基于腸道免疫理論分析雙歧桿菌輔助治療肺部感染所致膿毒癥的應(yīng)用價(jià)值

李明 蘇維 馬士恒

河北大學(xué)附屬醫(yī)院 1感染科，2檢驗(yàn)科 （河北保定 071000）

膿毒癥是由感染所引發(fā)的一系列炎性綜合征，肺部感染是臨床上的常見感染原因之一［1］。臨床調(diào)查結(jié)果顯示，膿毒癥患者普遍存在腸道微生態(tài)異常，腸道是人體重要的免疫器官［2］，此類患者往往同時(shí)合并有不同程度的免疫功能障礙，極易引發(fā)多器官感染與損傷，死亡率接近40%。人體腸道內(nèi)定植有500 ～ 1 000 種細(xì)菌，總菌體數(shù)量可達(dá)到約1014個(gè)，這些菌群是不斷變化的，在健康狀態(tài)下益生菌占優(yōu)勢(shì)地位；在某些病理狀態(tài)下，炎性反應(yīng)和腸黏膜損傷的發(fā)生導(dǎo)致菌群移位，部分病原菌的數(shù)量增加并轉(zhuǎn)為優(yōu)勢(shì)菌群。依靠這種菌群移位，腸道微生態(tài)可直接參與到機(jī)體的免疫調(diào)控中，故有第七大免疫系統(tǒng)之稱［3］。另外，部分患者治療過(guò)程中難以避免地會(huì)用到廣譜抗生素，對(duì)多種菌群形成無(wú)差別打擊，因此，膿毒癥病理進(jìn)程中，除了感染這個(gè)病原條件以外，腸道微生態(tài)受到破壞的形勢(shì)也較為嚴(yán)峻。以此為背景，本研究在該類患者的臨床治療中使用雙歧桿菌，以求糾正腸道微生態(tài)平衡與腸道免疫功能，改善患者預(yù)后，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為本院2020 年10 月至2022 年7 月期間收治的143 例肺部感染所致膿毒癥患者，包括男75 例，女68 例；年齡23 ～ 75 歲，平均（46.2 ± 10.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）參照《中國(guó)膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南（2018 版）》確診為膿毒癥；（2）由兩名主治醫(yī)師確定病因?yàn)榉尾扛腥?，并?jīng)后續(xù)細(xì)菌培養(yǎng)證實(shí)；（3）近3 個(gè)月內(nèi)未使用激素或免疫調(diào)節(jié)劑；（4）自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）胃腸道疾病；（2）腹部手術(shù)史；（3）機(jī)械通氣者；（4）感染前，合并免疫系統(tǒng)功能障礙；（5）妊娠期或哺乳期。后期剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）后期鑒定發(fā)現(xiàn)為非肺部感染誘發(fā)的膿毒癥；（2）生存時(shí)間≤ 3 d；（3）依從性差或自愿退出研究。采用隨機(jī)數(shù)字表將患者分為兩組，兩組間年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、病程等基線資料的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

1.2 治療方法 所有患者均參照《中國(guó)膿毒癥/膿毒癥休克急診治療指南（2018）》予以治療，包括早期液體復(fù)蘇、糾正電解質(zhì)、抗感染、營(yíng)養(yǎng)支持等。研究組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上口服雙歧桿菌四聯(lián)活菌片（杭州遠(yuǎn)大生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20020010）。3片/次（0.5 g/片，24片/盒），每天3次，連續(xù)口服1 周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 病情評(píng)分 于入院當(dāng)天及治療1 周時(shí)，評(píng)估Ⅱ版急性生理和慢性健康（acute physiology and chronic health evaluation scoring system Ⅱ，APACHEⅡ）評(píng)分與序貫器官功能衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）評(píng)分。其中APACHE Ⅱ由極性生理學(xué)評(píng)分、年齡評(píng)分、慢性健康狀況評(píng)分三部分組成，理論最高分為71 分，分值越高病情越重。序貫器官功能衰竭（sequential organ failure assessment）評(píng)分涵蓋了對(duì)循環(huán)、呼吸、腎臟、肝臟、凝血、神經(jīng)6 個(gè)器官系統(tǒng)的功能評(píng)估，理論最高分為24 分，分值越高病情越重。

1.3.2 腸道菌群 分別于入院當(dāng)天以及治療1 周時(shí)采集糞便標(biāo)本1 g，經(jīng)稀釋配制成菌液，進(jìn)行培養(yǎng)基澆注與培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，用天瑞基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）對(duì)培養(yǎng)基上的不同形態(tài)菌落進(jìn)行鑒定，并計(jì)算乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸埃希菌及梭菌的菌落數(shù)量（CFU），結(jié)果以CFU/g 表示。

1.3.3 腸道屏障功能評(píng)估 于入院當(dāng)天及治療1 周時(shí)，進(jìn)行胃腸功能障礙評(píng)分：1 分：腸鳴音減弱但未消失，腸蠕動(dòng)減弱，嘔血、黑便或胃引流液隱血陽(yáng)性；2 分：腸鳴音近乎消失或消失，腸蠕動(dòng)麻痹，嘔血、黑便或胃引流液隱血陽(yáng)性；3 分：腸鳴音消失，并出現(xiàn)應(yīng)激性潰瘍出血或麻痹性腸梗阻。此外采集患者空腹肘靜脈血，檢測(cè)血清D-乳酸、細(xì)菌內(nèi)毒素水平。

1.3.4 T 淋巴細(xì)胞亞群和炎性標(biāo)志物 分別于入院當(dāng)天以及治療1 周時(shí)采集空腹肘靜脈血，肝素抗凝，均分為兩份，一份采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，并重懸于PBS 液，經(jīng)抗CD3-FITC、抗CD4-PerCP、抗CD8-PE 抗體孵育后，上機(jī)測(cè)試CD3+T、CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)占比。另一份3 000 r/min 離心15 min 分離血漿，采用全自動(dòng)放射免疫分析儀和ELISA 試劑盒測(cè)定炎性標(biāo)志物降鈣素原（procalcitonin，PCT）、超敏C 反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）和白介素6（Interleukin-6，IL-6）的血漿水平。

1.3.5 預(yù)后 以28 d 病死率作為預(yù)后的主要評(píng)估指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0 分析數(shù)據(jù)，連續(xù)型變量符合正態(tài)分布者用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，涉及多時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的數(shù)據(jù)行重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析及事后LSD和SNK檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。分類資料以百分比表示，組間比較采用分類資料采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher 精確檢驗(yàn)。雙側(cè)P＜ 0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后的病情評(píng)分 治療前，兩組的APACHEⅡ與SOFA 評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，兩組的APACHEⅡ與SOFA 評(píng)分均有明顯降低，其中研究組APACHEⅡ評(píng)分顯著低于對(duì)照組（P＜ 0.05），SOFA 評(píng)分與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1。

2.2 腸道菌群 經(jīng)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，時(shí)間因素與組別因素對(duì)乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和大腸埃希菌的含量均有影響（P＜ 0.05），但對(duì)梭菌的影響不明顯（P＞ 0.05）；組別因素與時(shí)間因素均不存在交互作用（P＞ 0.05）。組內(nèi)比較結(jié)果顯示，治療后，兩組的梭菌水平變化不明顯（P＞ 0.05），但乳酸桿菌、雙歧桿菌含量顯著升高，腸球菌與大腸埃希菌含量降低（P＜ 0.05）。組間比較結(jié)果顯示，治療前，兩組主要腸道菌群含量差異不顯著（P＞ 0.05）；治療后，兩組梭菌與腸球菌含量差異不顯著（P＞ 0.05），研究組乳酸桿菌、雙歧桿菌含量高于對(duì)照組，大腸埃希菌含量低于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者治療前后腸道菌群比較Tab.2 Comparison of intestinal flora before and after treatment between the two groups ±s，CFU/g

表2 兩組患者治療前后腸道菌群比較Tab.2 Comparison of intestinal flora before and after treatment between the two groups ±s，CFU/g

注：與治療前比較，*P ＜ 0.05；1表示治療前研究組 vs.對(duì)照組，2表示治療后研究組 vs.對(duì)照組

研究組（n = 72）對(duì)照組（n = 71）大腸埃希菌8.26 ± 0.82 5.23 ± 0.68*7.95 ± 1.02 6.25 ± 0.95*0.352＜ 0.001治療前治療后治療前治療后P1值P2值乳酸桿菌6.25 ± 0.85 9.25 ± 1.33*6.33 ± 0.78 8.02 ± 0.95*0.605＜ 0.001雙歧桿菌6.35 ± 1.02 7.85 ± 0.85*6.54 ± 0.95 7.25 ± 0.68*0.854＜ 0.001梭菌5.03 ± 0.82 5.42 ± 0.75 4.95 ± 0.77 5.34 ± 0.72 0.442 0.516腸球菌8.85 ± 1.33 6.25 ± 0.86*8.21 ± 1.25 7.11 ± 0.85*0.565 0.071

2.3 腸道功能 治療前，兩組的腸道功能評(píng)分、D-乳酸、內(nèi)毒素水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，兩組的腸道功能評(píng)分、D-乳酸、內(nèi)毒素水平均顯著降低（P＜ 0.05），其中研究組D-乳酸與內(nèi)毒素水平低于對(duì)照組（P＜ 0.05），腸道功能評(píng)分與對(duì)照組差異不顯著（P＞ 0.05）。見表3。

表3 兩組患者治療前后腸道功能比較Tab.3 Comparison of intestinal function before and after treatment between the two groups M（P25，P75）

2.4 T 淋巴細(xì)胞亞群和炎性因子 經(jīng)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，時(shí)間因素與組別因素對(duì)CD4+T%、CD8+T%影響不顯著（P＞ 0.05），對(duì)CD3+T%、hs-CRP、IL-6、PCT 水平有顯著影響（P＜ 0.05），組別因素與時(shí)間因素不存在交互作用（P＞ 0.05）。組內(nèi)比較結(jié)果顯示，治療后，兩組CD4+T%水平有所升高，hs-CRP、IL-6、PCT 水平有所降低（P＜ 0.05）。組間比較結(jié)果顯示，治療前，兩組T 淋巴細(xì)胞亞群和炎性因子水平差異不顯著（P＞ 0.05）；治療后，兩組PCT 水平差異不顯著（P＞ 0.05），研究組CD3+T%水平高于對(duì)照組，hs-CRP、IL-6 水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組患者治療前后T 淋巴細(xì)胞亞群和炎性因子比較Tab.4 Comparison of T-lymphocyte subsets and inflammatory factors before and after treatment between the two groups ±s

表4 兩組患者治療前后T 淋巴細(xì)胞亞群和炎性因子比較Tab.4 Comparison of T-lymphocyte subsets and inflammatory factors before and after treatment between the two groups ±s

注：與治療前比較，*P＜0.05；1表示治療前研究組 vs.對(duì)照組，2表示治療后研究組 vs.對(duì)照組

組別研究組（n = 72）對(duì)照組（n = 71）P1值P2值PCT（ng/mL）10.6 ± 2.9 2.9 ± 1.3*11.4 ± 3.2 3.3 ± 1.7*0.695 0.116治療前治療后治療前治療后----CD3+T（%）55.3 ± 13.5 61.7 ± 10.3*53.5 ± 15.6 57.8 ± 12.2*0.445 0.042 CD4+T（%）33.3 ± 8.7 36.6 ± 9.5 31.2 ± 9.3 34.9 ± 7.5 0.151 0.226 CD8+T（%）17.6 ± 4.2 19.3 ± 4.4 18.3 ± 3.8 20.6 ± 5.2 0.284 0.096 hs-CRP（g/L）23.5 ± 6.2 7.3 ± 2.0*24.7 ± 7.6 13.5 ± 4.2*0.284＜ 0.001 IL-6（pg/mL）302.5 ± 86.2 85.6 ± 21.3*288.6 ± 75.3 103.3 ± 25.3*0.115＜0.001

2.5 預(yù)后 研究組與對(duì)照組患者28 d 死亡率分別為20.8%（15/72）和29.6%（21/71），兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 1.451，P= 0.238）。

3 討論

人體的腸道屏障功能包括由上皮細(xì)胞緊密相連構(gòu)成的物理屏障功能以及由免疫細(xì)胞、免疫因子及微生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成的化學(xué)屏障作用［4］。在膿毒癥發(fā)生時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)毒素很容易穿過(guò)腸道屏障引發(fā)菌群移位、微生態(tài)失衡、腸道黏膜炎性損傷和通透性改變，由于腸道同時(shí)是人體重要的免疫器官和最大的營(yíng)養(yǎng)吸收器官［5］，其損傷很容易引發(fā)腹瀉、代謝障礙、電解質(zhì)紊亂、低白蛋白血癥等一系列連鎖反應(yīng)，甚至導(dǎo)致多器官損傷與休克［6］。正因如此，有學(xué)者［7-8］建議對(duì)于膿毒癥患者，應(yīng)積極糾正腸道微生態(tài)環(huán)境，以改善患者預(yù)后。肺部感染所致膿毒癥的原發(fā)部位雖然在肺部，但相當(dāng)一部分患者也伴隨有胃腸功能障礙［9］，本研究推測(cè)借助益生菌及時(shí)糾正腸道微生態(tài)平衡對(duì)肺部感染所致膿毒癥患者的臨床治療可能存在幫助，并從菌群分布、免疫功能、腸道屏障功能及患者治療結(jié)局等方面綜合分析了其應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，兩組在治療后APACHEⅡ與SOFA 評(píng)分均有降低，且研究組APACHEⅡ評(píng)分低于對(duì)照組，說(shuō)明兩組病情均得到了一定程度的改善，且研究組可能優(yōu)于對(duì)照組。腸道菌群分析結(jié)果顯示，兩組在治療后乳酸桿菌、雙歧桿菌含量有所升高，腸球菌與大腸埃希菌含量降低，且研究組乳酸桿菌、雙歧桿菌含量高于對(duì)照組，大腸埃希菌含量低于對(duì)照組。腸道固有菌群可以粗略地分為生理性細(xì)菌及條件致病菌兩大類，生理性細(xì)菌主要是指雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌，條件致病菌主要指腸桿菌、腸球菌、大腸埃希菌等兼性需氧菌［10-11］。既往研究［12］指出，膿毒癥發(fā)生時(shí)腸道很容易發(fā)生微生態(tài)坍塌現(xiàn)象，表現(xiàn)為菌群的種類減少，條件致病菌數(shù)量增多，并形成優(yōu)勢(shì)群體，取代生理性細(xì)菌的主導(dǎo)地位。從本研究結(jié)果來(lái)看，兩組治療后條件致病菌數(shù)量減少，同時(shí)益生菌數(shù)量增多，說(shuō)明兩種治療方式均能改善機(jī)體的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)。值得一提的是，對(duì)照組并未補(bǔ)充外源性的益生菌，患者腸道的菌群分布狀態(tài)也得到了改善，這說(shuō)明隨著膿毒癥病情的緩解，腸道菌群也受到了影響，膿毒癥病理生理與腸道菌群的作用極有可能是雙向的。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)治療前，兩組D-乳酸、內(nèi)毒素水平差異不顯著；治療后均顯著降低，且研究組低于對(duì)照組；同時(shí)，治療前兩組炎性因子hs-CRP、IL-6 水平差異也不顯著，治療后均有所降低，且研究組低于對(duì)照組。D-乳酸、內(nèi)毒素主要用于衡量腸道屏障功能，因D-乳酸是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物［13］，內(nèi)毒素則產(chǎn)生于腸道致病菌，在腸道屏障功能正常時(shí)，兩者均主要存在于腸道內(nèi)，只有腸道屏障功能受損時(shí)才可能透過(guò)腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)［14］。hs-CRP、IL-6 是經(jīng)典的炎性標(biāo)志物，主要用于衡量全身的炎性反應(yīng)狀態(tài)［15-16］。本研究結(jié)果說(shuō)明兩組在治療后腸道屏障功能和炎性反應(yīng)有所改善，且研究組優(yōu)于對(duì)照組。關(guān)于益生菌改善腸道屏障功能，抑制炎性反應(yīng)的報(bào)道已有較多，如學(xué)者王熙等［17］在膿毒癥休克的臨床治療中加用益生菌，患者腸道功能和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)得到了明顯改善；學(xué)者馬磊等［18］采用益生菌及丙氨酰谷氨酰，有效降低了膿毒癥患者腸道內(nèi)毒素及C 反應(yīng)蛋白、IL-6、IL-1β 等炎性介質(zhì)的水平，促進(jìn)了患者恢復(fù)。

此外，腸道免疫的效應(yīng)部位主要包括位于上皮內(nèi)基底膜上的腸上皮淋巴細(xì)胞和位于固有層的淋巴細(xì)胞，腸上皮淋巴細(xì)胞是人體內(nèi)最大的淋巴細(xì)胞群，其數(shù)量相當(dāng)于40% ～ 50%的外周淋巴細(xì)胞總數(shù)，在必要時(shí)可彌補(bǔ)循環(huán)免疫細(xì)胞的數(shù)量與功能。因此，腸道屏障與腸道免疫功能也能從很大程度上影響到人體的淋巴細(xì)胞總數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)兩組患者在治療后CD3+T 淋巴細(xì)胞的水平得到明顯提高，且研究組高于對(duì)照組，這說(shuō)明益生菌的應(yīng)用對(duì)提高患者的T 淋巴細(xì)胞水平，改善細(xì)胞免疫功能可能存在幫助。在感染時(shí)，致病菌釋放的內(nèi)毒素與脂多糖可與宿主的免疫細(xì)胞表面受體結(jié)合，引起多種致炎因子的過(guò)度釋放和免疫細(xì)胞的凋亡，因此膿毒癥患者常常存在免疫細(xì)胞過(guò)度消耗和數(shù)量減少的情況，這種消耗將進(jìn)一步削弱機(jī)體抗病原菌免疫功能，不利于病情恢復(fù)［19-20］。本研究結(jié)果說(shuō)明適當(dāng)補(bǔ)充益生菌對(duì)保護(hù)宿主的淋巴細(xì)胞，提高免疫功能也是有益的。

綜上所述，本研究數(shù)據(jù)說(shuō)明在肺部感染所致膿毒癥的臨床治療中加用雙歧桿菌，可從一定程度上改善腸道菌群分布，并緩解炎癥帶來(lái)的腸道屏障功能損傷，對(duì)促進(jìn)患者修復(fù)可能有一定幫助。然而，由于本研究病例數(shù)較少，研究數(shù)據(jù)可能受到個(gè)體差異的影響發(fā)生一定的偏倚，在未來(lái)的研究中，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證；加之雙歧桿菌用藥時(shí)間和觀察時(shí)間不長(zhǎng)，本研究只能了解到短期用藥對(duì)患者腸道屏障功能和腸道免疫帶來(lái)的影響，長(zhǎng)期用藥的作用與安全性尚不明確，也需要進(jìn)一步探討。

【Author contributions】LI Ming designed the study and wrote the article； SU Wei performed the experiments，collected date，statistica analysis and wrote the article； MA Shiheng supervised and directed the research，instructed the papers revision.All authors read and approved the final manuscript as submitted.