高效液相色譜法同時(shí)測定益肺止嗽顆粒中7 種成分含量*

劉永昌，王雪梅，李喜香△，高麗霞

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000； 2. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州 730050）

益肺止嗽顆粒由麻黃、杏仁、半夏、茯苓、甘草、陳皮、當(dāng)歸等15味中藥材組方，具有宣肺和喘、祛痰止嗽等功效，用于治療新咳久嗽、氣喘痰多、慢性支氣管炎等癥。但目前益肺止嗽顆粒尚未建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，故本研究中根據(jù)不同藥味的藥理學(xué)作用和有效部位，結(jié)合君臣佐使的組方原則，選擇君藥麻黃中的有效成分鹽酸麻黃堿、苦杏仁中的有效成分苦杏仁苷，臣藥當(dāng)歸中的有效成分阿魏酸、黃芪中的有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，以及在處方中起止咳化痰、祛痰止嗽功效的陳皮、萊菔子、甘草中的有效成分橙皮苷、芥子堿硫氰酸鹽、甘草苷作為檢測指標(biāo)，建立同時(shí)測定這7 種成分含量的高效液相色譜（HPLC）法，以完善其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2487型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XSE205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；MS07-MS30型數(shù)控超聲波清洗器（深圳市德瑞超聲波設(shè)備有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

半夏（批號(hào)為200503），茯苓（批號(hào)為200321），麻黃（批號(hào)為211105），萊菔子（批號(hào)為210803），黃芪（批號(hào)為200321），甘草（批號(hào)為211121），地骨皮（批號(hào)為210726），桑白皮（批號(hào)為200218），陳皮（批號(hào)為200427），當(dāng)歸（批號(hào)為210316），苦杏仁（批號(hào)為210522），北沙參（批號(hào)為200321），川貝（批號(hào)為210917），前胡（批號(hào)為210507），紫蘇子（批號(hào)為210511），均購自甘肅康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司，并由甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部李喜香主任中藥師鑒定為正品，符合2020 年版《中國藥典（一部）》相關(guān)規(guī)定；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號(hào)為J19HB174062，純度為98%），甘草苷對照品（批號(hào)為Z07J12X136344，純度為94.5%），鹽酸麻黃堿對照品（批號(hào)為A21070585，純度為98%），阿魏酸對照品（批號(hào)為L03A9D57744，純度為99%），芥子堿硫氰酸鹽對照品（批號(hào)為O27GB165515，純度為98%），橙皮苷對照品（批號(hào)為K09S11L123847，純度為98%），苦杏仁苷對照品（批號(hào)為Z28A6L2815，純度為98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Fun Fire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.15%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min 時(shí)5%A，5～15 min 時(shí)5%A →8%A，15～30 min時(shí)8%A，30～40 min時(shí)8%A →17%A，40～65 min時(shí)17%A →20%A，65～66 min 時(shí)20%A →5%A，66～71 min 時(shí)5%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：210 nm（0～36 min，鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷），326 nm（37～41 min，芥子堿硫氰酸鹽），260 nm（42～53 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷），283 nm（54～71 min，橙皮苷）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 樣品制備

按處方量稱取黃芪、半夏、茯苓、甘草、地骨皮、桑白皮、陳皮、當(dāng)歸8 味藥材，加10 倍量水提取2 次，每次96 min，得水提取液；按處方量稱取苦杏仁、萊菔子、北沙參、川貝、前胡、麻黃、紫蘇子7 味藥材，加11 倍量66%乙醇，提取95 min，得乙醇提取液。將水提取液常壓濃縮為清膏；乙醇提取液減壓濃縮，回收乙醇至無醇味，合并水提取液清膏和乙醇提取液清膏，濃縮至相對密度為1.15～1.20 的稠膏，加入2 倍量的可溶性淀粉，制軟材，60 ℃干燥2 h，過1 號(hào)篩和5 號(hào)篩，整粒，即得益肺止嗽顆粒。按此工藝制備3 批樣品，批號(hào)分別為20220809，20220810，20220811。

2.3 溶液制備

混合對照品溶液：取7 種成分對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 分別含鹽酸麻黃堿2.37 mg、苦杏仁苷1.322 mg、芥子堿硫氰酸鹽0.548 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.316 mg、阿魏酸1.314 mg、甘草苷0.374 mg、橙皮苷1.574 mg 的對照品貯備液；精密吸取對照品貯備液適量，用甲醇定容至5 mL，即得上述成分質(zhì)量濃度分別為47.40，132.20，54.80，31.60，13.14，37.40，157.40μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：取2.2項(xiàng)下樣品顆粒適量，研細(xì)，取2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率為500 W，頻率為40 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按樣品制備工藝制得缺黃芪、麻黃、甘草、苦杏仁、當(dāng)歸、萊菔子、陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下3 種溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)峰，各成分均能達(dá)到基線分離（分離度＞1.5），且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Ephedrine hydrochloride 2.Amygdalin 3.Glucosine thiocyanate 4.Ferulic acid 5.Piroisoflavone glucoside 6.Glycyrrhizin 7.Hesperidin A.Mixed reference solution B.Test solution C-I.Negative reference solution（lacking Ephedra Herba，Armeniacae Semen Amarum，Raphani Semen，Angelicae Sinensis Radix，Astragali Radix，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，Pericarpium Citri Reticulatae，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察與檢測限、定量限確定：精密吸取2.3 項(xiàng)下對照品貯備液適量，用甲醇定容至5 mL，制成每1 mL 分別含鹽酸麻黃堿2.37，4.74，7.11，9.48，47.4μg，苦杏仁苷6.61，13.22，19.83，26.44，132.2μg，芥子堿硫氰酸鹽2.74，5.48，8.22，10.96，54.8 μg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.58，3.16，4.74，6.32，31.6μg，阿魏酸0.657，1.314，1.971，2.628，13.14 μg，甘草苷1.87，3.74，5.61，7.48，37.4 μg，橙皮苷7.87，15.74，23.16，31.48，157.4 μg 的對照品溶液，分別精密吸取10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以各成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸［1］，得各待測成分的回歸方程。分別以信噪比（S/N）為10∶1 和3∶1 時(shí)混合對照品溶液的質(zhì)量濃度為定量限和檢測限。結(jié)果見表1。

表1 7種成分的線性關(guān)系考察與檢測限、定量限確定結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LQD of seven components（n=5）

精密度試驗(yàn)：取2.3 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、芥子堿硫氰酸鹽、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷峰面積的RSD分別為2.62%，1.25%，1.72%，0.48%，2.74%，0.71%，0.57%（n= 6）；取線性關(guān)系考察項(xiàng)下各成分最高、中間、最低3 個(gè)質(zhì)量濃度的對照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定3 d，結(jié)果各質(zhì)量濃度對照品溶液日間精密度的RSD均小于3%（n=3），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20220809）樣品6份，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、芥子堿硫氰酸鹽、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷含量的RSD分別為1.16%，0.54%，1.41%，0.76%，1.13%，2.18%，0.60%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20220809）樣品適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、芥子堿硫氰酸鹽、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷峰面積的RSD分別為1.25%，0.16%，1.34%，1.79%，1.09%，1.12%，0.12%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知各成分含量的樣品9 份，每份各2 g，精密稱定，按80%，100%，120%分別加入適量混合對照品溶液，各3 份，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.5 樣品含量測定

取3批（批號(hào)分別為20220809，20220810，20220811）樣品各適量，每批各3 份，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中各成分含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of each component in samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹽酸麻黃堿具有抗炎、平喘、松弛支氣管平滑?。?-3］等作用，苦杏仁苷具有鎮(zhèn)咳平喘、抑制呼吸中樞［4-5］等作用，芥子堿硫氰酸鹽具有舒張平滑肌、平喘作用［6-7］，橙皮苷具有抗炎、抗過敏、抗氧化［8］等作用，毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫力［9-10］等作用，阿魏酸具有抗菌消炎［11］、抗病毒等作用，甘草苷具有抗氧化、抗炎［12-13］等作用。故選取這7種成分為含量測定的指標(biāo)成分。

3.2 色譜條件選擇

在檢測波長的選擇上，本研究中首先在190～400 nm波長范圍內(nèi)對7種成分進(jìn)行全波長掃描，確定其最大吸收波長，結(jié)合各成分的紫外吸收情況，最終選擇切換波長的方式，以降低雜質(zhì)對色譜峰的干擾，發(fā)現(xiàn)鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷在切換波長時(shí)會(huì)出現(xiàn)峰形變差的情況，在210 nm 波長處同時(shí)檢測時(shí)，兩者峰形較好，基線平穩(wěn)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷因出峰時(shí)間接近，在切換波長時(shí)出現(xiàn)峰形變差且阿魏酸未出峰的情況，于260 nm波長處同時(shí)檢測時(shí)，3種成分吸收良好，峰形最佳。故最終選擇鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷于210 nm 波長處同時(shí)檢測，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷于260 nm 波長處同時(shí)檢測，芥子堿硫氰酸鹽于326 nm波長處檢測，橙皮苷于283 nm 波長處檢測。在同一信號(hào)的不同時(shí)間段設(shè)置不同檢測波長，不僅能同時(shí)檢測益肺止嗽顆粒中的7 種成分，還可縮短分析時(shí)間。在流動(dòng)相的選擇上，考察了乙腈- 0.1%磷酸溶液和乙腈-0.15%磷酸溶液，最終確定以后者作為流動(dòng)相，梯度洗脫，此時(shí)各成分分離效果最好，無拖尾。

3.3 提取方法選擇

在供試品溶液制備方法上，本研究中首先考察了超聲、加熱回流提取2 種不同的處理方法［14］，結(jié)果提取含量相當(dāng)，故選擇簡單易操作的超聲提取方法［15］；提取溶劑考察了甲醇和70%甲醇，結(jié)果以70%甲醇提取時(shí)，色譜峰峰形較差；提取時(shí)間考察了15，30，45 min［16］，最終確定為甲醇超聲處理30 min，此時(shí)各成分峰形最佳，提取效率較高。

3.4 方法評價(jià)

本研究中建立的方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測定益肺止嗽顆粒中7種成分的含量。