超高效液相色譜指紋圖譜法和一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地西紅花質(zhì)量*

張夢(mèng)奇，王瓊芬，李 彬，劉 婷，張紅萍，石 婧，徐 虹，鄭國(guó)平

（浙江省舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江舟山 316000）

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativusL. 的干燥柱頭，原產(chǎn)于地中海、歐洲南部地區(qū)和伊朗，現(xiàn)我國(guó)多個(gè)省份均有栽培。西紅花不僅是世界著名的天然香料和食用染料，也是名貴的中藥材，收載于2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效［1-2］。其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為類(lèi)胡蘿卜素及其糖苷類(lèi)衍生物，包括西紅花苷類(lèi)（西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ和西紅花苷- Ⅳ）、苦番紅花素、西紅花酸和西紅花醛［3-4］。有關(guān)西紅花的研究主要集中于指標(biāo)成分定量測(cè)定［5］，也有用于質(zhì)量評(píng)價(jià)的指紋圖譜研究［6-7］，但尚未見(jiàn)結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別用于產(chǎn)地區(qū)分的相關(guān)報(bào)道。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析可有效表征和評(píng)價(jià)中藥的內(nèi)在和整體質(zhì)量，并解釋藥材復(fù)雜成分的隱藏規(guī)律，客觀(guān)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地間的品質(zhì)差異［8］。西紅花相關(guān)對(duì)照品主要提取于西紅花藥材［9］，檢測(cè)成本高。一測(cè)多評(píng)（QAMS）是適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式，在中藥多指標(biāo)成分的含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛［10］，可大幅降低檢測(cè)成本。故本研究中建立了西紅花的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，采用相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析和正交偏最小二乘法- 判別分析（OPLS-DA）對(duì)市售西紅花藥材的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；并建立了以西紅花苷- Ⅰ作為內(nèi)參物，測(cè)定苦番紅花素及4 種西紅花苷類(lèi)成分的QAMS 法，旨在為不同產(chǎn)地西紅花藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Waters Arc 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Shimadzu LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；XSE205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為0.01 mg）；KQ-300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為45 kHz）；Milli - Q 型超純水儀（美國(guó)Milipore公司）。

1.2 試藥

苦番紅花素對(duì)照品（批號(hào)為112056-202102，含量為97.3%），西紅花苷- Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)為111588 -201704，含量為88.4%），西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)為111589-201705，含量為92.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；西紅花苷-Ⅲ對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為wkq-21081003，含量為99.75%）；西紅花苷-Ⅳ對(duì)照品（成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為DST201110-181，含量為98.07%）；甲醇、乙腈（色譜純，J. T. Baker 公司）；水為Milli-Q自制水，其他試劑均為分析純；30批西紅花藥材樣品均購(gòu)自浙江省內(nèi)藥品批發(fā)、零售企業(yè)，經(jīng)浙江省舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院鄭國(guó)平主任中藥師鑒定為正品，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 30批西紅花藥材樣品信息Tab.1 Information of 30 batches of Croci Stigma

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～6 min 時(shí)15%A →30%A，6～12 min 時(shí)30%A，12～14 min 時(shí)30%A →35%A，14～16 min 時(shí)35%A →50%A，16～20 min 時(shí)50%A →60%A，20～25 min 時(shí)60%A）；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（0～8 min，苦番紅花素），440 nm（8～25 min，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ和西紅花苷- Ⅳ）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：4μL。

2.2 溶液制備

分別取苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ和西紅花苷- Ⅳ對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加稀乙醇制成質(zhì)量濃度分別為18.27，28.85，9.95，2.96，1.18 μg/ mL 的混合對(duì)照品溶液。取西紅花藥材細(xì)粉10 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL 棕色容量瓶中，加稀乙醇適量，置冰浴中超聲處理20 min，放至室溫，加稀乙醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 UPLC 指紋圖譜建立與分析

2.3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，以峰4 為參照峰，分別計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果的RSD分別為0.19%～1.94%和0.06%～0.24%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S16），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，12 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰4 為參照峰，分別計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果的RSD分別為0.21%～1.84%和0.03%～0.37%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S16），取穩(wěn)定性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰4為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果的RSD分別為0.17%～2.23%和0.04%～0.95%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.2 指紋圖譜生成與相似度評(píng)價(jià)

取30批（編號(hào)為S1-S30）西紅花藥材各適量，精密稱(chēng)定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，將S1 樣品的圖譜作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗為0.1 min，采用中位數(shù)法，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（R），共標(biāo)識(shí)11 個(gè)共有峰，詳見(jiàn)圖1。通過(guò)與混合對(duì)照品溶液色譜圖進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)出5 個(gè)共有峰，其中，峰1 為苦番紅花素，峰4為西紅花苷-Ⅰ（參照峰S），峰6為西紅花苷-Ⅱ，峰7為西紅花苷-Ⅳ，峰10為西紅花苷-Ⅲ，詳見(jiàn)圖2。30 批樣品指紋圖譜相似度為0.983～0.999，詳見(jiàn)表2。所有樣品相似度均大于0.98，表明不同產(chǎn)地、不同批次西紅花藥材所含成分基本一致，藥材整體質(zhì)量較穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜可用于西紅花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

目前，三方共同創(chuàng)新研制了名為“智寶”的移動(dòng)式病蟲(chóng)害智能化感知設(shè)備，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外移動(dòng)式病蟲(chóng)害智能測(cè)報(bào)技術(shù)與產(chǎn)品的空白。該設(shè)備集成了包括視覺(jué)、溫濕度傳感器、地理位置、移動(dòng)終端等多種信息獲取手段，有效提升了現(xiàn)有病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)能力。

圖1 30批西紅花藥材超高效液相色譜疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜Fig.1 UPLC overlay fingerprints of 30 batches of Croci Stigma and the reference fingerprint

圖2 超高效液相色譜圖1.Picrocrocin 4.Crocin I 6.Crocin Ⅱ 7.Crocin Ⅳ 10.Crocin ⅢA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.2 UPLC chromatograms

表2 30批西紅花藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2 Results of the similarity evaluation of fingerprints of 30 batches of Croci Stigma

2.4 聚類(lèi)分析

以30 批西紅花藥材的11 個(gè)共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用組間聯(lián)接，以平方歐氏距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，并繪制譜系圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)歐氏距離為20 時(shí)，30 批西紅花藥材樣品可聚為兩大類(lèi)，其中，編號(hào)為S1，S2，S3（產(chǎn)地伊朗）的樣品聚為一類(lèi)，剩余批次聚為二類(lèi)（國(guó)產(chǎn)）。當(dāng)歐氏距離為5 時(shí)，30 批西紅花藥材樣品可聚為4 類(lèi)。其中，一類(lèi)為編號(hào)為S1-S3（產(chǎn)地伊朗）的樣品；二類(lèi)為編號(hào)為S4-S6（產(chǎn)地西藏），S8，S10，S12，S13（產(chǎn)地浙江），S22（產(chǎn)地江蘇）的樣品；三類(lèi)為編號(hào)為S25-S30（產(chǎn)地安徽）的樣品；其余批次為四類(lèi)（產(chǎn)地浙江、江蘇）。由聚類(lèi)分析結(jié)果可知，產(chǎn)地為伊朗的西紅花與產(chǎn)地為我國(guó)的差異明顯，而我國(guó)不同產(chǎn)地之間也存在一定差異，但產(chǎn)地為浙江、西藏、江蘇的藥材質(zhì)量較相似，可用聚類(lèi)分析法對(duì)藥材樣品進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。

圖3 30批西紅花藥材的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.3 Cluster analysis diagram of 30 batches of Croci Stigma

2.5 OPLS-DA

將30 批西紅花藥材的11 個(gè)共有峰的峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA 分析，獲得相應(yīng)模型，得分圖見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，30批西紅花藥材樣品聚為4 類(lèi)，編號(hào)為S1-S3 的樣品聚為一類(lèi)（產(chǎn)地伊朗）、編號(hào)為S4-S6的樣品聚為二類(lèi)（產(chǎn)地西藏）、編號(hào)為S25-S30的樣品聚為三類(lèi)（產(chǎn)地安徽）編號(hào)為S7-S24的樣品聚為四類(lèi)（產(chǎn)地浙江、江蘇），各組樣品聚類(lèi)良好、分離明顯。模型的自變量模型參數(shù)R2X（cum）為0.809（＞0.5），因變量模型參數(shù)R2Y（cum）為0.800（＞0.5），表明模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)力較好；累積預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2（cum）為0.751 ＞0.5），且R2Y（cum）-Q2（cum）= 0.049 ＜0.3。表明預(yù)測(cè)模型具有較好的準(zhǔn)確性和可靠性［11］。

圖4 30批西紅花藥材的OPLS-DA模型得分圖Fig.4 OPLS-DA scores diagram of 30 batches of Croci Stigma

為進(jìn)一步檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行曰驑颖鹃g是否存在差異，利用SIMCA 14.1 軟件對(duì)已建立的OPLS - DA 模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，設(shè)置迭代次數(shù)為200 次，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢?jiàn)，代表模型解釋能力R2為（0，0.064 5），模型預(yù)測(cè)能力Q2為（0，-0.38），均小于原始值，表明所建模型未過(guò)擬合［12］，可用于有效區(qū)分不同產(chǎn)地的西紅花藥材。

圖5 OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖Fig.5 OPLS-DA model permutation test diagram

變量重要性投影（VIP）值可衡量各共有峰的表達(dá)模式對(duì)樣本分類(lèi)判別的影響強(qiáng)度和解釋能力［13］，且當(dāng)VIP ＞1.0 時(shí)，表示該變量對(duì)于所建模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平［14］。以此為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出5 種貢獻(xiàn)較大的成分，依次為峰8、峰9、峰11、峰10（西紅花苷-Ⅲ）、峰2。詳見(jiàn)圖6。

圖6 共有峰峰面積的VIP圖Fig.6 VIP plot of the common peak area

2.6 含量測(cè)定方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL，分別置10 mL棕色容量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果見(jiàn)表3，表明各成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

表3 5種成分的線(xiàn)性關(guān)系考察與檢測(cè)限、定量限確定結(jié)果Tab.3 Results of the linear relation test，LOD and LOQ of five components

檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）確定：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用稀乙醇逐級(jí)稀釋?zhuān)?.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各儀器信噪比（S/N）為10∶1時(shí)的待測(cè)成分質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OQ，以S/N為3∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OD。結(jié)果見(jiàn)表3。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ峰面積的RSD分別為0.17%，0.22%，0.30%，0.51%，0.43%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取西紅花藥材（編號(hào)為S16）細(xì)粉適量，精密稱(chēng)定，共6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的RSD分別為0.55%，0.18%，0.15%，0.73%，1.09%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，8，10，12 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ含量的RSD分別為1.12%，1.59%，1.63%，1.71%，1.92%（n= 6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取西紅花藥材（編號(hào)為S16）細(xì)粉10 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL 棕色容量瓶中，共6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為112.64，99.81，33.24，8.93，3.82 μg/ mL 的混合對(duì)照品溶液，精密量取混合對(duì)照品溶液8，10，12 mL，分別加入相應(yīng)供試品溶液中，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品加標(biāo)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的平均加樣回收率分別為100.47%，99.79%，99.87%，100.27%，99.73%，RSD分別為0.94%，0.89%，1.18%，1.23%，1.74%（n= 6），表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 QAMS 建立

相對(duì)校正因子（RCF，fs/i）計(jì)算：在中藥材多成分指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以該藥材中某一代表成分為內(nèi)參物，通過(guò)建立該內(nèi)參物與其他待測(cè)成分的fs/i計(jì)算其他待測(cè)組分的含量［15］，實(shí)現(xiàn)中藥材多成分同步測(cè)定。本研究中采用多點(diǎn)校正法，取線(xiàn)性關(guān)系考察項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以西紅花苷- Ⅰ作為內(nèi)參物，按公式fs/i=（As×Mi）/（Ai×Ms）計(jì)算苦番紅花素、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的fs/i及RSD。其中，As和Ai分別為內(nèi)參物和待測(cè)成分的峰面積，Ms和Mi分別為內(nèi)參物和待測(cè)成分對(duì)照品的質(zhì)量濃度。結(jié)果fs/i分別為3.577，0.844，1.251，1.781，RSD分別為0.88%，0.82%，1.39%，1.98%（n=6）。

耐用性試驗(yàn)：分別考察不同色譜柱［（Waters Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm），月旭Ultimate UHPLC C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm），Agilent Poroshell 120 SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9μm）］，不同品牌色譜儀（Agilent 1260型、Waters Arc型、Shimadzu LC-30A 型），不同流速（0.25，0.30，0.35 mL/min），不同柱溫（25，30，35 ℃）對(duì)各成分fs/i的影響。結(jié)果fs/i的RSD均低于2.0%，表明不同色譜條件對(duì)苦番紅花素、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷- Ⅳ的fs/i均無(wú)顯著影響。

待測(cè)成分色譜峰定位：分別考察了苦番紅花素、西紅花-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ與西紅花苷-Ⅰ間的相對(duì)保留時(shí)間（Ri/s=ti/ts）和保留時(shí)間差（ti-ts）在不同色譜儀和色譜柱中的重復(fù)性。結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間的波動(dòng)較小，其重復(fù)性明顯優(yōu)于保留時(shí)間差，故本研究中選擇相對(duì)保留時(shí)間作為待測(cè)成分色譜峰定位依據(jù)。

樣品含量測(cè)定：取30批（編號(hào)為S1-S30）樣品各適量，精密稱(chēng)定，分別制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法（ESM）測(cè)定苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ的含量；同時(shí)采用QAMS 法以西紅花苷-Ⅰ為內(nèi)參物，計(jì)算苦番紅花素、西紅花-Ⅱ、西紅花苷-Ⅲ和西紅花苷-Ⅳ的含量，并與ESM 法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，各成分QAMS法計(jì)算值和外標(biāo)實(shí)測(cè)值間無(wú)顯著差異，相對(duì)偏差（RD）低于2.0%。同時(shí)，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)2種方法所測(cè)得含量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，2種方法無(wú)顯著差異（P＞0.05）。以上述5種成分的總量計(jì)，浙江、伊朗產(chǎn)藥材含量較高，安徽產(chǎn)藥材含量最低。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》收載的西紅花藥材含量測(cè)定方法采用高效液相色譜（HPLC）法，梯度洗脫時(shí)間約為60 min，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。本研究中采用UPLC 法，將檢測(cè)時(shí)間縮短至25 min 內(nèi)，有效提高了檢測(cè)效率，還減少了有機(jī)溶劑的使用量。同時(shí)，采用梯度洗脫，在保留時(shí)間為15～25 min 處獲得多個(gè)分離良好的其他西紅花苷成分（西紅花苷-Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ等），但上述成分在常規(guī)HPLC 法檢測(cè)中難以獲得良好分離。通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器于190～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，苦番紅花素于254 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，而其他西紅花苷類(lèi)成分于440 nm 波長(zhǎng)處響應(yīng)較強(qiáng)，故采用波長(zhǎng)切換法，以保證檢測(cè)靈敏度。優(yōu)化色譜條件后，各成分間分離良好，可滿(mǎn)足西紅花藥材指紋圖譜及QAMS法分析的要求。

3.2 指紋圖譜建立、聚類(lèi)分析與OPLS-DA

本研究中建立了西紅花藥材的UPLC 指紋圖譜，共檢出11個(gè)共有峰。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，30批西紅花藥材相似度為0.983～0.999，表明不同產(chǎn)地西紅花藥材的化學(xué)成分種類(lèi)差異小。聚類(lèi)分析和OPLS-DA結(jié)果均將30 批西紅花藥材分為4 類(lèi)，聚類(lèi)分析可實(shí)現(xiàn)伊朗、安徽和其他產(chǎn)地西紅花的有效區(qū)分，而OPLS-DA模型可實(shí)現(xiàn)伊朗、西藏、安徽產(chǎn)地西紅花的有效區(qū)分，但仍無(wú)法有效區(qū)分浙江和江蘇2個(gè)產(chǎn)地的西紅花藥材，兩者質(zhì)量高度相近。通過(guò)VIP 預(yù)測(cè)值排序篩選出5 個(gè)貢獻(xiàn)度較大的成分，分別為峰8、峰9、峰11、峰10（西紅花苷-Ⅲ）、峰2，可作為西紅花產(chǎn)地區(qū)分的標(biāo)志物。

3.3 QAMS 法測(cè)定結(jié)果分析

QAMS 法可有效解決對(duì)照品不易獲得、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴、溶液制備煩瑣等含量測(cè)定不利因素。本研究發(fā)現(xiàn)，西紅花藥材中西紅花苷-Ⅰ含量較高、化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定且價(jià)格低，故選用西紅花苷- Ⅰ作為內(nèi)參物。方法學(xué)驗(yàn)證、方法耐用性考察，結(jié)果顯示，西紅花苷- Ⅰ對(duì)苦番紅花素、西紅花苷- Ⅱ、西紅花苷- Ⅲ、西紅花苷-Ⅳ的fs/i有較好的重復(fù)性，同時(shí)QAMS法計(jì)算含量與ESM 法實(shí)測(cè)含量無(wú)顯著差異（RD＜2.0%），建立的QAMS法適用于西紅花中多指標(biāo)成分的含量測(cè)定。含量測(cè)定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地、不同批次西紅花苦番紅花素和西紅花苷類(lèi)成分總含量差異較大。其中，產(chǎn)地為伊朗和浙江的西紅花各成分總含量較高，產(chǎn)地為安徽的西紅花藥材含量較低，且含量較低樣品普遍為生產(chǎn)日期均早、包裝材料密封性差的樣品。因此，西紅花內(nèi)在品質(zhì)除與其藥材產(chǎn)地相關(guān)外，還與儲(chǔ)存時(shí)間、儲(chǔ)存方式相關(guān)。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的UPLC 指紋圖譜結(jié)合QAMS 法準(zhǔn)確、可靠、便捷，且檢測(cè)成本低，可用于西紅花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及產(chǎn)地區(qū)分。