劉穎 陳先俊 肖川 袁佳 李清 李璐 楊金鳳 沈鋒
貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科 (貴陽 550004)
急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress syndrome,ARDS)是由多種肺內(nèi)、外致病因素引起的急性呼吸衰竭綜合征[1-2],肺泡內(nèi)大量纖維蛋白沉積是ARDS 重要的病理特征,其結(jié)果引起肺順應性降低、肺彌散和換氣功能受損等[3],是引起ARDS頑固性低氧血癥的重要機制[4]。研究[5-6]已證實,肺泡內(nèi)促凝增強及纖溶過度抑制是引起肺泡纖維蛋白沉積的主要原因,但其發(fā)生機制不清楚。近年研究[7-8]發(fā)現(xiàn),Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ,AECⅡ)對ARDS 肺泡內(nèi)促凝和纖溶抑制具有重要調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究顯示,在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下,AECII 細胞分泌和表達組織因子(tissue factor,TF)及纖溶酶原激活抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)增加[9-13],并由此對肺泡促凝及纖溶抑制進行調(diào)控。因此,我們使用該細胞作為本文的研究對象。
我們前期研究[14-17]發(fā)現(xiàn),NF-κB 信號通路對TF 及PAI-1 的表達和分泌具有調(diào)節(jié)作用,但調(diào)節(jié)機制尚不清楚,因此,基于該信號通路,尋找相關(guān)的調(diào)節(jié)基因,對完善ARDS 肺泡內(nèi)促凝增強及纖溶抑制的發(fā)生機制具有重要意義。我們對LPS損傷后的RLE-6TN 細胞進行RNA-seq 測序,通過生物信息分析,基于該信號通路找到了差異基因溶血磷脂酸受體1(lysophosphatidic acid receptor 1,LPAR1)。既往研究[18-22]證實抑制LPAR1 基因明顯減輕了NF-κB 信號通路的活化,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該信號通路對RLE-6TN 細胞中TF和PAI-1 的表達具有調(diào)控作用,推測LPAR1 通過影響NF-κB 信號通路進而對肺泡促凝增強及纖溶抑制進行調(diào)節(jié)。因此,本研究以大鼠AECⅡ細胞為研究對象,觀察LPAR1 對LPS 刺激下AECⅡ細胞中TF 和PAI-1 表達的影響。
1.1 細胞系 大鼠AECⅡ細胞株RLE-6TN 購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心。實驗過程中細胞處理措施符合醫(yī)學倫理學標準,已取得貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(編號:2304220)。
1.2 主要試劑 LPS(貨號:L8880)購自Solarbio 公司。LPAR1(貨號:ab23698)一抗購自美國Abcam公司;TF(貨號:NBP2-67731)一抗購自美國NOVUS 公司;PAI-1(貨號:66261-1-Ig)一抗購自Proteintech 中國公司;GAPDH(貨號:AP0063)一抗及羊抗鼠二抗均購自巴傲得生物科技有限公司;山羊抗兔二抗購自Jackson 公司。慢病毒購于北京擎科生物有限公司,靶向干擾LPAR1 的shRNA序列為5'-GCTTCTACAACGAGTCTATCG-3'。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR Premix Ex Taq 購自TaKaRa 生物科技有限公司。
1.3 篩選關(guān)鍵差異基因 使用edgeR 進行標準化并計算兩組樣品間的倍數(shù)變化和p-value,篩選差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。差異表達基因用P值和差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)的對數(shù)(logFC)表示,篩選標準為:P< 0.05 且|logFC| > 1,使用ggplot2 R 包將相關(guān)基因繪制成火山圖。進一步用clusterProfiler R 包對DEGs 做GO(GeneOntology)功能富集,富集分析的結(jié)果以P<0.05 作為入選標準,從中找到NF-κB 通路相關(guān)的差異基因。使用R 軟件heatmap R 包將差異基因繪制成基因熱圖,并進一步將通路和基因?qū)隒ytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建通路與相關(guān)基因網(wǎng)絡圖,找到與非負調(diào)控NF-κB通路密切相關(guān)的上調(diào)基因。
1.4 細胞培養(yǎng) 將細胞置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基,置于恒溫細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)至對數(shù)期,用含0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代。
1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染 根據(jù)預實驗MOI 加入病毒液進行感染,按照北京擎科生物公司提供的慢病毒使用手冊,在感染慢病毒后的72 h,置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況,后將細胞繼續(xù)培養(yǎng)于含Puromycin(8 μg/mL)的培養(yǎng)液中進行篩選,得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。
1.6 LPAR1 的動態(tài)表達及實驗分組 用LPS 刺激處于生長對數(shù)期的RLE-6TN 細胞6、12、24、48及72 h,檢測LPAR1 基因的動態(tài)表達水平,選取變化最明顯的時間點作為研究時間。RLE-6TN 細胞轉(zhuǎn)染LPAR1(sh-LPAR1)低表達慢病毒,空載慢病毒(sh-NC)作為對照。細胞分為對照組(PBS)、模型組(LPS)、模型+sh-LPAR1(LPS+sh-LPAR1)組和模型組+sh-NC(LPS+sh-NC)組。各組細胞分別加入PBS 和LPS 刺激24 h。
1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western blotting,WB)檢測LPAR1、TF、PAI-1 的蛋白表達 將給予處理的細胞放置于冰上裂解,收集裂解液離心后取上清液并使用BCA 試劑盒檢測蛋白水平。按Western blotting 檢測試劑盒操作說明檢測蛋白表達量。
1.8 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-q PCR)檢測LPAR1、TF、PAI-1的mRAN表達 使用TRIzol提取RLE-6TN的總RNA,并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成c DNA,采用95 ℃預變性2 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,共40 個循環(huán)的PCR 擴增,采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行量化。引物序列如下:LPAR1 正向:5'-ACTTCTTCGCTGGACTGG-3',反向:5'-CTGTGATGTGCCTCT-CGAT-3';TIFA 正向:5'-TGGACCTGCCTTACAAGT-G-3',反向:5'-GTATGGGGCTCTGCGTT-3';TF 正向:5'-ACTCAAGCACAGGAAAAAC-3',反向:5'-TGGAGAAAATCACGGCTTGTAC-3';PAI-1 正向:5'-GCCTGTTCCACAAGTCTGATG-3',反向:5'-ATGAACATGCTGAGGGTTTTCG-3';GAPDH 正向:5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3',反向:5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。
1.9 統(tǒng)計學方法 實驗結(jié)果以3 次重復實驗的均數(shù)±標準差表示。用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 NF-κB 信號通路相關(guān)的條目 對LPS 損傷后RLE-6TN 細胞進行RNA-seq 測序,與正常細胞比較,檢測到差異表達基因531 個(P< 0.05),其中上調(diào)基因201 個,下調(diào)基因330 個,并繪制成火山圖(圖1)。進一步對531 個差異基因進行GO 功能富集分析,富集結(jié)果共16 個差異表達基因映射到4 個NF-κB 信號通路相關(guān)條目,且具有顯著富集標準(P< 0.05,圖1)。
圖1 篩選NF-κB 信號通路相關(guān)的條目Fig.1 Screening for NF-κB signaling pathway-related entries
2.2 NF-κB 信號通路相關(guān)差異基因篩選 使用R軟件,將上述16 個差異基因繪制熱圖(圖2),同時我們將富集結(jié)果繪制成通路-基因靶點網(wǎng)絡圖(圖2),找到LPAR1、TIFA(具有叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域的腫瘤壞死因子受體相互作用蛋白)為上調(diào)且非負調(diào)控NF-κB 信號通路的差異基因。進一步我們通過預實驗發(fā)現(xiàn),LPS 刺激下RLE-6TN 細胞中LPAR1 表達升高(P< 0.05),而TIFA 的表達卻減少(P< 0.05,圖2),因此,本研究選擇LPAR1 進行后續(xù)實驗。
圖2 NF-κB 信號通路相關(guān)差異基因的篩選Fig.2 Screening differential genes related to NF-κB signaling pathway
2.3 LPAR1 在LPS 刺激RLE-6TN 細胞中的動態(tài)變化 WB 和RT-q PCR 結(jié)果顯示,LPS 處理6 h 后,LPAR1 mRNA 和蛋白表達開始升高,24 h 達到頂峰,之后逐漸降低(圖3)。各時間點的表達均高于正常細胞LPAR1 表達水平(P< 0.05)。基于上述結(jié)果,我們選擇LPS 刺激細胞24 h 進行后續(xù)相關(guān)實驗。
圖3 各組RLE-6TN 細胞中LPAR1 的表達Fig.3 Expression of LPAR1 in each group of RLE-6TN cells
2.4 轉(zhuǎn)染慢病毒抑制LPAR1 的表達 RT-qPCR及WB 結(jié)果顯示,與sh-NC 組相比,sh-LPAR1 組成功低敲了細胞中LPAR1 的表達(均P< 0.05)。NC組與sh-NC 組相比LPAR1 的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖4)。
圖4 低表達LPAR1 的慢病毒轉(zhuǎn)染Fig.4 Lentiviral transfection with low expression of LPAR1
2.5 低表達LPAR1 對LPS 誘導下RLE-6TN 細胞中TF 表達的影響 LPS 刺激24 h 后,RLE-6TN 細胞中TF 的mRNA 和蛋白的表達水平與NC 組比較顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05);低敲LPAR1 基因后,與sh-NC 組相比TF 的表達水平顯著降低(P< 0.05),接近正常對照水平(圖5)。
圖5 各組RLE-6TN 細胞中TF 的表達Fig.5 Expression of TF in each group of RLE-6TN cells
2.6 低表達LPAR1 對LPS 誘導下RLE-6TN 細胞中PAI-1 表達的影響 LPS 刺激在RLE-6TN 細胞中引起PAI-1mRNA 和蛋白表達量升高(P< 0.05);低敲LPAR1 基因后,與sh-NC 組相比PAI-1 的表達水平顯著降低(均P< 0.05),接近正常對照水平(圖6)。
圖6 各組RLE-6TN 細胞中PAI-1 的表達Fig.6 Expression of PAI-1 in each group of RLE-6TN cells
AECⅡ是ARDS 發(fā)生發(fā)展過程中受損的主要靶細胞之一,對ARDS 肺泡促凝和纖溶抑制具有重要作用,因此我們選擇該類細胞作為本文研究對象。在課題組前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)以5 μg/mL的LPS 濃度刺激RLE-6TN 細胞,既未影響細胞活力,又能明顯刺激TF、PAI-1 的表達[12]。因此,本實驗仍采用5 μg/mL 的LPS 濃度刺激RLE-6TN 細胞,模擬革蘭陰性桿菌誘導的ARDS 細胞損傷模型。
如前所述,肺泡促凝增強和纖溶過度抑制導致的肺泡內(nèi)大量纖維蛋白沉積是ARDS 重要特征,在探討其發(fā)生機制中,課題組研究結(jié)果證實,NF-κB 信號通路參與對肺泡內(nèi)促凝增強及纖溶抑制的調(diào)節(jié)[14-15],但調(diào)節(jié)機制不清楚。因此,我們對LPS 損傷后的RLE-6TN 細胞進行RNA-seq 測序,通過生物信息學分析,以NF-κB 為核心,找到上調(diào)且非負調(diào)控NF-κB 信號通路的差異基因LPAR1、TIFA,進一步通過RT-q PCR 進行驗證,發(fā)現(xiàn)在LPS刺激下RLE-6TN 細胞中LPAR1 表達升高,而TIFA的表達卻減少,因此我們對LPAR1 基因進行研究。通過LPS 處理RLE-6TN 細胞6、12、24、48、72 h 后,發(fā)現(xiàn)6 h 后LPAR1 mRNA 和蛋白表達開始升高,24 h 達到頂峰,之后逐漸降低,故我們選擇LPS 刺激細胞24 h 進行實驗。
觀察LPAR1 對細胞中TF 和PAI-1 的調(diào)節(jié)作用是本文核心的研究內(nèi)容。TF 和PAI-1 是引起ARDS 肺泡促凝增強和纖溶過度抑制的關(guān)鍵因子。TF 促使凝血酶原變成凝血酶,后者使纖維蛋白原變成纖維蛋白增加,同時PAI-1 抑制纖維蛋白的溶解,兩者共同作用導致肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積增加[23-26]。本研究顯示,LPS 刺激后,RLE-6TN細胞中TF、PAI-1 表達明顯升高,與我們前期研究結(jié)果一致[11-13]。在此基礎(chǔ)上,我們通過shRNA 技術(shù)調(diào)低了LPAR1 基因表達,結(jié)果顯示低表達LPAR1顯著降低了TF 和PAI-1 的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,提示LPAR1 對LPS 刺激下TF 和PAI-1 表達具有調(diào)控作用。本文中,我們設(shè)置了慢病毒轉(zhuǎn)染陰性對照組,結(jié)果顯示該組TF 和PAI-1 水平與單純LPS 組相仿,因此可以排除慢病毒本身對TF 和PAI-1 的影響。
鑒于我們前期已證實NF-κB 對TF 和PAI-1 的調(diào)節(jié)作用,結(jié)合本文發(fā)現(xiàn)LPAR1 對TF 和PAI-1 的影響,因此明確LPAR1 與NF-κB 信號通路之間的關(guān)系將對探討ARDS 肺泡促凝增強和纖溶過度抑制的發(fā)生機制具有重要作用。既往研究[18-21]表明,LPAR1 對NF-κB 信號通路具有調(diào)節(jié)作用。本文中,通過RNA-seq 測序和GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn),LPAR1 與NF-κB 通路關(guān)系密切。推測LPAR1通過NF-κB 信號通路對LPS 刺激下RLE-6TN 細胞中TF 和PAI-1 表達進行調(diào)節(jié)。但兩者到底通過怎樣的相互作用方式對ARDS 肺泡促凝和纖溶抑制進行調(diào)節(jié),本課題組將繼續(xù)深入研究。
本實驗存在的不足:(1)由于細胞實驗與臨床存在一定差異,本實驗通過得出的結(jié)果不一定完全符合臨床,因此還需要進一步臨床研究證實。(2)本研究只低表達了LPAR1 基因,可進一步過表達LPAR1 進行驗證。(3)LPAR1 基因是否通過NF-κB 信號通路來影響LPS 刺激下RLE-6TN 細胞中TF 和PAI-1 表達和分泌,需進一步驗證。綜上所述,LPAR1 基因?qū)PS 刺激下RLE-6TN 細胞TF和PAI-1 的表達具有調(diào)節(jié)作用。該基因有望成為糾正ARDS 肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積的的新靶標。
【Author contributions】LIU Ying performed the experiments and wrote the article.CHEN Xianjun,XIAO Chuan,YUAN Jia and LI Qing performed the experiments.LI Lu and YANG Jinfeng collected data.SHEN Feng designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.