Hedgehog信號通路調(diào)控骨形成探討中藥防治骨質(zhì)疏松癥的研究進展

馬成祥 曹林忠,2* 魏晶晶 萬超超 楊博

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州730000

2 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州730099

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨密度減低、骨微結(jié)構(gòu)破壞和脆性骨折為特征的全身性骨代謝疾病,是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。隨著全球老齡人口的增加,骨質(zhì)疏松癥病例的數(shù)量每年都在上升,80歲以上人群中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率為70 %,在50歲以上人群中為15 %[3]。因此,尋找一種更安全有效的治療骨質(zhì)疏松癥的方法具有重要的社會意義。骨質(zhì)疏松癥的具體發(fā)病機制尚不清楚,普遍認(rèn)為是由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived stroma cells,BMSCs)成骨成脂分化失衡,破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞活性改變,導(dǎo)致骨形成和骨吸收失衡[4-5]。

Hedgehog (Hh)基因最早于1980年在果蠅中發(fā)現(xiàn),并因其突變使果蠅幼蟲形成刺猬樣形態(tài)而被命名為Hh,最近在脊椎動物中也得到證實[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),Hh信號通路可以通過調(diào)控BMSCs成骨分化,進而影響骨形成,對維持骨穩(wěn)態(tài)亦發(fā)揮重要作用。因此,本文探討了Hh信號通路在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中的作用機制,以期為防治骨質(zhì)疏松癥提供新的思路與方向。

1 Hedgehog信號通路

Hh信號通路是一種高度保守的通路,參與無脊椎動物和脊椎動物的胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和干細(xì)胞維持[7]。其主要包括Hh配體、patched受體(Ptch)、smoothened受體(Smo)、融合抑制因子(Sufu)和轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因(Gli)4個核心部。在脊椎動物中,存在三個Hh基因家族成員,包括sonic Hh (Shh)、Indian Hh (Ihh)和desert Hh (Dhh)[8],分別編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。Shh、Ihh和Dhh統(tǒng)稱為Hh信號通路配體。Ptch是Hh配體的12個跨膜受體,包括兩個同源基因Ptch1和Ptch2,在脊椎動物中Ptch1對Hh信號通路起負(fù)調(diào)控調(diào)節(jié)。Smo是一種跨膜蛋白,具有信號傳感器的功能。脊椎動物一般含有Gli1、Gli2和Gli3三種Glis蛋白,它們都是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。通常,Gli1和Gli2主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子,而Gli3作為Hh信號傳導(dǎo)的抑制因子,Sufu是Hh通路的負(fù)調(diào)控因子。

Hh通路通常是由Hh蛋白與其受體Ptch結(jié)合而觸發(fā)的。在沒有Hh配體的情況下,Ptch通常位于初級纖毛周圍并抑制Smo的活性,當(dāng)Hh配體存在時,Hh蛋白與靶細(xì)胞上的Ptch結(jié)合,Ptch從初級纖毛中退出,這一作用解除了Ptch對Smo的抑制作用,導(dǎo)致Smo被激活,從而激活Hh信號,轉(zhuǎn)錄因子Gli1活化進入細(xì)胞核,調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[9](圖1)。此外,某些共受體如生長阻滯特異性(Gas),已被證明與Hh配體相互作用以激活Hh信號,而Hh相互作用蛋白(HHIP)是一種可以結(jié)合所有Hh配體的膜糖蛋白,通過阻止Hh配體與Ptch的相互作用負(fù)調(diào)控Hh信號,最終減弱Hh信號[10]。

圖1 Hedgehog信號通路調(diào)控機制

2 Hh信號通路在骨質(zhì)疏松癥中的調(diào)控作用

骨質(zhì)疏松癥的具體發(fā)病機制尚不清楚,目前普遍認(rèn)為是由于BMSCs成骨成脂分化失衡導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失調(diào)。多項研究表明,Hh信號通路在骨形成和骨修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[11-13],Hh信號的失調(diào)與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2.1 Hh信號通路對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病,表現(xiàn)為骨形成和骨吸收失衡,導(dǎo)致骨量和微結(jié)構(gòu)不斷破壞。成骨分化受損的BMSCs可導(dǎo)致成骨障礙,骨形成減少,甚至發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。已有研究發(fā)現(xiàn),Hh信號通路在調(diào)控BMSCs成骨細(xì)胞分化過程中具有重要作用。音猬因子(Shh)蛋白作為Hh信號中研究最早及在胚胎發(fā)育過程中最重要的蛋白,能夠調(diào)節(jié)組織及細(xì)胞中的BMSCs向成骨細(xì)胞增殖與分化。研究發(fā)現(xiàn),重組N-末端Shh (ShhN)在體外促進大鼠BMSCs的增殖和成骨分化[13]。Beloti等[14]探討Hh信號通路激動劑purmorphamine(嘌嗎啡胺)對BMSCs成骨細(xì)胞分化的影響,發(fā)現(xiàn)其能夠上調(diào)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中標(biāo)志物的表達(dá),增強ALP的活性。Ma X等[15]在探討地塞米松體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs成骨分化過程中Hh信號分子表達(dá),發(fā)現(xiàn)在BMSCs的成骨細(xì)胞分化過程中,地塞米松可以通過Hh信號通路增強Shh的表達(dá)。Huang C等[16]研究發(fā)現(xiàn),在免疫缺陷小鼠4 mm同種異體骨移植模型中,過表達(dá)ShhN的BMSCs的植入通過改善供體細(xì)胞的存活和分化,以及骨缺損部位的支架血運重建,顯著促進了骨缺損重建,加速了體內(nèi)骨形成。考慮到Shh和Nel-like1蛋白(Nell-1)均具有骨誘導(dǎo)潛能,有研究建立了ShhN與Nell-1聯(lián)合治療的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨使用任一細(xì)胞因子相比,這種特殊的組合策略顯著促進脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(HASCs)的成骨分化,使用Smo拮抗劑(cyclopamine)抑制Hh信號通路,發(fā)現(xiàn)Nell-1單獨發(fā)揮的促成骨功能可以被消除[17]?？梢?這種特殊的細(xì)胞因子組合策略可能對骨再生有潛在的治療作用。另外,研究發(fā)現(xiàn),高糖(HG)條件對BMSCs成骨分化具有抑制作用。然而,重組Shh的加入緩解了HG誘導(dǎo)的抑制功能,其中轉(zhuǎn)染Shh慢病毒的細(xì)胞顯示基質(zhì)礦化結(jié)節(jié)增加、ALP活性和骨涎蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (BMP-4)的表達(dá)水平更高。此外,建立糖尿病大鼠拔牙模型進行體外驗證,發(fā)現(xiàn)Shh給藥促進了拔牙窩內(nèi)的骨形成[18-19]。

2.2 Hh信號通路對成骨細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控

骨組織的發(fā)生主要依賴成骨細(xì)胞的增殖分化,Hh信號通路可通過調(diào)控成骨細(xì)胞增殖分化促進骨形成,進而防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。SLITRK5是成骨細(xì)胞中Hh信號的負(fù)調(diào)控因子,Sun等[20]發(fā)現(xiàn),SLITRK5在成骨細(xì)胞中選擇性表達(dá),SLITRK5的缺失促進了成骨細(xì)胞在體外和體內(nèi)的分化。SLITRK5的體外缺失導(dǎo)致Hh信號通路的增加,成骨細(xì)胞中SLITRK5的過表達(dá)抑制Hh信號通路下游靶點的誘導(dǎo)。該研究表明,Hh信號通路在促進成骨細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用,這可能是促進骨形成的一個重要靶點。Gao等[21]研究發(fā)現(xiàn),Exendin-4以劑量依賴的方式顯著促進成骨細(xì)胞的形成,上調(diào)GLP-1R、Hedgehog和Gli1的表達(dá),Gli1- sirna顯著下調(diào)了Gli1和Runx2的表達(dá),抵消了exendin -4誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化,進一步證明了Hh信號通路在促進成骨細(xì)胞的成骨分化中的重要作用。Jiang等[22]發(fā)現(xiàn),高糖(HG)條件抑制成骨細(xì)胞Shh通路,導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化和骨形成減少,而激活Shh信號緩解了HG誘導(dǎo)的抑制功能。此外,Lin等[23]用microRNA-874處理成骨細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以通過靶向抑制Sufu和激活Hh信號通路,促進骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化。進一步證實,Hh信號通路通過調(diào)控成骨細(xì)胞增殖分化防治骨質(zhì)疏松癥。

此外,研究表明,氧化應(yīng)激可以抑制BMSCs成骨分化,并通過抑制Hh信號通路促進年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松。另外,抑制層粘連蛋白α2 (LAMA2)也可通過調(diào)節(jié)Hh信號通路增強BMSCs成骨分化和抑制其成脂分化,這意味著調(diào)節(jié)Hh信號通路可能是治療骨質(zhì)疏松癥的一種潛在策略[24]。此外,有研究證實,Ihh-Ptch1信號通路在骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中具有重要的功能,因為Ptch1-缺陷(Ptch+/-)細(xì)胞表現(xiàn)成骨細(xì)胞分化增強,RUNX2的表達(dá)上調(diào),這表明Ptch1可能是一種有前景的骨質(zhì)疏松治療靶點[25]。通過以上研究,可以證明Hh信號通路促進BMSCs成骨分化,促進成骨細(xì)胞增殖分化,從而防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

3 中醫(yī)藥調(diào)控Hh信號通路防治骨質(zhì)疏松癥

3.1 中藥單體

根據(jù)中醫(yī)學(xué)“腎藏精,主骨生髓”的理論,骨質(zhì)疏松癥的治療多以補腎中藥為主[26],淫羊藿歸肝腎經(jīng),常用于補腎壯陽、祛風(fēng)除濕,在骨科臨床應(yīng)用較為廣泛[27]。淫羊藿苷是從淫羊藿中分離得到的一種戊烯基黃酮醇苷,是淫羊藿中主要的生物活性成分,其可以通過刺激BMSCs的成骨分化而抑制破骨分化和破骨細(xì)胞的骨吸收活性,從而促進骨形成,可作為骨質(zhì)疏松癥的潛在治療手段[28]。劉杰等[29]探索淫羊藿苷對高糖致骨丟失的治療效果及相關(guān)分子機制,發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖雖然一定程度上能促進MC3T3-E1細(xì)胞增殖,但卻損害細(xì)胞的葡萄糖和糖原代謝,并通過破壞原纖毛穩(wěn)態(tài)引起Hh信號障礙導(dǎo)致成骨分化、礦化受損。淫羊藿苷抑制高糖環(huán)境下線粒體ROS過量產(chǎn)生來保護原纖毛,完整原纖毛是Gli2轉(zhuǎn)錄后修飾及成熟位點,從而通過Shh/Gli2途徑激活Hh信號促進成骨分化和礦化,挽救高糖致骨丟失,為淫羊藿苷防治骨質(zhì)疏松癥提供了一個新的途徑。同時,辛紅美等[30]研究淫羊藿苷對成骨細(xì)胞增殖分化的影響及與Hh信號通路的相關(guān)性,實驗發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷可顯著升高成骨相關(guān)因子ALP的表達(dá),促進成骨細(xì)胞增殖,并且證實該過程是由Hh信號通路介導(dǎo)的。進一步證明了淫羊藿苷在防治骨質(zhì)疏松癥中的潛在作用。

補骨脂味苦,性溫,具有補腎壯陽之效。補骨脂是治療骨骼和關(guān)節(jié)疾病最常用的草藥之一,補骨脂素是從補骨脂中提取的,是補骨脂的重要活性成分,臨床應(yīng)用廣泛,多用于治療骨質(zhì)疏松癥。研究發(fā)現(xiàn),補骨脂素可以通過增加ALP活性和增強成骨細(xì)胞特異性標(biāo)記基因(如I型膠原蛋白和OPG)的表達(dá)來促進成骨細(xì)胞分化[31]。韓宇等[32]研究了補腎中藥補骨脂素防治骨質(zhì)疏松癥的分子機制及與Hh信號通路的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與模型組相比,補骨脂素可明顯上調(diào)Hh信號通路相關(guān)因子Shh和Gli1及骨形成指標(biāo)ALP的表達(dá),下調(diào)Ptch1mRNA及其蛋白的表達(dá)。此結(jié)果表明,補骨脂素含藥血清通過Hh信號通路促進大鼠BMSCs成骨分化、增殖,進一步表明Hh信號通路在防治骨質(zhì)疏松癥中的關(guān)鍵作用及補腎中藥的潛在作用。

柚皮苷是從干姜中提取的一種活性化合物,研究表明柚皮苷能促進骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖和成骨分化。Lin FX等[33]研究柚皮苷促進骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖和成骨分化的機制,發(fā)現(xiàn)柚皮苷可增加BMSCs的礦化,并誘導(dǎo)ALP活性。柚皮苷顯著提高Foxc2、Cbfα1、OCN和BSP的mRNA水平,降低PPARγ2的mRNA水平。此結(jié)果表明,柚皮苷通過Ihh信號通路上調(diào)Foxc2的表達(dá),促進BMSCs的成骨分化,從而防治骨質(zhì)疏松癥。

黃芪是我國著名的中草藥,為中醫(yī)臨床常用補益中藥。黃芪甲苷(astraloside, AST)是黃芪的主要生物活性成分。有研究探討了黃芪甲苷對成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖和遷移的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷促進了成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞增殖和遷移。此外,發(fā)現(xiàn)Hh信號通路基因Shh和Gli1基因表達(dá)水平明顯升高。當(dāng)使用環(huán)巴胺抑制Hh信號通路后,發(fā)現(xiàn)MG-63、U-2OS細(xì)胞增殖和遷移明顯降低。此結(jié)果表明,黃芪甲苷通過激活Hh信號通路促進人成骨樣細(xì)胞的增殖和遷移,從而防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[34]。

3.2 中藥復(fù)方

高舉會等[35]探究右歸丸治療骨質(zhì)疏松癥的療效機制是否與激活Hh信號通路進而促進BMSCs向成骨分化有關(guān),結(jié)果發(fā)現(xiàn),右歸丸可以誘導(dǎo)BMSCs內(nèi)Shh、Ptc、Gli1蛋白的表達(dá),能夠有效治療骨質(zhì)疏松癥,這種作用可能通過Hh信號通路來實現(xiàn)的。此外,高舉會等[36]以中醫(yī)學(xué)中的“腎藏精,主骨,生髓”為理論依據(jù),通過實驗進一步研究左歸丸治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制,發(fā)現(xiàn)左歸丸可以上調(diào)骨質(zhì)疏松模型大鼠BMSCs中成骨相關(guān)因子和Hh通路蛋白的表達(dá),表明左歸丸能夠通過激活Hh信號通路中的Shh、Smo、Gli1等靶基因有效治療骨質(zhì)疏松癥。充分驗證了“腎藏精,主骨,生髓”的腎-髓關(guān)系的科學(xué)性及該理論在防治骨質(zhì)疏松癥中的關(guān)鍵作用。同時,王雨荷[37]進一步研究發(fā)現(xiàn),左歸丸可明顯抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠Hh信號通路關(guān)鍵因子Ihh、Ptch、Smo、Gli1 mRNA及蛋白表達(dá)水平,進而降低RANKL/OPG比值,抑制破骨細(xì)胞活性,防止骨量丟失。進一步闡明“腎主骨”機理,為中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松提供科學(xué)依據(jù)。

黃穎等[38]基于Hh信號通路探討金烏健骨膠囊對激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松大鼠成骨相關(guān)基因的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),金烏健骨膠囊可明顯提高骨質(zhì)疏松大鼠成骨相關(guān)因子Runx2、Osterix及OC、BSP、BALP表達(dá)水平,并且上調(diào)Hh通路相關(guān)因子Shh、Ptch1、Smo、Gli1基因的表達(dá)。此結(jié)果表明,金烏健骨膠囊可通過Hh信號通路促進成骨分化,從而防治激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

鄧洋洋等[39]研究去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生機制與Hh信號通路的關(guān)系及中藥復(fù)方的干預(yù)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生機制與Hh信號傳導(dǎo)通路SHH、Gli1 mRNA和蛋白活性下降有關(guān),補腎填精中藥復(fù)方、活血化瘀中藥復(fù)方、補腎活血中藥復(fù)方通過激活Hh信號傳導(dǎo)通路中的Shh、Gli1,以促進骨形成,抑制骨吸收,起到防止骨質(zhì)疏松癥的作用。有研究基于“腎虛血瘀”理論進一步探討了Hh信號通路與去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨代謝的關(guān)系及補腎填精、活血化瘀中藥復(fù)方的干預(yù)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),補腎活血中藥復(fù)方可通過下調(diào)Hh信號通路相關(guān)蛋白Ptch1和Gli3mRNA表達(dá),從而防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[40]。此外,梁學(xué)振等[41]研究了補腎活血法對激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死大鼠骨代謝的影響及與Hh信號的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)BMSCs成骨成脂分化失衡,補腎活血膠囊可通過Hh信號通路促進BMSCs成骨分化,抑制其成脂分化。同時,姜奧等[42]進一步研究發(fā)現(xiàn),補腎、健脾、活血法通過調(diào)節(jié)骨組織Ihh含量,促進骨組織細(xì)胞增殖與分化,進而防治骨質(zhì)疏松癥,進一步表明了補腎、活血、健脾中藥復(fù)方在調(diào)控Hh信號通路防治骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用,揭示了“腎虛血瘀”“腎藏精主骨”“脾主運化而主四肢肌肉”理論為骨質(zhì)疏松癥的重要機制。但也有研究發(fā)現(xiàn),Hh信號通路與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)證型無明顯相關(guān)性[43]。

4 小結(jié)與展望

綜上所述,Hh信號通路在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮正向調(diào)控作用,并提示Hh信號通路可能作為治療骨質(zhì)疏松癥和其他代謝性骨病的潛在治療靶點。本文主要總結(jié)了中藥單體、中藥復(fù)方通過調(diào)控Hh信號通路,進而防治骨質(zhì)疏松癥。但目前通過針灸、電針、針刀、超聲波等療法調(diào)控Hh信號通路治療骨質(zhì)疏松癥的研究較少,更多的中藥成分以及分子機制研究仍需進一步探討。此外,各種小分子或生物材料已被用來調(diào)節(jié)Hh信號以促進成骨[44-45],然而小分子材料的應(yīng)用面臨著劑量要求高、特異性和穩(wěn)定性低、作用時間短和體內(nèi)潛在副作用等多重挑戰(zhàn),因此,仍需進一步研究明確。此外,Hh信號通路調(diào)控骨形成的機制復(fù)雜,涉及許多信號介質(zhì)和功能,并且作用的細(xì)胞類型具有特異性。因此,對于不同類型的細(xì)胞,需要在適當(dāng)?shù)臅r間微調(diào)Hh軸以促進骨形成和維持骨穩(wěn)態(tài)。此外,骨形成是一個復(fù)雜的再生過程,受多種信號通路調(diào)控,Hh信號通路與其他骨形成相關(guān)信號通路的關(guān)系有待進一步研究。