限公司，型號E100），核磁共振成像系統(tǒng)（德國Siemens，型號MAGNETOM skyra3.0T）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、依那西普組和壯腰通絡(luò)方高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組采用針刺尾椎法建立IDD模型[11-12]：戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，選定C6-7、C7-8為針刺間隙，消毒皮膚，以26G針頭經(jīng)纖維環(huán)水平穿至髓核中，穿入后將針體旋轉(zhuǎn)360°，保持30 s后垂直拔出，無菌棉球按壓針孔15 s。分別于第0、14、28日穿刺。

2.2 給藥方法和模型評定

于首次造模后次日開始給藥，壯腰通絡(luò)方高、中、低劑量組分別予252、126、63 g/kg壯腰通絡(luò)方藥液灌胃（相當(dāng)于60 kg成人臨床用藥量的2、1、0.5倍），灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)30 d。正常組、模型組和依那西普組灌胃等體積生理鹽水。依那西普組造模同時于針刺處注射1 mg/mL依那西普溶液，注射體積10 mL/kg，模型組和壯腰通絡(luò)方高、中、低劑量組注射等體積生理鹽水。給藥結(jié)束后，利用核磁共振成像系統(tǒng)掃描C6-7、C7-8椎間盤和C8-9椎間盤（正常對照），以評估IDD程度。

2.3 取材

給藥結(jié)束后麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。用鑷子和手術(shù)刀剔除附著在C6-7椎間盤周圍的軟組織，使其可清晰分辨椎體和纖維環(huán)包裹的椎間盤，使用手術(shù)刀尖端輕輕嵌入上軟骨終板與椎體界限，并將上軟骨終板翹起，可見透明膠凍狀髓核組織，無菌小刮匙取出髓核組織，置于離心管中，液氮暫存，用于Western blot檢測。在C8-9離斷尾椎，將包含的C7-8椎間盤置于4%多聚甲醛中，隨后ETDA脫鈣處理，制作石蠟切片（4 μm），用于免疫組化染色。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 ELISA檢測

取大鼠血清，按ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測TNF-α、IL-1β、IL-18含量。

2.4.2 Western blot檢測

將C6-7髓核組織取出，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑混合液50 μL，冰上裂解15 min，4 ℃、2 000×g離心5 min，收集上清液，進(jìn)行BCA蛋白定量，加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃使蛋白變性。每孔上樣20 μg蛋白，恒壓250 V電泳22 min，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜45 min。加aggrecan、collagenⅡ一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Image J 1.5.0軟件分析蛋白相對灰度值。

2.4.3 免疫組化染色

C7-8椎間盤石蠟切片脫蠟至水，進(jìn)行熱抗原修復(fù)，自然冷卻，切片置于PBS（pH7.4）中脫色，3%過氧化氫室溫避光孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加3%BSA，室溫封閉30 min。甩掉封閉液，滴加NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、IκB-α一抗（均為1∶1 000），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二抗（1∶200），室溫孵育50 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，400倍視野下觀察結(jié)果。采用Image J 1.5.0軟件對切片進(jìn)行分析，以平均光密度評價表達(dá)強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠椎間盤退變程度評估

正常組大鼠C6-7和C7-8椎間盤信號均一，未見退變征象；模型組、依那西普組和壯腰通絡(luò)方高、中、低劑量組與正常對照比較，C6-7和C7-8椎間盤信號明顯變黑，提示C6-7和C7-8發(fā)生IDD。見圖1。

圖1 各組大鼠椎間盤核磁共振T2加權(quán)像

4.2 壯腰通絡(luò)方對模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-18含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，依那西普組和壯腰通絡(luò)方高、中劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），壯腰通絡(luò)方低劑量組TNF-α含量顯著降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18含量比較（，pg/mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組依那西普組壯腰通絡(luò)方高劑量組壯腰通絡(luò)方中劑量組壯腰通絡(luò)方低劑量組IL-18 37.30±1.22 56.90±2.66**48.28±1.35##51.63±0.54#51.55±0.47#59.22±2.87只數(shù)8 8 8 8 8 8 TNF-α 3.00±0.78 37.85±8.26**0.82±0.64##10.75±0.62##12.20±1.53##24.40±3.35##IL-1β 37.50±0.08 102.50±2.69**50.80±7.63##71.80±7.02##73.20±7.98##100.59±5.15

4.3 壯腰通絡(luò)方對模型大鼠髓核組織聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，依那西普組和壯腰通絡(luò)方高、中劑量組aggrean、collagenⅡ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表2。

表2 各組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達(dá)比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

collagenⅡ1.000±0.000 0.197±0.004**1.154±0.007##0.780±0.179##0.600±0.090##0.290±0.107組別正常組模型組依那西普組壯腰通絡(luò)方高劑量組壯腰通絡(luò)方中劑量組壯腰通絡(luò)方低劑量組只數(shù)8 8 8 8 8 8 aggrean 1.000±0.000 0.584±0.014**0.991±0.012##0.697±0.033#0.725±0.003##0.544±0.064

圖2 各組大鼠髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白免疫印跡

4.4 壯腰通絡(luò)方對模型大鼠髓核組織NOD樣受體蛋白3、胱天蛋白酶-1、核因子-κB p65和核因子-κB抑制蛋白-α表達(dá)的影響

NLRP3和Caspase-1主要定位在NPCs細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，NF-κB p65、IκB-α主要在NPCs細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。正常組有少量NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65表達(dá)，IκB-α表達(dá)較高；模型組和壯腰通絡(luò)方低劑量組髓核組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見NPCs焦亡后殘留的空泡，壯腰通絡(luò)方高、中劑量組空泡顯著減少，髓核組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。與正常組比較，模型組大鼠髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高，IκB-α蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，依那西普組和壯腰通絡(luò)方高、中劑量組大鼠髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低，IκB-α蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3～圖7。

圖4 各組大鼠髓核組織Caspase-1表達(dá)（免疫組化染色）

圖5 各組大鼠髓核組織NF-κB p65表達(dá)（免疫組化染色）

圖6 各組大鼠髓核組織IκB-α表達(dá)（免疫組化染色）

圖7 各組大鼠髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、IκB-α蛋白表達(dá)比較（）

5 討論

IDD臨床表現(xiàn)以腰痛和腰椎功能障礙為主，可歸屬中醫(yī)學(xué)“腰痛”“腰腿痛”“痹證”范疇，屬慢性筋傷骨病。腰部主要有肝經(jīng)、腎經(jīng)和膀胱經(jīng)貫穿，肝主疏泄，腎主藏精納氣?！端貑枴ゐ粽撈费浴白诮钪魇嵌麢C(jī)關(guān)也”，肝腎虧虛導(dǎo)致腰部筋脈失去濡養(yǎng)，使腰部筋骨松弛難以御邪。風(fēng)、寒、濕是常見侵襲腰部的外來邪氣。肝腎虧虛狀態(tài)下，風(fēng)、寒、濕邪氣乘虛而入，最易傷及腰部筋脈，使本就缺乏濡養(yǎng)的筋脈更加瘀阻，最終導(dǎo)致腰痛。聚焦于臨床最為常見的肝腎虧虛、瘀血阻絡(luò)證型，壯腰通絡(luò)方以補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)為綱，標(biāo)本兼治。方中杜仲、熟地黃、當(dāng)歸、牛膝滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)血養(yǎng)血，固護(hù)肝腎之本；延胡索、川芎、丹參重在行氣、活血、通絡(luò)；獨活、秦艽祛風(fēng)除濕、和血舒筋，祛除筋脈中瘀阻的風(fēng)、寒、濕邪。

NPCs焦亡是炎癥小體激活引發(fā)的細(xì)胞程序性死亡，與NF-κB信號通路密切相關(guān)，是IDD的主要表型改變[13-14]。當(dāng)IDD發(fā)生時，髓核失去內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，TNF-α激活NPCs的NF-κB信號通路，NF-κB p65合成增加，同時IκB-α泛素化降解程序激活，促進(jìn)NF-κB p65作為轉(zhuǎn)錄因子參與焦亡蛋白合成，最終增加NLRP3炎性小體合成及IL-1β和IL-18前體合成[15-18]。NLRP3炎性小體通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，其中誘導(dǎo)Caspase-1前體的自剪切并成熟是最經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑[15]。成熟的Caspase-1進(jìn)一步剪切Gasdermin D、IL-1β和IL-18前體蛋白使其活化，活化的Gasdermin D釋放N端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域結(jié)合膜脂并打開細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓變化，成熟的IL-1β和IL-18釋放到細(xì)胞外，引發(fā)炎癥瀑布，形成NPCs焦亡惡性循環(huán)[15，17]。因此，抑制NPCs焦亡可能是抑制髓核炎癥瀑布，阻斷NPCs焦亡惡性循環(huán)，進(jìn)而延緩IDD的有效措施[19]。本研究從NPCs焦亡角度探索壯腰通絡(luò)方治療IDD的作用機(jī)制：首先，ELISA結(jié)果表明，壯腰通絡(luò)方能降低IDD大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-18含量，表明壯腰通絡(luò)方能夠顯著降低髓核炎癥水平，推測其參與了焦亡關(guān)鍵蛋白IL-1β和IL-18合成及分泌；其次，Western blot結(jié)果表明，壯腰通絡(luò)方能上調(diào)髓核組織aggrean、collagenⅡ蛋白表達(dá)，二者具有保持髓核水分、維持正常代謝、平衡椎間盤應(yīng)力的作用，有助于維持髓核的基本生物學(xué)功能和抑制內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡；最后，免疫組化染色結(jié)果顯示，壯腰通絡(luò)方能抑制髓核組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65蛋白表達(dá)，促進(jìn)IκB-α蛋白表達(dá)，表明壯腰通絡(luò)方通過抑制NPCs的NF-κB信號通路激活抑制NLRP3炎性小體合成和Caspase-1成熟。

綜上所述，壯腰通絡(luò)方能夠顯著抑制NPCs焦亡，延緩IDD，其機(jī)制可能與抑制髓核組織NF-κB信號通路，限制NLRP3炎性小體和Caspase-1活化有關(guān)。本研究進(jìn)一步明確了壯腰通絡(luò)方治療IDD的作用機(jī)制，但其具體機(jī)制仍有很大探索空間。前期研究發(fā)現(xiàn)，髓核是免疫豁免器官，誘導(dǎo)NPCs焦亡的TNF-α并非NPCs本身分泌，而是以M1型巨噬細(xì)胞為主導(dǎo)的免疫細(xì)胞合成并分泌[18]，M1型巨噬細(xì)胞既是退變髓核的主要炎性細(xì)胞類型，也是NPCs焦亡惡性循環(huán)的始動因素。因此，壯腰通絡(luò)方是否能對M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)控作用以限制NPCs焦亡惡性循環(huán)，是課題組今后研究的方向。