LncRNA DANCR靶向調(diào)控對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松BMSCs成骨分化的作用

李章獻(xiàn) 王慶* 陳泰祥 戴哲浩 王麓山

1.南華大學(xué)附屬第三醫(yī)院脊柱外科,湖南 衡陽(yáng) 421900

2.南華大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科,湖南 衡陽(yáng) 421900

3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院脊柱外科,湖南 長(zhǎng)沙 421142

4.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科,湖南 衡陽(yáng) 421000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是絕經(jīng)后女性常見(jiàn)的疾病之一,表現(xiàn)為雌激素缺乏后出現(xiàn)的骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞并伴有骨脆性增加,容易發(fā)生脆性骨折[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有自我更新和定向分化的潛能、能夠發(fā)生成骨分化和成脂分化,BMSCs的成骨分化在維持骨代謝平衡、保證骨量及骨微結(jié)構(gòu)正常中發(fā)揮重要作用。在PMOP的發(fā)病過(guò)程中,BMSCs的成骨分化和成脂分化失衡與骨質(zhì)丟失密切相關(guān)[2-3]。因此,深入研究PMOP的BMSCs成骨分化調(diào)控機(jī)制有助于深入認(rèn)識(shí)PMOP的發(fā)病機(jī)制并為疾病的防治提供新靶點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用倍受關(guān)注,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miR)能夠在轉(zhuǎn)錄后實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控,其中miR-19a-3p具有促進(jìn)BMSCs成骨分化的生物學(xué)作用[4],而lncRNA分化非蛋白編碼 RNA(differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,DANCR)位于miR-19a-3p的上游、以“分子海綿”的形式吸附miR-19a-3p并削弱其生物學(xué)作用[5]。為初步揭示PMOP BMSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制,本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)lncRNA DANCR靶向miR-19a-3p調(diào)控PMOP BMSCs成骨分化的作用及機(jī)制展開(kāi)分析。

1 材料和方法

1.1 受試者資料

選擇健康女性志愿者4例和PMOP患者4例。健康女性年齡<35歲、骨密度Z值>-2 SD,排除有骨折病史、自身免疫性疾病、惡性腫瘤的受試者;PMOP患者均符合指南中PMOP的診斷標(biāo)準(zhǔn)且并發(fā)股骨頸骨折、行髖關(guān)節(jié)置換術(shù),排除合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤的患者。健康女性自愿接受骨髓穿刺、取髂骨內(nèi)骨髓;PMOP患者于髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中取髂骨內(nèi)骨髓。

1.2 試劑與儀器

地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,陰性對(duì)照(negative control,NC)siRNA、lncRNA DANCR siRNA、miR-NC、miR-19a-3p、miR-NC抑制物、miR-19a-3p抑制物上海吉瑪生物科技公司,總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司,PTEN的特異性一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技公司,野生型和突變型lncRNA DANCR報(bào)告基因及檢測(cè)試劑盒購(gòu)自丹麥Promega公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1BMSCs的分離培養(yǎng):取髂骨骨髓約5～10 mL、肝素化后與等體積培養(yǎng)基混合,1 000 r/min離心5 min,小心棄去脂肪層和血清層,保留沉淀并緩慢注入Ficoll細(xì)胞分離液,2 500 r/min離心25 min,抽取中間懸浮的乳白色云霧狀單核細(xì)胞層,用磷酸鹽緩沖液洗滌、離心3次,用含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基重懸沉淀,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至6×103/mL,接種在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng),每3 d更換1次培養(yǎng)基、當(dāng)細(xì)胞匯合至單層后用0.25 %胰蛋白酶進(jìn)行消化、1∶2傳代繼續(xù)培養(yǎng)。取第3代BMSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2BMSCs的分組處理:配置培養(yǎng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液如下:0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10 %胎牛血清。取POMP患者的第3代BMSCs進(jìn)行分組,方法如下:si-NC組轉(zhuǎn)染NC siRNA,si-DANCR組轉(zhuǎn)染lncRNA DANCR siRNA,si-NC+miR-NC抑制物組共轉(zhuǎn)染NC siRNA和NC抑制物,si-DANCR+miR-NC抑制物組共轉(zhuǎn)染lncRNA DANCR siRNA和NC抑制物,si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組共轉(zhuǎn)染lncRNA DANCR siRNA和miR-19a-3p抑制物。各組轉(zhuǎn)染過(guò)程中均使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)配置轉(zhuǎn)染體系。

1.3.3BMSCs中l(wèi)ncRNADANCR、miR-19a-3p表達(dá)的檢測(cè):采用培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取BMSCs中的RNA,采用lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒以lncRNA為模板合成cDNA;采用lncRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒配置lncRNA DANCR表達(dá)的PCR檢測(cè)體系:cDNA 2 μL、反應(yīng)預(yù)混液10 μL、10 μmol/L上游引物及下游引物各0.4 μL、去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。采用miRcute miR提取分離試劑盒提取BMSCs的miR,采用miRcute增強(qiáng)型miR cDNA第一鏈合成試劑盒以miR為模板合成cDNA;采用miRcute增強(qiáng)型miR熒光定量檢測(cè)試劑盒配置miR-19a-3p的PCR檢測(cè)體系:cDNA 2 μL、試劑盒內(nèi)反應(yīng)液10 μL、10 μmol/L上游引物0.4 μL、試劑盒中的通用下游引物0.4 μL、去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。將lncRNA DANCR、miR-19a-3p的檢測(cè)體系放入PCR儀,按照如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng):95 ℃預(yù)變性10 min后95 ℃變性5 s、60 ℃退火/延伸15 s并重復(fù)40個(gè)循環(huán)。完成PCR反應(yīng)后在軟件中生成循環(huán)曲線及Ct值,按照公式2-△△Ct計(jì)算表達(dá)水平,以U6為內(nèi)參計(jì)算lncRNA DANCR、miR-19a-3p的表達(dá)水平。

1.3.4BMSCs中PTEN表達(dá)的檢測(cè):采用裂解液提取BMSCs中的蛋白,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,根據(jù)蛋白濃度取30 μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,孵育1∶1 000稀釋的PTEN一抗或1∶3 000稀釋的β-actin一抗過(guò)夜。次日洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h,洗膜3次后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,得到PTEN和β-actin的蛋白條帶,掃描蛋白條帶的灰度值并以β-actin為內(nèi)參、計(jì)算PTEN的表達(dá)水平。

1.3.5BMSCs成骨分化后的茜素紅染色:成骨誘導(dǎo)第21 d時(shí),棄去培養(yǎng)基、用磷酸鹽沖洗細(xì)胞后加入0.1 %茜素紅中染色30 min,觀察茜素紅染色情況并拍照記錄,而后加入10 %氯化十六烷基吡啶溶解鈣結(jié)節(jié)溶解,震蕩后吸取50 μL液體加入96孔培養(yǎng)板內(nèi),在酶標(biāo)儀上檢測(cè)405 nm的光密度值OD405。

1.3.6BMSCs成骨分化后ALP活力的檢測(cè):成骨誘導(dǎo)第3、5、7 d時(shí),棄去培養(yǎng)基、用磷酸鹽沖洗細(xì)胞后采用ALP活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,在酶標(biāo)儀上分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品510 nm波長(zhǎng)的光密度值進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算待測(cè)樣品的ALP活力。

1.3.7BMSCs成骨分化后成骨標(biāo)志基因表達(dá)的檢測(cè):成骨誘導(dǎo)第7 d時(shí),棄去培養(yǎng)基、用磷酸鹽沖洗細(xì)胞后采用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)細(xì)胞中的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、合成cDNA,最后采用熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)OCN、OPN的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 1 μL、熒光定量檢測(cè)試劑盒內(nèi)的反應(yīng)液10 μL、上游引物和下游引物各0.6 μL,加入去離子水補(bǔ)足20.0 μL。在熒光定量PCR儀中設(shè)置反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min后95 ℃ 15 s、特異性退火溫度25 s、72 ℃ 30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán),完成PCR反應(yīng)結(jié)束后得到得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct),以β-actin為內(nèi)參、按照公式2-△△Ct計(jì)算OCN、OPN的mRNA表達(dá)水平。

1.3.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):取POMP患者的第3代BMSCs,將lncRNA DANCR報(bào)告基因與miR-NC或miR-19a-3p共轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞,48 h后采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)告基因的螢火蟲(chóng)熒光值和海腎熒光值,計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光值/海腎熒光值的比值作為報(bào)告基因的熒光活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料、以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示并進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMOP女性和健康女性BMSCs成骨分化的比較

成骨誘導(dǎo)21D時(shí),PMOP女性和健康女性BMSCs均可見(jiàn)大小不等的鈣結(jié)節(jié),與健康女性比較,PMOP女性BMSCs鈣結(jié)節(jié)的染色淺、數(shù)量少、范圍小。經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè),PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)后的OD405水平低于健康女性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。成骨誘導(dǎo)3、5、7 d時(shí),PMOP女性BMSCs的ALP活力低于健康女性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。成骨誘導(dǎo)7 d時(shí),PMOP女性BMSCs中OCN、OPN的mRNA表達(dá)水平低于健康女性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注:與健康女性比較,*P<0.05。

2.2 PMOP女性和健康女性BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR、miR-19a-3p、PTEN表達(dá)水平的比較

PMOP女性BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR、PTEN的表達(dá)水平高于健康女性,miR-19a-3p的表達(dá)水平低于健康女性(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注:與健康女性比較,*P<0.05。

2.3 PMOP女性BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR對(duì)miR-19a-3p的靶向調(diào)控作用

轉(zhuǎn)染48 h時(shí),miR-19a-3p組BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR野生型報(bào)告基因的熒光活力低于miR-NC組(P<0.05),lncRNA DANCR突變型報(bào)告基因的熒光活力與miR-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注:與miR-NC組比較,*P<0.05。

2.4 敲低lncRNA DANCR對(duì)PMOP女性BMSCs成骨分化的影響

PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)21 d時(shí),si-NC組和si-DANCR組均可見(jiàn)大小不等的鈣結(jié)節(jié),與si-NC組比較,si-DANCR組的鈣結(jié)節(jié)染色深、數(shù)量多、范圍小廣。經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè),si-DANCR組成骨誘導(dǎo)后的OD405水平高于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)3、5、7 d時(shí),si-DANCR組的ALP活力高于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)7 d時(shí),si-DANCR組的OCN、OPN mRNA表達(dá)水平低于si-NC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.5 敲低lncRNA DANCR對(duì)PMOP女性BMSCs中miR-19a-3p/PTEN軸的調(diào)控作用

PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)7 d時(shí),si-DANCR組的miR-19a-3p的表達(dá)水平高于si-NC組,PTEN的表達(dá)水平低于si-NC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.6 miR-19a-3p抑制物對(duì)敲低lncRNA DANCR促進(jìn)PMOP女性BMSCs成骨分化的影響

PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)7 d時(shí),si-DANCR+miR-NC抑制物組的miR-19a-3p表達(dá)水平高于si-NC+miR-NC抑制物組,PTEN表達(dá)水平低于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的miR-19a-3p表達(dá)水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物,PTEN表達(dá)水平高于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)21 d時(shí),si-DANCR+miR-NC抑制物組的OD405水平高于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的OD405水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)3、5、7 d時(shí),si-DANCR+miR-NC抑制物組的ALP活力高于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的ALP活力低于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PMOP女性BMSCs成骨誘導(dǎo)7 d時(shí),si-DANCR+miR-NC抑制物組的OCN、OPN mRNA表達(dá)水平高于si-NC+miR-NC抑制物組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);si-DANCR+miR-19a-3p抑制物組的OCN、OPN mRNA表達(dá)水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注:與si-NC+miR-NC抑制物組比較,*P<0.05;與si-DANCR+miR-NC抑制物組比較,#P<0.05。

3 討論

PMOP是常見(jiàn)的骨質(zhì)疏松類型,因絕經(jīng)后雌激素水平降低導(dǎo)致骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變,患者發(fā)生脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)大大增加、嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)生死亡[6-8]。PMOP的發(fā)生與雌激素水平降低有關(guān),但具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。BMSCs具有成骨和成脂分化能力,成骨和成脂分化的平衡有利于維持正常的骨量及骨微結(jié)構(gòu),其失衡會(huì)導(dǎo)致骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變并參與PMOP的發(fā)生發(fā)展。本研究的結(jié)果及既往其他學(xué)者的結(jié)果均顯示,與健康育齡期女性比較,PMOP患者的BMSCs成骨分化能力明顯減弱[9-10]。基于此,本研究將深入探索PMOP患者BMSC成骨分化能力減弱的分子機(jī)制。

LncRNAs和miRs是廣泛分布于全身各個(gè)臟器和組織的非編碼RNA,前者能夠通過(guò)“分子海綿”的作用與miRs結(jié)合、削弱miRs的生物學(xué)作用;后者能夠以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合,水解mRNA或抑制其翻譯,進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。已有不同的研究表明lncRNA/miR/靶基因軸參與干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控、POMP的發(fā)病[11-13]。LncRNA DANCR是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,一項(xiàng)臨床研究證實(shí)POMP患者外周血中l(wèi)ncRNA DANCR的表達(dá)增加且與骨密度呈負(fù)相關(guān)[14],提示lncRNA DANCR低表達(dá)與POMP的發(fā)病有關(guān)。本研究在POMP患者的BMSCs中檢測(cè)到lncRNA DANCR的表達(dá)水平明顯增加;轉(zhuǎn)染siRNA敲低lncRNA DANCR的表達(dá)后,POMP患者BMSCs的成骨分化能力明顯增強(qiáng),表現(xiàn)為成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)增多、ALP活力及多種成骨標(biāo)志基因表達(dá)增加。以上結(jié)果提示lncRNA DANCR在POMP患者BMSCs的成骨分化中起到抑制作用,POMP發(fā)病過(guò)程中高表達(dá)的lncRNA DANCR可能通過(guò)抑制BMSCs成骨分化的方式導(dǎo)致骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)改變。

LncRNA通過(guò)靶向miR發(fā)揮生物學(xué)作用,在多種組織損傷模型中l(wèi)ncRNA DANCR通過(guò)靶向miR-19a-3p的途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等,進(jìn)而加重組織損傷的程度[5,15]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)在PMOP患者的BMSCs中證實(shí)lncRNA DANCR靶向結(jié)合miR-19a-3p;在PMOP患者的BMSCs成骨誘導(dǎo)過(guò)程中轉(zhuǎn)染siRNA敲低lncRNA DANCR后,細(xì)胞中miR-19a-3p的表達(dá)增加、PTEN的表達(dá)降低。miR-19a-3p是一種具有保護(hù)作用的miR,PTEN是已知的miR-19a-3p靶基因之一[16-17]。已有研究報(bào)道m(xù)iR-19a-3p在BMSCs成骨分化中起促進(jìn)作用、而PTEN在BMSCs成骨分化中起抑制作用。據(jù)此推測(cè),lncRNA DANCR可能通過(guò)靶向miR-19a-3p/PTEN軸的方式在PMOP患者的BMSCs中調(diào)控成骨分化。

進(jìn)一步探究受到lncRNA DANCR調(diào)控的miR-19a-3p/PTEN軸在PMOP患者BMSCs成骨分化中的作用。POMP患者的BMSCs中miR-19a-3p表達(dá)降低,PTEN表達(dá)增加,符合miR-19a-3p促進(jìn)成骨、PTEN抑制成骨的生物學(xué)特征。在PMOP患者的BMSCs成骨誘導(dǎo)過(guò)程中,轉(zhuǎn)染siRNA敲低lncRNA DANCR的同時(shí)共轉(zhuǎn)染miR-19a-3p抑制物后,敲低lncRNA DANCR增加miR-19a-3p表達(dá)、降低PTEN表達(dá)的作用以及促進(jìn)PMOP患者BMSCs成骨分化的作用被逆轉(zhuǎn),這一結(jié)果證實(shí) lncRNA DANCR對(duì)PMOP患者BMSCs成骨分化的調(diào)控作用與靶向miR-19a-3p/PTEN軸有關(guān)。

綜上所述,lncRNA DANCR靶向miR-19a-3p/PTEN軸參與PMOP患者BMSCs成骨分化的調(diào)控;PMOP患者BMSCs中l(wèi)ncRNA DANCR及PTEN表達(dá)增加、miR-19a-3p表達(dá)降低、成骨分化能力減弱,敲低lncRNA DANCR使的成骨分化能力增加、miR-19a-3p表達(dá)增加、PTEN表達(dá)降低。以上分析為今后深入認(rèn)識(shí)PMOP患者BMSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制以及PMOP的發(fā)病機(jī)制提供了新靶點(diǎn)。