鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法研究

江 燕，張先華，徐興利，王祖煥，葉世春

（重慶健能醫(yī)藥開(kāi)發(fā)有限公司，重慶 401121）

糜爛性胃炎和消化性潰瘍與膽汁反流及胃液中膽汁酸濃度有關(guān)［1］，膽汁中的膽酸可溶解胃液中的黏液（黏液有保護(hù)胃黏膜作用）和破壞黏膜表層細(xì)胞，從而破壞胃黏膜的屏障作用。膽汁酸包括游離型和結(jié)合型兩類(lèi)，結(jié)合型膽汁酸是膽汁反流中對(duì)胃黏膜造成損害的主要物質(zhì)。鋁碳酸鎂是一種具有層狀網(wǎng)絡(luò)晶格的藥物，能阻斷損傷因子，有效保護(hù)胃黏膜［2-3］。有研究報(bào)道，鋁碳酸鎂等抗酸劑對(duì)膽汁酸具有較強(qiáng)的吸附能力，能有效清除反流入胃的膽汁酸［4-5］。分析膽汁酸常用的方法有薄層色譜法［6-7］、氣相色譜法［8］和高效液相色譜（HPLC）法［9-10］。本研究中建立了膽汁酸的體外吸附方法及含量測(cè)定的HPLC 法，對(duì)鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附各膽汁酸的能力進(jìn)行了考察，為臨床合理用藥提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；MS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；PHS - 3C pH 計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）；TDL - 80 - 2B 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）；HH-ZK4型水浴鍋（鞏義市予華儀器公司）。

1.2 試藥

?；悄懰徕c對(duì)照品（Sinco 公司，批號(hào)為19 - 03 -0110，含量為95.25%）；甘氨膽酸鈉對(duì)照品（批號(hào)為1-CYJ- 39 - 1，含量為98%），?；蛆Z脫氧膽酸鈉對(duì)照品（批號(hào)為9-MMS- 9-1，含量為97%），?；敲撗跄懰徕c對(duì)照品（批號(hào)為1-NYL-90-1，含量為95%），甘氨鵝脫氧膽酸鈉對(duì)照品（批號(hào)為5 - YFD - 138 - 1，含量為95%），均購(gòu)于TRC 公司；鋁碳酸鎂咀嚼片（四川健能制藥有限公司，批號(hào)分別為20200801，20201001，20201002，20201003，規(guī)格為每片0.5 g）；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外吸附膽汁酸

參考文獻(xiàn)［4-5］并結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇鋁碳酸鎂咀嚼片細(xì)粉為吸附形態(tài)，以0.1 mol/L 的鹽酸溶液（pH 1.0）為介質(zhì)。取濃度為0.5 mmol/L（質(zhì)量濃度為0.25 mg/ mL）膽汁酸鹽溶液5 mL，加入鋁碳酸鎂咀嚼片細(xì)粉中，于（37±5）℃水浴中孵育1 h，離心分離。

按公式計(jì)算鋁碳酸鎂咀嚼片對(duì)5 種膽汁酸的吸附率，吸附率(%) =(1-A樣品/A對(duì)照)× 100%。其中，A樣品為供試品溶液峰面積，A對(duì)照為對(duì)照品溶液峰面積。

2.2 膽汁酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（40∶40∶50，V/V/V，用磷酸調(diào)pH 至3.0）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果系統(tǒng)適用性溶液中，各膽汁酸鹽對(duì)照品色譜峰的理論板數(shù)不大于2 000，拖尾因子不大于2.0，分離度不低于1.5。詳見(jiàn)圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Sodium taurocholate 2.Sodium glycocholate hydrate 3.Sodium taurochenodeoxycholate 4.Sodium taurodeoxycholate hydrate 5.Sodium glycochenodeoxycholateFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

2.2.2 溶液制備

系統(tǒng)適用性溶液：分別取甘氨膽酸鈉對(duì)照品、?；悄懰徕c對(duì)照品、甘氨鵝脫氧膽酸鈉對(duì)照品、牛磺鵝脫氧膽酸鈉對(duì)照品、牛磺脫氧膽酸鈉對(duì)照品各25 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶解并定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品貯備液：取5 種膽汁酸對(duì)照品各25 mg，精密稱(chēng)定，分別置100 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 鹽酸溶液制成濃度為0.5 mmol/L（質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL）的對(duì)照品貯備液。

對(duì)照品溶液：取上述對(duì)照品貯備液各5 mL，分別置離心管中，于（37 ± 0.5）℃水浴中孵育1 h，每隔10 min振搖混勻，離心（轉(zhuǎn)速為2 000 r/ min）15 min，取上清液，即得。

供試品溶液：取鋁碳酸鎂咀嚼片細(xì)粉適量（相當(dāng)于鋁碳酸鎂25 mg），精密稱(chēng)定，分別置離心管中，加入上述對(duì)照品貯備液各5 mL，于（37±0. 5）℃水浴中孵育1 h，每隔10 min 振搖混勻，離心（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min）15 min，取上清液，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

定量限確定：取2.2.2項(xiàng)下單個(gè)對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)孕旁氡龋⊿/N）為10∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限濃度，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、牛磺鵝脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、甘氨鵝脫氧膽酸鈉的定量限分別為1.257，1.252，2.452，2.396，2.395μg/mL。采用定量限濃度的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，結(jié)果5 種膽汁酸保留時(shí)間的RSD分別為0.16%，0.10%，0.14%，0.11%，0.21%（n= 6）；峰面積的RSD分別為2.52%，5.14%，4.55%，6.18%，8.04%（n=6）。結(jié)果均低于10.0%，符合要求。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，分別稀釋成濃度為定量限濃度，以及0.05，0.10，0.125，0.15，0.20 mg/ mL 的系列溶液，取系列溶液及對(duì)照品貯備液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以溶液質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test

重復(fù)性試驗(yàn)：按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，平行6 份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件由同一試驗(yàn)人員進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鋁碳酸鎂咀嚼片對(duì)5種膽汁酸的吸附率為35.59%～97.25%，RSD為0.28%～3.83%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗(yàn)：按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液，由另一試驗(yàn)人員在不同日期平行配備6份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定；同時(shí)，取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下6次試驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果2位試驗(yàn)人員測(cè)定的12份供試品溶液中，鋁碳酸鎂咀嚼片對(duì)5 種膽汁酸的吸附率為35.59%～97.88%，RSD為0.41%～2.26%（n= 12），表明中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，分別于室溫下放置0，6，12，18，24，30，36，48，60，72 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果各膽汁酸峰面積的RSD為0.18%～1.80%（n= 10），保留時(shí)間的RSD為0.20%～0.80%（n= 10），表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

回收試驗(yàn)：取各膽汁酸對(duì)照品貯備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.20，0.125，0.05 mg/ mL 溶液，作為高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備質(zhì)控樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定3 次，并計(jì)算方法的絕對(duì)回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，表明吸附過(guò)程對(duì)膽汁酸濃度測(cè)定無(wú)干擾，HPLC 法的準(zhǔn)確性符合測(cè)定要求。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.3 樣品中膽汁酸吸附率測(cè)定

取樣品（批號(hào)分別為20200801，20201001，20201002，20201003），依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算鋁碳酸鎂咀嚼片對(duì)膽汁酸的吸附率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4批樣品中膽汁酸吸附率測(cè)定結(jié)果（%）Tab.3 Results of adsorption rate of bile acid in the four batches of samples（%）

3 討論

以膽汁酸為主的十二指腸內(nèi)容物從胃幽門(mén)反流入胃，損傷胃黏膜并引起相關(guān)疾病，膽汁酸反流與腸上皮化生及不典型增生的發(fā)生密切相關(guān)［11］。鋁碳酸鎂能吸附和結(jié)合膽汁酸，從而減弱黏膜損傷因子的攻擊，改善局部黏膜的血流量，通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值改變黏膜表面的酸堿環(huán)境等參與黏膜的保護(hù)作用。鋁碳酸鎂在臨床上用于保護(hù)膽汁酸引起的胃黏膜損傷和治療膽汁反流性胃炎［12-13］。

目前，尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)收載鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法。本研究中，鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的方法是根據(jù)鋁碳酸鎂獨(dú)特的層狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其組成（氫氧化鋁、氫氧化鎂及碳酸鹽）進(jìn)行設(shè)計(jì)。通過(guò)模擬胃部pH值及患者的胃酸量，以及鋁碳酸鎂咀嚼片的用法用量對(duì)膽汁酸的吸附能力，確定介質(zhì)為0.1 mol/L的鹽酸溶液，鋁碳酸鎂咀嚼片的吸附形態(tài)為細(xì)粉，膽汁酸鹽溶液的濃度為0.5 mmol/L（質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL），吸附時(shí)加入膽汁酸鹽溶液5 mL，于（37 ± 0.5）℃水浴孵育1 h，吸附完成后離心分離（轉(zhuǎn)速為2 000 r / min）15 min。通過(guò)改變孵育時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間、孵育過(guò)程中間隔振搖時(shí)間等試驗(yàn)吸附方法進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果表明，在孵育時(shí)間變化± 10 min、離心轉(zhuǎn)速變化±500 r/min、離心時(shí)間變化±2 min和振搖間隔時(shí)間變化± 10 min 時(shí)，5 種結(jié)合型膽汁酸吸附率的RSD為0.96%～3.95%，耐用性良好。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中尚未收載膽汁酸的檢測(cè)方法，參考文獻(xiàn)［14 - 16］，本研究中采用HPLC 法對(duì)膽汁酸進(jìn)行分析，但各膽汁酸的峰形及分離度均較差。優(yōu)化了流動(dòng)相的組成，選擇甲醇、乙腈和緩沖鹽流動(dòng)相體系，并對(duì)流動(dòng)相的pH 值和緩沖鹽的濃度，以及對(duì)不同的色譜柱進(jìn)行篩選，各膽汁酸分離更好；通過(guò)改變柱溫、流速、流動(dòng)相pH 值、緩沖鹽濃度等試驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果表明，柱溫變化±5 ℃、流速變化±0.1 mL/min、流動(dòng)相中有機(jī)相比例變化±3%、流動(dòng)相pH值變化±0.2、流動(dòng)相中磷酸鹽濃度變化±0.005 mol/L 時(shí)，5 種結(jié)合型膽汁酸吸附率的RSD為0.46%～3.11%，色譜條件耐用性好。

綜上所述，所建立的鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸方法及膽汁酸含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、有效、靈敏、快速，可用于鋁碳酸鎂咀嚼片體外吸附膽汁酸的檢測(cè)。