厚樸花（厚樸）配方顆粒指紋圖譜及含量測(cè)定研究*

許豪杰，趙淑淑，俞 杰，黃 琪，俞思陽(yáng)

（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，浙江湖州 313200）

厚樸花為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils. 或凹葉厚樸Magnolia officinalisRehd. et Wils.var.bilobaRehd.et Wils. 的干燥花蕾。厚樸花為芳香化濕藥［1］，味苦，性辛、溫，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)，燥濕行氣，消積平喘，臨床主要治療濕阻、氣滯、食積導(dǎo)致的脘腹脹滿、痰飲喘咳、梅核氣等。厚樸花中主要成分有異厚樸酚、和厚樸酚、厚樸酚、四氫厚樸酚等［2-5］。厚樸花（厚樸）配方顆粒以厚樸花為原料，經(jīng)炮制、水提、濃縮、干燥等工序制備而成。目前尚無關(guān)于厚樸花（厚樸）配方顆粒質(zhì)量研究的報(bào)道。為此，本研究中對(duì)厚樸花（厚樸）配方顆粒中厚樸酚、和厚樸酚的含量測(cè)定及指紋圖譜進(jìn)行研究，為配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；SX205 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；FA2004B 型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，精度為萬分之一）；KQ-500型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

厚樸花（厚樸）配方顆粒（自制樣品，批號(hào)分別為20031151，20031152，20031153，20031154，編號(hào)為SⅠ-SⅣ）；甲醇（分析純，北京化工廠有限責(zé)任公司）；水為超純水；和厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)為110730 - 201614，含量為99.3%），厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)為110729-201714，含量為99.3%），厚樸花（厚樸）對(duì)照藥材（批號(hào)為121285 -201303），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；標(biāo)準(zhǔn)湯劑藥材信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min時(shí)10%A →90%A，5～10 min時(shí)90%A →13%A，10～22 min 時(shí)13%A →20%A，22～40 min 時(shí)20%A →30%A，40～45 min時(shí)30%A →70%A，45～50 min時(shí)70%A，50～60 min 時(shí)70%A →95%A，60～70 min 時(shí)95%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑與溶液制備

飲片標(biāo)準(zhǔn)浸膏（湯劑）：依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》，并結(jié)合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中藥煎煮方法相關(guān)操作規(guī)范及文獻(xiàn)對(duì)湯劑煎煮的要求進(jìn)行煎煮，取飲片100 g，置市售煎藥鍋中，加水煎煮2次，第1次加入飲片量12倍的水，攪拌使浸潤(rùn)，浸泡30 min，大火加熱至微沸，轉(zhuǎn)小火煮沸30 min，藥液用100目不銹鋼篩過濾；第2次加入飲片量10倍的水，大火加熱至微沸，轉(zhuǎn)小火煎煮20 min，藥液用100 目不銹鋼篩過濾；合并2 次濾液，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，50～60 ℃減壓濃縮至濃縮液體積約為1∶1的浸膏，冷凍干燥，即得。

混合對(duì)照品溶液：取厚樸酚對(duì)照品、和厚樸酚對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含厚樸酚、和厚樸酚各10μg的溶液，即得。

供試品溶液：取樣品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取輔料1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

為了對(duì)上面的假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，下面通過改變UD00值的大?。悍謩e取值為2 520 N、3 020 N、3 520 N、4 020 N，來仿真不同負(fù)載下通過活塞流量數(shù)值的大小(圖7)。

專屬性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20031152），依法制備供試品溶液；取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與厚樸酚、和厚樸酚相應(yīng)的保留時(shí)間處均無色譜峰出現(xiàn)，表明輔料對(duì)指標(biāo)成分的測(cè)定無干擾。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取專屬性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置0，3，6，9，12，18，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比對(duì)，按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）對(duì)相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果相似度均大于0.900，RSD小于2.0%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

耐用性試驗(yàn)：考察3種流速、柱溫、色譜柱對(duì)本色譜條件的耐用性。由表2 可知，不同流速、柱溫、色譜柱條件下測(cè)定結(jié)果基本一致，色譜圖中各共有峰峰形尖銳、對(duì)稱，分離度良好，相似度均不低于0.900，RSD均小于2%。供試品溶液指紋圖譜中呈現(xiàn)4 個(gè)共有峰，表明不同流速、柱溫、色譜柱的耐用性良好。

表2 指紋圖譜耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the durability test for the HPLC fingerprint

2.1.4 高效液相色譜指紋圖譜建立和共有峰指認(rèn)

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），以16批厚樸花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，以峰3（和厚樸酚）為對(duì)照峰，形成共有模式圖，并建立對(duì)照?qǐng)D譜，共標(biāo)定4 個(gè)共有峰，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～1.01%，表明不同產(chǎn)地的飲片制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有相似的成分，且所含化學(xué)成分含量無顯著差異。詳見圖1和圖2。

圖1 16批標(biāo)準(zhǔn)湯劑高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC overlay fingerprints of 16 batches of standard decoction

圖2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of standard decoction

取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，共指認(rèn)4 個(gè)共有峰，其中峰3（S）為和厚樸酚，峰4為厚樸酚。詳見圖3。

圖3 混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖3.Magnolol 4.HonokiolFig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

2.1.5 相似度評(píng)價(jià)

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），以共有峰對(duì)16批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果相似度均不低于0.900，表明標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致性良好。詳見表3。

表3 16批標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Similarity evaluation results of 16 batches of standard decoction

取4批（編號(hào)分別為SⅠ-SⅣ）樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比對(duì)，色譜圖見圖4。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與對(duì)照指紋圖譜基本一致，重復(fù)性較好，4 批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.958，0.972，0.994，0.982，均大于0.900，表明建立的指紋圖譜可用于配方顆粒的質(zhì)量分析。

圖4 4批配方顆粒高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.4 HPLC overlay fingerprints of four batches of formula granules

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液（50∶20∶30，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果輔料對(duì)含量的測(cè)定無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：取厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品各適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.756，4.39，8.78，21.95，43.90 μg/ mL 的系列厚樸酚對(duì)照品溶液及2.43，6.084 6，12.169 2，30.423 0，60.846 1μg/mL的系列和厚樸酚對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為Y和=15.261X和+ 0.192 5（R2 = 1.000 0，n= 5），Y厚=14.846X厚+0.796 8（R2=1.000 0，n=5）。結(jié)果表明，厚樸酚、和厚樸酚質(zhì)量濃度分別在1.756 ～43.90 μg/ mL、2.43～60.846 1μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（和厚樸酚質(zhì)量濃度為12.169 2μg/mL、厚樸酚質(zhì)量濃度為8.78μg/mL），按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD為0.19%和0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20031152）樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚總平均含量為0.437 7 mg/g，RSD為0.11%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后放置0，3，6，9，12，18，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚總平均含量為1.018 9 mg/g，RSD為0.26%（n= 7），表明供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20031152，總含量為1.020 4 mg/g）0.5 g，精密稱定，共6份，分別加入混合對(duì)照品溶液適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

耐用性試驗(yàn)：考察不同色譜柱、不同柱溫、不同流速對(duì)本色譜條件的耐用性，結(jié)果見表5。

表5 含量測(cè)定耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the durability test for the content determination

2.2.3 樣品含量測(cè)定

取4批（批號(hào)分別為20031151，20031152，20031153，20031154）樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算厚樸酚、和厚樸酚的總含量。結(jié)果4 批樣品中厚樸酚、和厚樸酚總含量分別為1.44，1.02，0.86，1.17 mg/g。

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)成分選擇及樣品處理方法優(yōu)化

厚樸酚與和厚樸酚是中藥厚樸花的主要有效成分，且藥材中含量較高，是評(píng)價(jià)厚樸花藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)［6-9］。參照2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中厚樸花的檢測(cè)指標(biāo)，選取厚樸酚、和厚樸酚作為檢測(cè)指標(biāo)。其他色譜條件不變的情況下，在供試品溶液的制備中，分別以甲醇、50%甲醇、乙醇為溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果以甲醇為溶劑時(shí)測(cè)得的含量最高。比較了超聲和回流2 種提取方式，結(jié)果采用超聲提取時(shí)測(cè)定的含量最高。

3.2 指紋圖譜條件的選擇［10-15］

流動(dòng)相系統(tǒng)考察乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈- 0.1%甲酸水溶液、甲醇- 0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前3 個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)條件下，各峰保留時(shí)間明顯推后，延長(zhǎng)了分析時(shí)間，且分離度較差；后2 個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)各峰保留時(shí)間接近，均能較好分離，但乙腈- 0.5%醋酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)各峰對(duì)稱性更好、更尖銳，有利于指紋圖譜的分析，故選擇乙腈-0.5%醋酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)。本研究中采用二極管陣列（DAD）檢測(cè)器進(jìn)行紫外區(qū)全波長(zhǎng)掃描，波長(zhǎng)段為210～400 nm，各峰均于294 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且色譜峰信息較完全，峰高較高，綜合比較后選擇294 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中通過理化分析，運(yùn)用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室方法測(cè)定厚樸花（厚樸）配方顆粒的含量并建立其指紋圖譜，定量分析厚樸花（厚樸）中指標(biāo)性成分的含量，通過16批標(biāo)準(zhǔn)湯劑擬合出對(duì)照指紋圖譜，并與市售4批樣品比較，指認(rèn)了4個(gè)共有峰，且相似度均大于0.900。所建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，結(jié)合所建立的指紋圖譜，可為厚樸花（厚樸）配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。