miR-4505靶向SOX-10在先天性巨結(jié)腸中的作用及機(jī)制

吳凱 王健俊 何繼賢 陳欽明 余岱岳 路羿 范凱斯 張夢真 楊六成

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院小兒外科 （廣州 510282）

先天性巨結(jié)腸（hirschsprung disease，HSCR）是一種常見的消化道畸形，發(fā)病率約為1/5 000 ～1/2 000，并有逐年增加的趨勢，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［1-2］。miRNA 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20 ～ 25 個核苷酸，具有抑制靶mRNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯或者能夠剪切靶mRNA，促進(jìn)其降解，在發(fā)育過程中起著重要作用。miRNA 在HSCR 中同樣具有重要的作用，如miR-145-3p［3］、miR-192-5p、miR-200a-3p［4］、miR-148a-3p［5］、miR-206［6］等均被證實與HSCR 的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。前期我們采用微陣列miRNA 芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-4505 在HSCR病變段腸管中高表達(dá)［3］，其在HSCR 中的具體作用仍不明確。本研究將進(jìn)一步證實miR-4505 對細(xì)胞功能的影響，通過生物信息學(xué)及分子生物學(xué)實驗闡明miR-4505 的作用分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料 收集自2018 年至2020 年期間在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院行手術(shù)的HSCR 病變段腸管及擴(kuò)張段腸管組織標(biāo)本，分別采用液氮及甲醛保存，所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確認(rèn)，標(biāo)本采集均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。人神經(jīng)母細(xì)胞株SH-SY5Y 由中國科學(xué)院上海研究所細(xì)胞庫提供。

1.1.2 主要試劑 miR-4505-mimics、miR-4505-inhibitors 及陰性對照（Negative control，NC）均為上海吉瑪生物科技公司產(chǎn)品，LipolifectmineTM2000 購自美國Thermofisher 公司。自美國Invitrogen 公司購買Trizol RNA 提取試劑盒，miRNeasy 抽提試劑盒為德國Qiagen 公司產(chǎn)品，cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA 熒光定量試劑盒及相關(guān)引物購自北京天根生化科技有限公司（表1）。熒光素酶報告檢測基因活性為美國Promega 公司產(chǎn)品，野生型及突變型SOX-10 質(zhì)粒由廣州銳博生物技術(shù)公司合成，CCK-8 為美國GLPbio 公司產(chǎn)品，SOX-10 一抗及羊抗兔二抗均為美國Abcam 公司產(chǎn)品。

表1 miR-4505qRT-PCR 的引物Tab.1 Sequences of primers for miR-4505

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 37 ℃水浴中復(fù)溫，離心后加入5 mL 含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。待細(xì)胞生長良好進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

消化細(xì)胞，將終濃度20 pmol miR-4505mimics、miR-4505inhibitors、NC 溶于50 μL Opti-MEM 中，混勻，將1 μL lipo2000 溶于50 μL Opti-MEM 中，混勻，接種于96 孔板中完成下一步實驗。

1.2.2 qRT-PCR 取細(xì)胞或研磨成粉末的組織標(biāo)本，TRIzol 裂解細(xì)胞獲取總RNA，隨即使用RNasey Mini Kit 進(jìn)行純化，鑒定RNA 純度，電泳方法檢測RNA 完整性，總RNA 于-80℃冰箱內(nèi)保存。隨后采用SYBR Green I 熒光法檢測miRNA，步驟如下：（1）取含有目的miRNA 總RNA 2 μg，給miRNA 的3'端加多聚PolyA 尾，Oligo（dT）-Universal Tag 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成對應(yīng)的cDNA，采用的條件為37 ℃，60 min，隨后95 ℃，5 min。（2）取miRNA 第一鏈的cDNA 液2 μL，加入miRNA qPCR Detection kit（SYBR Green），行熒光定量檢測。反應(yīng)條件：95 ℃10 min，1 個循環(huán)，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共45 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，計算miR-4505 的相對表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖 對數(shù)生長期細(xì)胞按每孔4 × 103細(xì)胞接種，加入100 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液，分別將miR-4505 mimics，NC 或miR-4505inhibitors，隨后加入LipolifectmainTM2000 轉(zhuǎn)染，于0、24、48、72、96 h 顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況，加入10 μL CCK-8，使用酶標(biāo)儀檢測各孔OD值，記錄吸光度后繪制生長曲線。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞遷移 轉(zhuǎn)染細(xì)胞以1 ×104個/孔的密度置入專用24 孔板上孔，下層加入10%FBS培養(yǎng)基600 μL，上層加入100 μL的2%FBS完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育72 h，隨后吸棄上室培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定及0.5%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-4505 的靶基因 使用miR-4505mimics、NC 及野生型、突變型SOX-10 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后采用進(jìn)行雙熒光報告基因檢測，48 h 后使用吸管吸去舊的培養(yǎng)液，加入報告基因細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞刮離后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，高速離心，取裂解產(chǎn)物5 μL，加入100 μL 反應(yīng)底物，檢測熒光酶活性。隨后再加入Stop&GloBReagent 100 μL，檢測讀取數(shù)值后計算相對表達(dá)量。

1.2.6 Western blot 裂解液裂解細(xì)胞后加入到EP管中，4 ℃ 12 000 r/min高速離心25 min，上清分裝保存。取出5 μL蛋白，BCA法定量后加入蛋白上樣緩沖液，配置濃縮膠及分離膠，加入到上樣孔，電泳。48 V 電轉(zhuǎn)50 min 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，TBS 漂洗，封閉液振蕩4 h，加入1∶1 000 的SOX-10 一抗，4 ℃過夜，漂洗后加入稀釋的二抗，加入ECL工作液，顯影和定影后采用凝膠成像系統(tǒng)處理蛋白條帶。

1.2.7 免疫組化 取等量組織標(biāo)本在60 ℃下烤片2 h 后進(jìn)行脫蠟水化，使用蒸餾水沖洗，微波修復(fù)法修復(fù)抗原。隨后加入過氧化氫及山羊抗血清進(jìn)行封閉，加入SOX-10 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1 h，DAB 顯色后使用蘇木素復(fù)染，二甲苯透明化處理后于顯微鏡下觀察。陰性對照采用0.1 mol/L PBS 替代一抗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用Graphpad prism5.0 進(jìn)行作圖，SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，多個樣本比較采用One-way ANOVE，CCK-8 的結(jié)果使用重復(fù)測量方差分析，兩樣本量之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，兩樣本率的比較采用χ2檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSCR 病變段及擴(kuò)張段腸管組織標(biāo)本中miR-4505 的表達(dá) HSCR 病變段腸管中miR-4505的相對表達(dá)量為6.187 ± 0.449，擴(kuò)張段腸管的miR-4505 的相對表達(dá)量為0.937 ± 0.104，HSCR 病變段腸管的miR-4505相對表達(dá)量高于擴(kuò)張段腸管，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 11.25，P= 0.000）。

2.2 qRT-PCR進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)染后對人神經(jīng)母細(xì)胞株的miR-4505 表達(dá)影響 PCR 結(jié)果采用one-way ANOVA 方差分析，轉(zhuǎn)染后各組的miR-4505 表達(dá)量有明顯差異，轉(zhuǎn)染miR-4505 mimics 后SH-SY5Y 的miR-4505 的表達(dá)量（12.22 ± 1.146）較NC 組（1.00 ±0.036）增加，而轉(zhuǎn)染miR-4505 inhibitors 后細(xì)胞的miR-4505 的表達(dá)量（0.196 ± 0.046）下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。

2.3 CCK-8 法檢測miR-4505 對人神經(jīng)母細(xì)胞株增殖的影響 各時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖有差異（F時間=9.34，P＜ 0.001），各處理組的細(xì)胞增殖也有差異（F處理組= 79.00，P＜ 0.001），時間和組別有交互效應(yīng)（F交互= 6.11，P= 0.002）。miR-4505 mimics 可使細(xì)胞的增殖能力減弱，這種趨勢可隨著時間延長而增強(qiáng)（P＜ 0.05），而miR-4505 inhibitors 可使細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（P＜ 0.05）。見表2。

表2 CCK-8 檢測miR-4505 對細(xì)胞增殖的影響Tab.2 The effect of miR-4505 on cell proliferation was detected by CCK-8±s

表2 CCK-8 檢測miR-4505 對細(xì)胞增殖的影響Tab.2 The effect of miR-4505 on cell proliferation was detected by CCK-8±s

分組miR-4505 mimics NC miR-4505 inhibitors 0 h 0.282 ± 0.013 0.285 ± 0.015 0.285 ± 0.013 24 h 0.333 ± 0.029 0.345 ± 0.030 0.358 ± 0.026 48 h 0.385 ± 0.038 0.452 ± 0.039 0.489 ± 0.042 72 h 0.448 ± 0.042 0.548 ± 0.046 0.587 ± 0.051 96 h 0.490 ± 0.048 0.641 ± 0.052 0.712 ± 0.058

2.4 Transwell 檢測miR-4505 對人神經(jīng)母細(xì)胞株遷移的影響 Transwell 法檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-4505的表達(dá)后細(xì)胞的遷移至下孔的細(xì)胞數(shù)為16.00 ±2.280，而陰性對照組為48.20 ± 6.344，而抑制miR-4505 表達(dá)后遷移至下層的細(xì)胞數(shù)為68.00 ±4.940，miR-4505 可以抑制細(xì)胞遷移。采用oneway ANOVA 方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理：結(jié)果提示各處理組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 8.40，P=0.008）。見圖1。

2.5 雙熒光素酶報告基因證實miR-4505 與靶基因SOX-10 的作用關(guān)系 與突變型SOX-10 質(zhì)粒相比，野生型SOX-10 質(zhì)粒可以降低miR-4505 的表達(dá)（t= 11.19，P＜ 0.001）。見表3。

表3 雙熒光素酶報告檢測miR-4505 與SOX-10 的3'-UTR 的關(guān)系Tab.3 Relationship between miR-4505 and the 3'-UTR of SOX-10 was detected by dual luciferase reports ±s

表3 雙熒光素酶報告檢測miR-4505 與SOX-10 的3'-UTR 的關(guān)系Tab.3 Relationship between miR-4505 and the 3'-UTR of SOX-10 was detected by dual luciferase reports ±s

分組野生型SOX-10突變型SOX-10 miR-4505 mimics 0.214 ± 0.065 1.020 ± 0.082 NC 1.081 ± 0.102 1.142 ± 0.121

2.6 Western blot證實miR-4505可下調(diào)細(xì)胞SOX-10 的表達(dá) 上調(diào)細(xì)胞miR-4505 的表達(dá)后細(xì)胞的SOX-10 蛋白含量（0.298 ± 0.021）較陰性對照組（0.455 ± 0.025）降低，SOX-10 蛋白條帶強(qiáng)度較淺，反之下調(diào)miR-4505 的表達(dá)后細(xì)胞的SOX-10 蛋白表達(dá)（0.559 ± 0.019）升高，SOX-10 蛋白條帶增粗，條帶灰度值經(jīng)內(nèi)參校正后采用one-way ANOVA方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果顯示各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 76.23，P= 0.000 7）。見圖2。

圖2 Western blot 檢測miR-4505 對細(xì)胞SOX-10 蛋白含量的影響Fig.2 The effect of miR-4505 on the SOX-10 protein was detected by Western blot

2.7 免疫組化證實SOX-10 在HSCR 狹窄段腸管中低表達(dá) HSCR狹窄段腸管中僅有4例有SOX-10表達(dá)，均呈弱陽性（10.0%），而其余36 例HSCR 患者狹窄段腸管的SOX-10 表達(dá)為陰性（90.0%），而擴(kuò)張段腸管SOX-10 表達(dá)均呈強(qiáng)陽性（100%），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 80.00，P＜ 0.001）。

3 討論

腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常被認(rèn)為是導(dǎo)致HSCR 的主要原因，遺傳因素及環(huán)境因素均可使胚胎發(fā)育過程中的腸神經(jīng)母細(xì)胞增殖、遷移及分化能力下降，使得腸神經(jīng)母細(xì)胞在腸管發(fā)育過程中質(zhì)量及數(shù)量不能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，遠(yuǎn)端腸管出現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，形成HSCR［7］。RET、GDNF、GFRa1、EDNRB、EDN3、SOX-l0、Sema3d、KIF26A、PHOX2B 等均被證實與HSCR 形成有關(guān)［8-11］。盡管有較多研究，當(dāng)前對HSCR 的認(rèn)識還不夠充分，當(dāng)前已知基因只能解釋HSCR 中約50%的家系病例和20%的散發(fā)病例［12］。

miRNA 在生長發(fā)育過程中起著重要的作用。近年來，國內(nèi)外也有很多研究證明miRNA 在HSCR形成過程中起著重要作用。如WANG 等［13］發(fā)現(xiàn)miR-195-5p 通過靶向GFRA4 抑制神經(jīng)母細(xì)胞的增殖和侵襲，參與HSCR 形成。JI 等［14］發(fā)現(xiàn)miR-92a可以通過調(diào)節(jié)KLF4/PI3K/AKT 通路抑制細(xì)胞的活力和遷移能力而在HSCR 中發(fā)揮作用。前期我們采用基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-4505 在HSCR 病變段腸管中高表達(dá)［3］。miR-4505在HSCR中的具體作用并不清楚，過往研究表明miR-4505在胃癌、口腔癌、焦慮癥等多種疾病中均存在異常表達(dá)，其作為一個調(diào)控基因廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、遷移及凋亡的調(diào)控。LIN等［15］發(fā)現(xiàn)LCN-1可以抑制miR-4505調(diào)控CAIX影響口腔癌細(xì)胞增殖及遷移。ZHANG等［16］發(fā)現(xiàn)miR-4505可下調(diào)HSPA12B的表達(dá)，加重LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。KIM 等［17］證實miR-4505的表達(dá)與黏膜內(nèi)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。我們的研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)miR-4505 在HSCR 病變段腸管中高表達(dá)，過表達(dá)miR-4505 可抑制細(xì)胞增殖及遷移，而敲低miR-4505 可促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移。miR-4505 是一個重要調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)育過程中可影響腸神經(jīng)母細(xì)胞功能，參與HSCR形成。

miRNA 本身并不能編碼蛋白，與靶基因的3'-UTR 結(jié)合抑制mRNA 翻譯，降解mRNA 以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄是其中非常重要的作用方式。細(xì)胞不同，miR-4505 可與不同的靶基因結(jié)合發(fā)揮不同作用。SOX-10 在外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著重要的作用，我們前期的研究表明SOX-10 在正常腸管肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元及膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中均有表達(dá)，而在HSCR 無神經(jīng)節(jié)腸管呈一致性降低［18］。通過敲除小鼠SOX-10 的等位基因?qū)?dǎo)致小鼠結(jié)腸末端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺陷癥［19］。而基因分析表明，在SOX-10結(jié)合位點(diǎn)中存在EDNRB 的結(jié)合區(qū)，SOX-10 可以調(diào)控RET 基因的表達(dá)，進(jìn)而影響外周神經(jīng)元的增殖、分化及遷移［20］。因此，SOX-10 是腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要上游調(diào)控因子，SOX-10 異常是導(dǎo)致HSCR 形成的重要原因。本研究利用TargetScan 及miRBase 預(yù)測miR-4505 的靶基因，初步確定SOX-10 作為miR-4505 的潛在靶基因。隨后采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-4505 可以與SOX-10 的3'-UTR 結(jié)合影響SOX-10 的表達(dá)。而在組織標(biāo)本中我們同樣發(fā)現(xiàn)SOX-10 在HSCR 病變段腸管中低表達(dá)，進(jìn)一步證實miR-4505 在HSCR 中發(fā)揮作用可能與抑制SOX-10 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，我們的研究表明miR-4505 與HSCR發(fā)病密切相關(guān)，其發(fā)揮作用可以與調(diào)控SOX-10 的表達(dá)影響神經(jīng)母細(xì)胞增殖及遷移，導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙有關(guān)。本研究為HSCR 的診治提供了新思路。本研究仍存在局限性，miR-4505 對腸神經(jīng)干細(xì)胞確切作用以及在體內(nèi)具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

【Author contributions】WU Kai designed experiment and wrote the article.WANG Jianjun，CHEN Qinming，HE Jixian，YU Daiyue，LU Yi performed the experiments and collected data.ZHANG Mengzhen，F(xiàn)AN Kaisi completed statistics.YANG Liucheng guided the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.