曲古抑菌素A促進(jìn)去卵巢大鼠鈦植入物骨整合

周志 蔣文凱 劉之義 李楊 任茂賢 劉合棟 楊民

皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,安徽 蕪湖 241001

隨著人口老齡化進(jìn)展,骨質(zhì)疏松性骨折已經(jīng)成為世界性健康難題[1-3]。鈦合金因?yàn)槠浞€(wěn)定的理化性質(zhì)及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于骨科植入。然而,鈦植入物(titanium implants, TI)松動(dòng)仍然是困擾骨科醫(yī)生的一大挑戰(zhàn)[4-5]。骨整合(osseointegration)是指植入物與周?chē)墙M織直接接觸,連接成為一個(gè)穩(wěn)固的整體[6-7]。其效果與骨折愈合過(guò)程中植入物和周?chē)墙M織的相對(duì)位移、磨損、新骨重塑密切相關(guān)[8-9]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究集中于尋找既能治療骨質(zhì)疏松,又能改善種植體的骨整合效果的治療方式[10]。

曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)是一種非選擇性組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi),可促進(jìn)細(xì)胞乙酰化,通過(guò)表觀遺傳(epigenetics)修飾調(diào)控細(xì)胞功能[11-13]。目前TSA已被證實(shí)可促進(jìn)新骨形成,其主要機(jī)制與拮抗氧化應(yīng)激有關(guān)[14-15]。但TSA能否促進(jìn)TI周?chē)鹿切纬?進(jìn)而增強(qiáng)TI骨整合,目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探索TSA對(duì)TI骨整合的影響,為解決TI松動(dòng)問(wèn)題提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠30只,SPF級(jí),雌性,3月齡,體重200～250 g,由南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(皖)2018-004。

1.2 主要材料與儀器

TSA(APExBIO,美國(guó));HE染色試劑盒(博士德,中國(guó));Masson染色試劑盒(銳博,中國(guó));大鼠ELISA試劑盒(ThermoFisher,美國(guó));醫(yī)用電鉆(Erbrigh-Instrumente,德國(guó));Micro-CT(Scanco Medical μCT-100,瑞士);酶標(biāo)儀(BioTek,美國(guó));數(shù)字病理切片掃描儀(Motic EASY SCAN,中國(guó));鈦植入物(華創(chuàng)醫(yī)療器械,1.5×10.0 mm,中國(guó));電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(Reger,中國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1雙側(cè)去卵巢術(shù)、TI植入和藥物干預(yù):將實(shí)驗(yàn)大鼠分為兩組,雙側(cè)去卵巢組(OVX,n=25),假手術(shù)組(Sham,n=5)。麻醉大鼠后俯臥位固定,從大鼠背側(cè)肋下腎區(qū)切開(kāi)皮膚,鈍性分離皮下組織進(jìn)入腹腔。結(jié)扎輸卵管,切除卵巢?？p合切口并術(shù)后肌注青霉素抗感染治療3 d。Sham組大鼠進(jìn)行相同操作,但僅切除卵巢旁等質(zhì)量脂肪組織。3個(gè)月后兩組各隨機(jī)選取5只大鼠處死以驗(yàn)證骨質(zhì)疏松模型是否成功建立。隨后,對(duì)OVX組剩余20只大鼠行股骨遠(yuǎn)端TI植入手術(shù)。經(jīng)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開(kāi)皮膚,鈍性分離皮下組織暴露股骨內(nèi)側(cè)髁,使用醫(yī)用電鉆從內(nèi)側(cè)髁穿透至外側(cè)髁做一直徑約1 mm的圓柱形骨缺損,經(jīng)缺損處置入TI?？p合切口并術(shù)后抗感染3 d。待2周大鼠傷口愈合后隨機(jī)將大鼠分為2組:對(duì)照組(Control,n=10)和TSA組(n=10)。TSA組按500 μg/(kg·d)腹腔注射,連續(xù)給藥4周,自由進(jìn)食水,每天稱(chēng)重,根據(jù)體重計(jì)算注射體積,Control組腹腔注射同等體積生理鹽水。給藥結(jié)束后觀察2周,隨后處死大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2Micro-CT檢測(cè):取Control組(n=10)和TSA組(n=10)左側(cè)股骨樣本行Micro-CT檢測(cè)。掃描股骨下段,以TI為中心,選擇直徑3 mm圓柱形區(qū)域作為感興趣區(qū)(ROI)。評(píng)估ROI內(nèi)骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、連接密度(Conn.D)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)等。

1.3.3拔釘實(shí)驗(yàn):取Control組(n=10)和TSA組(n=10)右側(cè)股骨樣本盡快行TI軸向拔出力檢測(cè)。將股骨標(biāo)本固定于固定架上,使TI長(zhǎng)軸保持豎直。另取固定架的夾持刀片固定TI的螺絲帽,再將固定架與電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)相連,使拉力長(zhǎng)軸與TI保持一致,牽拉速度2.0 mm/min,記錄輸出數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.3.4組織切片染色:拔除TI后取Control組(n=10)和TSA組(n=10)右側(cè)股骨樣本進(jìn)行組織切片染色。樣本脫鈣后制作石蠟切片,按HE、Masson染色試劑盒說(shuō)明書(shū)分別操作。使用數(shù)字病理切片掃描儀保留結(jié)果,選取同一水平面TI缺損處上方骨髓及骨小梁滿(mǎn)視野區(qū)域進(jìn)行分析。

1.3.5ELISA法檢測(cè):取Control組(n=10)和TSA組(n=10)大鼠血清以O(shè)CN、BMP2 ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè),按說(shuō)明書(shū)操作。使用酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)定吸光度(OD)值,根據(jù)測(cè)試結(jié)果計(jì)算對(duì)應(yīng)樣本OCN和BMP2在血清中的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 建立骨質(zhì)疏松模型

取Sham組和OVX組大鼠股骨樣本行Micro-CT掃描和HE染色。Micro-CT結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組大鼠股骨干骺端骨小梁萎縮、斷裂,數(shù)量減少(圖1A)。定量分析結(jié)果提示,OVX組BMD下降(圖1C),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HE染色顯示,OVX組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂、變薄,同時(shí)伴有萎縮甚至斷裂(圖1B、1D)。提示大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。

注:A:股骨干骺端Micro-CT圖像;B:HE染色圖像,標(biāo)尺=200 μm;C:BMD定量分析;D:ROI骨小梁面積占比;Tb:骨小梁,BM:骨髓。**P<0.01,****P<0.0001。

2.2 Micro-CT分析

Micro-CT三維重建及微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,與Control組相比,TSA組TI周?chē)切×号帕忻芏燃皵?shù)量回升(圖2A)。定量結(jié)果分析顯示,TSA組BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D升高,Tb.Sp、SMI降低(P<0.05)(圖2B)。

注:A:股骨干骺端TI及周?chē)M織三維重建圖像;B:ROI參數(shù)定量分析結(jié)果。*P<0.05,**P<0.01。

2.3 拔釘實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Control組螺絲釘軸向拔出力的平均峰值為(36.75±7.37)N。TSA組螺絲釘軸向拔出力的平均峰值為(53.97±11.72)N。如圖3所示,與Control組相比,TSA組的螺絲釘軸向拔出力明顯增高。

注:Control組和TSA組TI軸向拔出力分析結(jié)果。**P<0.01。

2.4 骨組織切片染色

與Control組相比,HE染色顯示,TSA組TI周?chē)切×哼B接恢復(fù),排列密度增高,厚度增加,數(shù)量回升(圖4A、4B)。Masson染色顯示,TSA組骨小梁增多,厚度增加,新骨和膠原纖維增多(圖4C、4D)。

注:A:股骨干骺端HE染色圖像,標(biāo)尺=200 μm;B:ROI骨小梁面積占比;C:股骨干骺端Masson染色圖像,標(biāo)尺=200 μm;D:新骨形成速率直方圖;Tb:骨小梁,BM:骨髓,*:成熟骨,#:新生骨和膠原纖維。**P<0.01,***P<0.001。

2.5 ELISA法檢測(cè)

ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖5A、5B所示,與Control組相比,TSA組血清中OCN、BMP2水平升高。

注:A:OCN含量定量分析;B:BMP-2含量定量分析。***P<0.001。

3 討論

本研究采用的OVX大鼠模型是研究骨質(zhì)疏松非常成熟且應(yīng)用廣泛的動(dòng)物模型,可模擬人體骨質(zhì)疏松[16-17]。骨小梁位于骨髓腔中,是骨皮質(zhì)在骨松質(zhì)內(nèi)延伸出來(lái)的不規(guī)則網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu),其質(zhì)量、結(jié)構(gòu)、數(shù)量和厚度等都對(duì)骨強(qiáng)度有較大影響[18]。Micro-CT顯示,OVX組大鼠股骨BMD低于Sham組,HE染色顯示,OVX組骨小梁數(shù)量明顯減少,結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂、萎縮,提示大鼠骨質(zhì)疏松模型成功建立。在骨質(zhì)疏松性骨折的治療過(guò)程中,TI無(wú)菌性松動(dòng)是很常見(jiàn)的問(wèn)題,與其周?chē)切纬刹蛔忝芮邢嚓P(guān),也在一定程度上限制了TI在骨科手術(shù)中的應(yīng)用[4-5]?？紤]到長(zhǎng)骨干骺端體積較大便于手術(shù)操作,本研究選擇大鼠股骨干骺端作為鈦釘植入部位[19-20]。正如本研究結(jié)果顯示,通過(guò)Micro-CT掃描及三維重建,發(fā)現(xiàn)Control組TI周?chē)鷥H可見(jiàn)少量新生骨和骨小梁,骨形成不足。而經(jīng)TSA處理后的大鼠的TI周?chē)鶥V/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D升高,Tb.Sp、SMI降低,說(shuō)明桿狀骨小梁轉(zhuǎn)化為板狀骨小梁增多,即新生骨小梁增多[21]。HE和Masson染色結(jié)果顯示,TSA組TI周?chē)切×?、新生骨和膠原纖維增多。在骨愈合過(guò)程中,OCN是由成骨細(xì)胞分泌的一種多肽,主要作用是維持骨的礦化[22]。BMP2屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)家族,可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟,參與骨與軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育和重建過(guò)程[23]。大鼠血清ELISA檢測(cè)結(jié)果分析可知,經(jīng)TSA處理后大鼠血清中OCN、BMP2的水平明顯增加。表明大鼠體內(nèi)成骨細(xì)胞活性增強(qiáng),成骨能力增強(qiáng)。TI軸向拔出力檢測(cè)結(jié)果也證明TSA組拔出鈦釘所需軸向力明顯增大,說(shuō)明TSA組大鼠的TI與股骨結(jié)合的更加緊密,骨整合程度更加良好。

有研究表明,氧化應(yīng)激是骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[24]。核因子-κB受體激活劑配體(RANKL)和骨保護(hù)素(OPG)共同維持骨代謝平衡,RANKL抑制成骨,而OPG促進(jìn)成骨。氧化應(yīng)激可通過(guò)激活蛋白激酶及影響特定轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)等機(jī)制誘導(dǎo)RANKL上調(diào)和OPG下調(diào),并且能直接誘導(dǎo)骨細(xì)胞凋亡加重RANKL和OPG的比例失衡,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和促進(jìn)其發(fā)展。而TSA可以發(fā)揮抗氧化作用,通過(guò)激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路,加速Nrf2與Keap1解離,促使Nrf2入核,與ARE抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)控II相解毒酶基因以及抗氧化酶基因等的表達(dá),拮抗氧化應(yīng)激,所以TSA是一種潛在的新型骨合成代謝藥物[25]。這一觀點(diǎn)與本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。為了實(shí)現(xiàn)鈦植入物與骨小梁之間更好的骨整合,各種研究都試圖對(duì)植入物表面進(jìn)行改良和(或)促進(jìn)TI周?chē)鹿呛凸切×盒纬蒣26]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),目前關(guān)于TSA應(yīng)用于骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型治療的研究較少,尚未有應(yīng)用于金屬內(nèi)植入物動(dòng)物模型的研究,缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究結(jié)果表明,在系統(tǒng)性應(yīng)用TSA后,成骨相關(guān)蛋白表達(dá)增加,TI周?chē)切×涸龆唷⑿鹿切纬稍龆?使得TI與周?chē)M織結(jié)合更加緊密,從而增強(qiáng)TI骨整合。

本研究首次探索了TSA對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠TI骨整合的影響。但本研究仍具有一定的局限性。首先,因?yàn)槭乔捌谘芯?所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限。其次,本研究只參考并應(yīng)用了單一劑量的TSA來(lái)觀察改善骨整合的效果,未設(shè)置濃度梯度,尚未知最合適的劑量。因此后期進(jìn)一步研究將設(shè)置濃度梯度和探索最佳劑量。最后,由于本研究沒(méi)有觀察除感興趣區(qū)外其他部位的各項(xiàng)參數(shù),因此無(wú)法確定TSA僅對(duì)TI周?chē)墙M織還是對(duì)全身骨組織都起作用。

綜上所述,本研究首次證實(shí)了系統(tǒng)地給予TSA可以上調(diào)OCN和BMP2等成骨相關(guān)蛋白表達(dá),改善骨小梁微結(jié)構(gòu)、促進(jìn)新骨形成,從而增強(qiáng)去卵巢大鼠TI骨整合。這表明在骨質(zhì)疏松性骨折的治療中,應(yīng)用TSA可能是一種有效的改善植入物骨整合的方法。