金蓮花口服液高效液相色譜指紋圖譜建立及指標(biāo)成分含量測定

潘 燕

（浙江康恩貝制藥股份有限公司·浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江金華 321109）

金蓮花口服液是由毛茛科植物金蓮花Trollius chinensisBge. 的干燥花制成的單方制劑［1］，含有黃酮類和生物堿類成分，具有良好的清熱、解毒、消腫、抗菌、抗病毒作用，可用于上呼吸道感染、扁桃體炎、咽炎、口瘡、急性鼓膜炎、急性淋巴管炎等疾病的治療［2］。目前，除口服劑型外，片劑、膠囊劑、顆粒劑等其他劑型均收載于《中國藥典（一部）》，并以葒草苷（C21H20O11）為指標(biāo)成分控制含量［1］。指紋圖譜技術(shù)可對中藥制劑中的各類成分進(jìn)行分析，在有效成分難以明確的情況下，能較全面地反映中藥制劑中所含化學(xué)成分組成及占比，在評價(jià)質(zhì)量一致性及產(chǎn)品穩(wěn)定性方面具有明顯優(yōu)勢［3-8］。為此，本研究中建立了金蓮花口服液的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并同時(shí)測定葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素的含量，為金蓮花制劑的質(zhì)量控制及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XSE205DU 型電子天平（瑞士Mettler - Toledo 公司，精度為十萬分之一）；Milli - Q 型超純水儀（美國Millipore 公司）；WSZ - 100A 型回旋振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷對照品（振強(qiáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20191003，純度為99.85%）；葒草苷對照品（批號(hào)為111777 - 202003，純度為98.0%），牡荊苷對照品（批號(hào)為111687-201704，純度為94.9%），槲皮素對照品（批號(hào)為100081-201610，純度為99.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國Merck 公司；磷酸（EP，西班牙Scharlau公司）；水為純化水；金蓮花口服液（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號(hào)分別為JL2081-1，JL2081-2，JL2081-3，JL2082-1，JL2082-2，JL2082-3，JL2083-1，JL2083-2，JL2083-3，JL2181-1，JL2181-2，21JL81-3，JL2182-1，JL2182-2，JL2181-3，JL2183-1，JL2183-2，JL2183-3，編號(hào)為S1-S18，規(guī)格為每支10 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex - XB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.35%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min 時(shí)12%A，12～25 min 時(shí)12%A →15%A，25～28 min 時(shí)15%A →19%A，28～40 min 時(shí)19%A →23%A，40～46 min 時(shí)23%A →25%A，46～55 min 時(shí)25%A，55～60 min 時(shí)25%A →33%A，60～65 min 時(shí)33%A，65～70 min時(shí)33%A →90%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：340 nm；進(jìn)樣量：5μL。

2.2 溶液制備

精密量取樣品5 mL，置100 mL 容量瓶中，加甲醇80 mL，回旋振蕩30 min，加甲醇定容，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

取葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素對照品各適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成每1 mL 含葒草素- 2″ -O-β-L- 半乳糖苷50μg、葒草苷60μg、牡荊苷18μg、槲皮素5μg 的混合對照品溶液。

按處方比例稱取蔗糖50.00 g、羥苯乙酯0.10 g、苯甲酸鈉0.90 g，精密稱定，置500 mL 容量瓶中，用純化水溶解并定容，按供試品溶液制備方法制備缺金蓮花的陰性對照品溶液。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 方法學(xué)考察

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S5）6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以葒草苷（4 號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0～0.29%之間（n=6），相對峰面積的RSD在0～2.76%之間（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S5）6 份，依法制備供試品溶液，不同人員于不同時(shí)間利用不同儀器按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以葒草苷（4 號(hào)峰）為參照峰，并與重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液共12 份計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0～1.10%之間（n= 12），相對峰面積的RSD在0～2.92%之間（n= 12），表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S5），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以葒草苷（4 號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0～1.81%之間（n= 11），相對峰面積的RSD在0～2.84%之間（n= 11），表明供試品溶液在室溫下放置96 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 對照圖譜生成及共有峰標(biāo)定

取樣品（編號(hào)為S1-S18），按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）進(jìn)行分析，以S1為參照圖譜，選擇中位數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，生成對照圖譜，確定22個(gè)共有峰。詳見圖1。通過與混合對照品溶液色譜圖進(jìn)行對比，指認(rèn)了4 種指標(biāo)性成分，分別為2 號(hào)峰（葒草素- 2″ -O-β-L- 半乳糖苷）、4 號(hào)峰（葒草苷）、8 號(hào)峰（牡荊苷）、17 號(hào)峰（槲皮素）。其中，葒草苷分離度較好，保留時(shí)間適中，峰面積最大，峰形對稱，故選擇其為參照峰（S）。

圖1 18批金蓮花口服液高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC overlay fingerprints of 18 batches of Jinlianhua Oral Liquid

2.3.3 相似度評價(jià)

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）計(jì)算18批樣品（編號(hào)為S1-S18）的相似度，結(jié)果相似度均不低于0.988，表明不同批次樣品相似度高。詳見表1。

表1 18批金蓮花口服液指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果Tab.1 Similarity results of fingerprints of 18 batches of Jinlianhua Oral Liquid

2.4 指標(biāo)性成分含量測定

2.4.1 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照品溶液各5μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果各成分色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾。詳見圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖2.2″-O-β-L-Galactopyanosylorientin 4.Orientin 8.Vitexin 17.QuercetinA.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關(guān)系考察：取葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素對照品各適量，精密稱定，分別用50%甲醇溶解并逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察及檢測限、定量限確定結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ

檢測限和定量限確定：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限［9］。結(jié)果見表2。

重復(fù)性試驗(yàn)：以2.3.1項(xiàng)下重復(fù)性試驗(yàn)圖譜數(shù)據(jù)計(jì)算樣品含量，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素平均含量分別為2.68，2.96，0.86，0.24 mg/ mL，RSD分別為0.44%，0.28%，0.60%，1.70%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：以2.3.1項(xiàng)下穩(wěn)定性試驗(yàn)圖譜數(shù)據(jù)計(jì)算，葒草素- 2″ -O-β-L- 半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.55%，0.42%，0.62%，0.41%（n=11），表明供試品溶液在室溫下放置96 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

中間精密度試驗(yàn)：以2.3.1項(xiàng)下中間精密度試驗(yàn)圖譜數(shù)據(jù)計(jì)算樣品含量，并與“2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)”項(xiàng)下供試品溶液含量共12 份計(jì)算葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.89%，0.98%，1.04%，2.24%（n= 12），表明中間精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S5）2.50 mL，平行6 份，分別精密加入葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素對照品各適量，依法制備供試品溶液。結(jié)果加樣回收率均在85%～110%之間，表明方法準(zhǔn)確度良好。詳見表3。

表3 4個(gè)指標(biāo)性成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of four indicator components（n=6）

2.4.2 樣品含量測定

取樣品（編號(hào)為S1-S18），依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算含量。結(jié)果顯示，同一批藥材得到的制劑（編號(hào)為S1-S3，編號(hào)為S4-S6，編號(hào)為S7-S9，編號(hào)為S10-S12，編號(hào)為S16-S18）各指標(biāo)性成分的含量較接近，批間略有差異。詳見表4。

表4 18批樣品中4個(gè)指標(biāo)性成分的含量測定結(jié)果（mg/mL，n=2）Tab.4 Results of the content determination of four indicator components in 18 batches of samples（mg/mL，n=2）

3 討論

3.1 色譜柱選擇

對不同色譜柱Kromasil-100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Thermo - Hypersil - GOLD - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Inevtsil ODS - 3 C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Kinetex - XB - C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行考察，結(jié)果Kinetex-XBC18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）峰形較其他色譜柱好，故最終選擇此色譜柱用于分離。

3.2 流動(dòng)相選擇

考察不同流動(dòng)相體系［乙腈- 0.1%磷酸溶液、乙腈- 0.1%磷酸溶液（含1%四氫呋喃）、乙腈- 1%冰醋酸溶液、乙腈- 0.4%磷酸溶液、乙腈- 0.35%磷酸溶液］的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.35%磷酸溶液分離度高，色譜峰較多，故最終選擇此流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 指標(biāo)成分選擇

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金蓮花及其制劑具有抗菌、抗病毒等作用［10］，其主要有效成分為黃酮類化合物，包括葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、槲皮素等［11-15］，故最終選擇上述4 個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定。

3.4 方法評價(jià)

本研究中建立的方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確性與重復(fù)性均良好，可用于金蓮花口服液的質(zhì)量控制。