從少火生氣理論探討腎氣丸促巨噬細(xì)胞M2型極化影響成骨的作用

顏先偉 招文華 張?zhí)锰?伍子賢 尚奇 周澤霖 沈耿楊 陳弘林 陳桂鋒陳星達(dá) 甘延池 張友 譚日威 張學(xué)來 梁德 任輝* 江曉兵*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心,廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一類骨微結(jié)構(gòu)的破壞,導(dǎo)致的骨量減少,骨強(qiáng)度降低的慢性全身性骨病[1],其基本的發(fā)病機(jī)制是骨形成-骨吸收的失衡,病理基礎(chǔ)與炎癥微環(huán)境中骨免疫失衡有關(guān)[2]。隨著人口老齡化的加劇,OP已成為我國常見的老年性疾病之一,由其引起的骨質(zhì)疏松性骨折的患病率也在逐年升高[3]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一類固有免疫效應(yīng)細(xì)胞,可發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等重要作用。由于其具備較強(qiáng)的可塑性,在受到局部微環(huán)境影響時(shí)會(huì)做出適應(yīng)性應(yīng)答[4-6],進(jìn)而發(fā)生極化。據(jù)既往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告,M2型巨噬細(xì)胞[7]在炎癥后期可通過分泌大量促進(jìn)骨形成的抗炎因子,如IL-10、TGF-β等,從而促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收,使骨量增加。

腎氣丸作為《金匱要略》中以少火生氣理論為基礎(chǔ)的代表方劑,其中桂枝溫陽化氣,附子補(bǔ)火助陽,在六味滋陰藥(干地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮)中共同發(fā)揮著少火生氣的作用。《黃帝內(nèi)經(jīng)》:“腎主身之骨髓”、“骨傷則內(nèi)動(dòng)腎”,說明了腎與骨具有密切的生理病理聯(lián)系,因此骨病當(dāng)以腎論治。腎氣丸已在臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)對(duì)腎陽虛骨質(zhì)疏松的治療有積極意義[8-9]。并且據(jù)報(bào)告補(bǔ)腎相關(guān)中藥單體可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化成功調(diào)控成破骨平衡[10-11]。然而,腎氣丸能否通過M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)骨形成的機(jī)制仍未闡明。因此,本研究從少火生氣理論出發(fā),通過體外實(shí)驗(yàn)探討腎氣丸對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的影響及促成骨的機(jī)制,為以后運(yùn)用少火生氣理論治療骨質(zhì)疏松奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞:小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7(購于源井生物公司,批號(hào)YC-C020),傳至第三代用于本實(shí)驗(yàn)。小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)來源8周齡野生型(WT) C57BL/6(B6)小鼠,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究遵循廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定,倫理批件號(hào):No.K【2019】129。

1.1.2試劑:胎牛血清(Cyagen公司,FBSAD-01011-500),α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Servicebio公司,G4219-100),青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco公司,10378016),CCK-8 試劑盒(GLPBIO,GK1001),堿性磷酸酶染色試劑盒(ALP) (Beyotime公司,C3206),茜素紅染液(ARS)(Beyotime公司,CO138),IL-4(PEPROTECH公司,214-14)。腎氣丸[12]凍干粉(中藥原成分購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,主要成分包含:干地黃 240 g,山藥、山茱萸各 120 g,澤瀉、茯苓、牡丹皮各 90 g,桂枝、附子各 30 g。粉碎后,取1 L純水中加入100 g腎氣丸粉末,煮沸1 h,提取上清。然后在殘?jiān)屑尤?00 mL純凈水,混懸液煮沸1 h;然后重復(fù)這個(gè)過程兩次。收集3次的上清液,在60 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至500 mL,再次濃縮至無液滴殘留,得膏狀物,封口膜封好后放于-80 ℃冰箱冷凍,冷凍時(shí)間應(yīng)大于48 h,取出后應(yīng)用冷凍干燥 72 h,得腎氣丸凍干粉,即為腎氣丸有效成分。置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。溶解后可用于?xì)胞干預(yù),并根據(jù)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇腎氣丸濃度。腎氣丸去桂附(其有效成分來源購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,主要成分包含:干地黃 240 g,山藥、山茱萸各 120 g,澤瀉、茯苓、牡丹皮各 90 g。其有效成分制備方法同腎氣丸。)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):①小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC):來源于8周齡的C57BL/6小鼠,從股骨和脛骨中分離出骨髓間充質(zhì)細(xì)胞。用1 mL注射器反復(fù)沖洗骨髓腔至骨髓腔發(fā)白,P0～P1代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞選用20 % 胎牛血清、1 % 雙抗(含有青鏈霉素和鏈霉素)的 MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。P2代及以后代數(shù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在添加有10 % 胎牛血清、1 % 雙抗(含有青鏈霉素和鏈霉素)的 MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)和增殖。②RAW264.7細(xì)胞:用含10 % 胎牛血清、1 % 雙抗(含有青鏈霉素和鏈霉素)的MEM培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù) 5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80 % 時(shí)用槍頭輕輕吹落細(xì)胞,于室溫下1 000 r/min離心5 min,棄上清,重懸細(xì)胞后進(jìn)行傳代于培養(yǎng)皿。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 6×106/皿,向培養(yǎng)皿中分別加入質(zhì)量濃度為20 ng/mL的IL-4,誘導(dǎo)3 d極化成M2型巨噬細(xì)胞。

1.2.2CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況:將RAW264.7細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,分別于孔板中加入腎氣丸或腎氣丸去桂附等藥物進(jìn)行干預(yù),根據(jù)不同藥物濃度進(jìn)行分組:0、0.1、1、5、10、50、100 μg/mL,共7個(gè)濃度,每組6個(gè)副孔。分別培養(yǎng)0、1、2 d及3 d后運(yùn)用CCK8法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的增殖情況,從而篩選出同時(shí)滿足腎氣丸以及腎氣丸去桂附藥物干預(yù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖無影響的濃度。由上述實(shí)驗(yàn)得出極化的適宜濃度(10、50 μg/mL)等條件后,將RAW細(xì)胞分為CON組、IL-4組、IL-4+腎氣丸組、IL-4+腎氣丸去桂附組,共4組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3藥物上清液的提取,并制成條件培養(yǎng)基:各組藥物干預(yù)3 d后,棄去原液,用PBS輕柔緩慢洗滌2～3次,再加入含有10 %胎牛血清的α-MEM,培養(yǎng)3 d,提取并過濾各組藥物的上清液。將各組上清液濃度稀釋為原本的1/3,分別制成相應(yīng)的CON組條件培養(yǎng)基、IL-4組條件培養(yǎng)基、IL-4+腎氣丸組條件培養(yǎng)基、IL-4+腎氣丸去桂附組條件培養(yǎng)基。具體稀釋方法如下:1/3上清液+2/3成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有10 %胎牛血清的α-MEM+地塞米松+抗壞血酸+β-磷酸甘油)?？?80 ℃保存或者進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4條件培養(yǎng)基與BMSC培育:我們建立了用IL-4、IL-4+腎氣丸、IL-4+腎氣丸去桂附等藥物誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的上清液作為條件培養(yǎng)基與BMSC培育的方式,并觀察BMSC成骨的變化。將BMSC種于48孔板,密度為1.0×104個(gè)/孔。待BMSC貼壁后,分別于各組中加入相對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)基,置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃,5 % CO2)中,培養(yǎng)7 d用于堿性磷酸酶(ALP)染色,培養(yǎng)7～14 d用于茜素紅(ARS)染色。顯微鏡下觀察及拍照細(xì)胞顏色、密度變化以及鈣結(jié)節(jié)的形態(tài)。

1.2.5免疫熒光檢測(cè)不同藥物組的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BMSC成骨的相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布:將BMSC接種于12孔板,用不同藥物組干預(yù)后的上清液作為相應(yīng)的條件培養(yǎng)基干預(yù)處理后,PBS 清洗3次再加入1 mL/孔4 %多聚甲醛室溫固定 30 min。棄去甲醛液,PBS 清洗,加入 1 mL/孔 0.3 % Triton室溫通透處理10 min。1 mL免疫熒光封閉液,37 ℃封閉 1 h,吸干回收,PBS洗滌3遍。分別加入1∶200的熒光一抗,4 ℃冰箱靜置過夜。回收一抗,4 ℃ PBS清洗3次,每次靜置5 min。避光加入1 mL/孔的熒光二抗,室溫孵育1.5 h,回收二抗。PBS洗滌3次。用DAPI復(fù)染核,避光靜置20 min,最后用抗熒光淬滅劑封片。最后于熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6Western blot檢測(cè)各藥物組誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)蛋白以及不同藥物組的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BMSC成骨的相關(guān)蛋白的表達(dá):① 檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白的表達(dá):按“1.2.1.1”項(xiàng)方法培養(yǎng)細(xì)胞、分組及各藥物組給藥干預(yù)后,棄去原液,用PBS清洗1～2次,加入RIPA細(xì)胞裂解液后用刮刀刮下細(xì)胞,移至1.5 mL離心管中,冰上裂解30 min,12 000 r/min 離心15 min。取其上清,并用BCA法測(cè)定各組的蛋白濃度,加入loading buffer充分混勻后,用沸水煮沸使之變性。使用一定條件的電泳及轉(zhuǎn)膜后,得到含有Marker的蛋白條帶的PVDF膜,5 %脫脂奶粉常溫封閉1 h,TBST洗膜后加入配制好的一抗4 ℃孵育過夜,回收一抗,TBST充分洗膜后,于室溫?fù)u床孵育二抗1.5 h,最后用TBST洗膜后,即可使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并用Image J測(cè)定相應(yīng)條帶灰度值,通過以GAPDH 作為內(nèi)參來計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。②檢測(cè)BMSC成骨相關(guān)蛋白的表達(dá):按“1.2.1”項(xiàng)方法培養(yǎng)細(xì)胞、分組及各藥物組干預(yù)后的上清液制成的相應(yīng)條件培養(yǎng)基孵育后,棄去原液,蛋白提取和WB檢測(cè)方法同“1.2.6”項(xiàng)。同樣最后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并用image J測(cè)定和比較相應(yīng)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7(M0)及M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察

復(fù)蘇后的RAW264.7培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)為貼壁細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)為圓形。而用藥物IL-4誘導(dǎo)RAW264.7極化為M2型巨噬細(xì)胞,其形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)形或橢圓形。如圖2。

注:A:箭頭所指為20×物鏡下M0型巨噬細(xì)胞形態(tài);B:箭頭所指為20×物鏡下M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)。

2.2 腎氣丸促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞,去桂附后極化促進(jìn)效果減退

通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(如圖3),最終篩選出50 ng/mL為腎氣丸及腎氣丸去桂附共同干預(yù)濃度。在誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞極化藥物IL-4中加腎氣丸藥物后,M2型巨噬細(xì)胞極化效果明顯,而對(duì)于腎氣丸去桂附的加入,M2極化效果則減弱。我們采用了WB實(shí)驗(yàn),并通過WB條帶(如圖4)結(jié)果顯示:與單純用IL-4誘導(dǎo)極化成的M2型巨噬細(xì)胞相比,加入腎氣丸后,其上調(diào)了M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白(ARG1及IL-10)的表達(dá)。相比于加入腎氣丸,加入腎氣丸去桂附的組別,其下調(diào)了ARG1及IL-10(P<0.01)的表達(dá)。上述結(jié)果表明腎氣丸中“少火生氣”的作用可增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞。

注:A:腎氣丸干預(yù)RAW264.7的CCK8;B:腎氣丸去桂附干預(yù)RAW264.7的CCK8。

注:A、B:分別是M2型巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)志蛋白ARG1、IL-10的WB條帶結(jié)果;C、D:分別是ARG1、IL-10的蛋白量化結(jié)果。

2.3 IL-4+腎氣丸組誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化的條件培養(yǎng)基促進(jìn)BMSC細(xì)胞成骨。

IL-4+腎氣丸去桂附組誘導(dǎo)的條件培養(yǎng)基促進(jìn)BMSC細(xì)胞成骨效果減退

采用藥物誘導(dǎo)后的條件培養(yǎng)基與BMSC培育的方式,通過ALP、ARS成骨相關(guān)染色結(jié)果(如圖5),以及WB條帶(如圖6)和免疫熒光(如圖7)結(jié)果,提示IL-4+腎氣丸組相比于IL-4組、IL-4+腎氣丸去桂附組明顯增強(qiáng)促BMSC成骨分化的效果。

注:A:BMP4;B:RUNX2;C、D:BMP4、RUNX2的蛋白量化結(jié)果。

注:A:BMP4;B:OPG。

3 討論

大量研究表明,OP與骨免疫失衡密切相關(guān),其中免疫細(xì)胞尤其是M2型巨噬細(xì)胞大量存在于OP的炎癥微環(huán)境中,參與骨形成-骨吸收的調(diào)控,維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),從而促進(jìn)骨再生[13-16]。Martinis等[17]認(rèn)為骨微環(huán)境中炎癥因子增高是骨吸收大于骨形成的重要原因,促炎因子的增多可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的募集和分化,造成局部骨微環(huán)境改變,骨穩(wěn)態(tài)的失衡,從而局部骨吸收的增加。

作為骨免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞,巨噬細(xì)胞具有有效吞噬抗原,將抗原呈遞以激活并調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng)的功能。在不同炎癥微環(huán)境的信號(hào)刺激下,巨噬細(xì)胞極化為不同表型的亞群M1、M2型。周玲等[18]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)OP狀態(tài)下的大鼠骨髓巨噬細(xì)胞更傾向于向M1極化,與此同時(shí)降低M2型相關(guān)抗炎因子及表面標(biāo)志物的表達(dá)。劉文濤等[19]也同樣通過M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體與BMSC共培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該外泌體具有誘導(dǎo)BMSC成骨分化的作用。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)M2-Exos可通過將外泌體IL-10 mRNA直接呈遞至細(xì)胞,通過激活細(xì)胞IL-10/IL-10R通路,來調(diào)節(jié)BMSCs和BMDM的細(xì)胞分化和促進(jìn)成骨分化。

在M2型巨噬細(xì)胞極化刺激因子中,IL-4扮演著重要的角色。孫林沖等[21]發(fā)現(xiàn)IL-4/IL-4R可引起AKT、Erk1/2和mTOR激活,從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。彭培軒等[22]通過研究將 IL-4負(fù)載至二氧化硅納米粒子上,發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)RAW 264.7巨噬細(xì)胞增殖,以及促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。本文亦將IL-4作為M2型巨噬細(xì)胞極化的誘導(dǎo)劑,參考既往文獻(xiàn)[23]報(bào)告的20 ng/mL的濃度進(jìn)行給藥干預(yù)。文中的條件培養(yǎng)基的濃度選擇參考了既往相關(guān)文獻(xiàn)[24-25]。本文中的上清液是來源不同藥物組誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化后分泌的細(xì)胞上清液。而IL-4+SQW組與IL-4+SQQ組相比藥物組成中多了兩味中藥(桂枝、附子),其相應(yīng)上清液則具備更強(qiáng)的促進(jìn)BMSC成骨分化能力。目前尚未研究上清液的具體成分,后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步研究并對(duì)比兩組上清液所含成分的種類及含量,進(jìn)一步分析“少火生氣”的機(jī)理。通過本研究進(jìn)一步證實(shí)M2型巨噬細(xì)胞極化與BMSC成骨具有密切聯(lián)系。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為OP患者因骨量減少,骨強(qiáng)度減低從而更容易導(dǎo)致骨折、變形等臨床表現(xiàn),與中醫(yī)所說的“骨痿”、“骨枯”等癥狀高度相似?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰:“腎者,主蟄封藏之……其華在發(fā),其充在骨。”中醫(yī)學(xué)認(rèn)為OP患者大多數(shù)是腎精虧虛,久則骨骼失養(yǎng)、骨枯骨朽。因此腎病當(dāng)從骨論治,應(yīng)以補(bǔ)腎益氣壯骨為治療原則。本研究選用的金匱腎氣丸,是《金匱要略》中治療腎虛型“血痹虛勞”、“痰飲咳嗽”的主方,是在六味滋陰藥的基礎(chǔ)上加入桂枝、附子等兩藥而成,故該方亦是以少火生氣理論為基礎(chǔ)的代表方劑。《素問·陰陽應(yīng)象大論》提到的“少火生氣”原義是藥食氣味的基本屬性,少火即是藥食氣味溫和的含義。后世醫(yī)家如張景岳則認(rèn)為“少火”是人體生理正常的陽氣,陽氣溫和,則呈現(xiàn)陰陽兩氣相互平衡的生理狀態(tài)。歷代不少醫(yī)家認(rèn)為“桂枝和附子”是“少火生氣”的點(diǎn)睛之筆,正如《醫(yī)宗金鑒》所說的那樣:“此腎氣丸納桂附于滋潤(rùn)中十倍之一,意不在補(bǔ)火,而在生微火,即生腎氣也[26-27]。故本研究將“少火生氣”在體外實(shí)驗(yàn)中所起到的作用看作“桂枝與附子”在腎氣丸中起到的作用,通過不同藥物分組探究對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化影響及相應(yīng)條件培養(yǎng)基對(duì)BMSC成骨的作用效果比較,研究結(jié)果證實(shí)腎氣丸組對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的效果及相應(yīng)條件培養(yǎng)基作用于BMSC的成骨效果均比腎氣丸去桂附組好,論證了少火生氣配伍對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化和BMSC成骨均有促進(jìn)作用。不過本研究?jī)H僅從成骨方向來研究,而骨質(zhì)疏松的治療需要從成骨和破骨相關(guān)性進(jìn)行研究,后續(xù)研究可從M2型巨噬細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞的影響進(jìn)行進(jìn)一步探討。

綜上所述,腎氣丸較腎氣丸去桂附更能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化,其干預(yù)后的條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)BMSC成骨分化,創(chuàng)新性地從巨噬細(xì)胞極化-成骨分化相關(guān)理論出發(fā)探討了少火生氣配伍治療骨質(zhì)疏松的作用,為少火生氣理論提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。