劉穎 陳先俊 肖川 袁佳 李清 李璐 楊金鳳 沈鋒
貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 (貴陽(yáng) 550004)
急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress syndrome,ARDS)是由多種肺內(nèi)、外致病因素引起的急性呼吸衰竭綜合征[1-2],肺泡內(nèi)大量纖維蛋白沉積是ARDS 重要的病理特征,其結(jié)果引起肺順應(yīng)性降低、肺彌散和換氣功能受損等[3],是引起ARDS頑固性低氧血癥的重要機(jī)制[4]。研究[5-6]已證實(shí),肺泡內(nèi)促凝增強(qiáng)及纖溶過(guò)度抑制是引起肺泡纖維蛋白沉積的主要原因,但其發(fā)生機(jī)制不清楚。近年研究[7-8]發(fā)現(xiàn),Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ,AECⅡ)對(duì)ARDS 肺泡內(nèi)促凝和纖溶抑制具有重要調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究顯示,在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激下,AECII 細(xì)胞分泌和表達(dá)組織因子(tissue factor,TF)及纖溶酶原激活抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)增加[9-13],并由此對(duì)肺泡促凝及纖溶抑制進(jìn)行調(diào)控。因此,我們使用該細(xì)胞作為本文的研究對(duì)象。
我們前期研究[14-17]發(fā)現(xiàn),NF-κB 信號(hào)通路對(duì)TF 及PAI-1 的表達(dá)和分泌具有調(diào)節(jié)作用,但調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚,因此,基于該信號(hào)通路,尋找相關(guān)的調(diào)節(jié)基因,對(duì)完善ARDS 肺泡內(nèi)促凝增強(qiáng)及纖溶抑制的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。我們對(duì)LPS損傷后的RLE-6TN 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序,通過(guò)生物信息分析,基于該信號(hào)通路找到了差異基因溶血磷脂酸受體1(lysophosphatidic acid receptor 1,LPAR1)。既往研究[18-22]證實(shí)抑制LPAR1 基因明顯減輕了NF-κB 信號(hào)通路的活化,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路對(duì)RLE-6TN 細(xì)胞中TF和PAI-1 的表達(dá)具有調(diào)控作用,推測(cè)LPAR1 通過(guò)影響NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)而對(duì)肺泡促凝增強(qiáng)及纖溶抑制進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此,本研究以大鼠AECⅡ細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察LPAR1 對(duì)LPS 刺激下AECⅡ細(xì)胞中TF 和PAI-1 表達(dá)的影響。
1.1 細(xì)胞系 大鼠AECⅡ細(xì)胞株RLE-6TN 購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞處理措施符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),已取得貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):2304220)。
1.2 主要試劑 LPS(貨號(hào):L8880)購(gòu)自Solarbio 公司。LPAR1(貨號(hào):ab23698)一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;TF(貨號(hào):NBP2-67731)一抗購(gòu)自美國(guó)NOVUS 公司;PAI-1(貨號(hào):66261-1-Ig)一抗購(gòu)自Proteintech 中國(guó)公司;GAPDH(貨號(hào):AP0063)一抗及羊抗鼠二抗均購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司;山羊抗兔二抗購(gòu)自Jackson 公司。慢病毒購(gòu)于北京擎科生物有限公司,靶向干擾LPAR1 的shRNA序列為5'-GCTTCTACAACGAGTCTATCG-3'。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR Premix Ex Taq 購(gòu)自TaKaRa 生物科技有限公司。
1.3 篩選關(guān)鍵差異基因 使用edgeR 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并計(jì)算兩組樣品間的倍數(shù)變化和p-value,篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。差異表達(dá)基因用P值和差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)的對(duì)數(shù)(logFC)表示,篩選標(biāo)準(zhǔn)為:P< 0.05 且|logFC| > 1,使用ggplot2 R 包將相關(guān)基因繪制成火山圖。進(jìn)一步用clusterProfiler R 包對(duì)DEGs 做GO(GeneOntology)功能富集,富集分析的結(jié)果以P<0.05 作為入選標(biāo)準(zhǔn),從中找到NF-κB 通路相關(guān)的差異基因。使用R 軟件heatmap R 包將差異基因繪制成基因熱圖,并進(jìn)一步將通路和基因?qū)隒ytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建通路與相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)圖,找到與非負(fù)調(diào)控NF-κB通路密切相關(guān)的上調(diào)基因。
1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基,置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,用含0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。
1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)MOI 加入病毒液進(jìn)行感染,按照北京擎科生物公司提供的慢病毒使用手冊(cè),在感染慢病毒后的72 h,置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況,后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含Puromycin(8 μg/mL)的培養(yǎng)液中進(jìn)行篩選,得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
1.6 LPAR1 的動(dòng)態(tài)表達(dá)及實(shí)驗(yàn)分組 用LPS 刺激處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的RLE-6TN 細(xì)胞6、12、24、48及72 h,檢測(cè)LPAR1 基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平,選取變化最明顯的時(shí)間點(diǎn)作為研究時(shí)間。RLE-6TN 細(xì)胞轉(zhuǎn)染LPAR1(sh-LPAR1)低表達(dá)慢病毒,空載慢病毒(sh-NC)作為對(duì)照。細(xì)胞分為對(duì)照組(PBS)、模型組(LPS)、模型+sh-LPAR1(LPS+sh-LPAR1)組和模型組+sh-NC(LPS+sh-NC)組。各組細(xì)胞分別加入PBS 和LPS 刺激24 h。
1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting,WB)檢測(cè)LPAR1、TF、PAI-1 的蛋白表達(dá) 將給予處理的細(xì)胞放置于冰上裂解,收集裂解液離心后取上清液并使用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白水平。按Western blotting 檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)蛋白表達(dá)量。
1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-q PCR)檢測(cè)LPAR1、TF、PAI-1的mRAN表達(dá) 使用TRIzol提取RLE-6TN的總RNA,并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成c DNA,采用95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,共40 個(gè)循環(huán)的PCR 擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行量化。引物序列如下:LPAR1 正向:5'-ACTTCTTCGCTGGACTGG-3',反向:5'-CTGTGATGTGCCTCT-CGAT-3';TIFA 正向:5'-TGGACCTGCCTTACAAGT-G-3',反向:5'-GTATGGGGCTCTGCGTT-3';TF 正向:5'-ACTCAAGCACAGGAAAAAC-3',反向:5'-TGGAGAAAATCACGGCTTGTAC-3';PAI-1 正向:5'-GCCTGTTCCACAAGTCTGATG-3',反向:5'-ATGAACATGCTGAGGGTTTTCG-3';GAPDH 正向:5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3',反向:5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)的條目 對(duì)LPS 損傷后RLE-6TN 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序,與正常細(xì)胞比較,檢測(cè)到差異表達(dá)基因531 個(gè)(P< 0.05),其中上調(diào)基因201 個(gè),下調(diào)基因330 個(gè),并繪制成火山圖(圖1)。進(jìn)一步對(duì)531 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析,富集結(jié)果共16 個(gè)差異表達(dá)基因映射到4 個(gè)NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)條目,且具有顯著富集標(biāo)準(zhǔn)(P< 0.05,圖1)。
圖1 篩選NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)的條目Fig.1 Screening for NF-κB signaling pathway-related entries
2.2 NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)差異基因篩選 使用R軟件,將上述16 個(gè)差異基因繪制熱圖(圖2),同時(shí)我們將富集結(jié)果繪制成通路-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2),找到LPAR1、TIFA(具有叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域的腫瘤壞死因子受體相互作用蛋白)為上調(diào)且非負(fù)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路的差異基因。進(jìn)一步我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LPS 刺激下RLE-6TN 細(xì)胞中LPAR1 表達(dá)升高(P< 0.05),而TIFA 的表達(dá)卻減少(P< 0.05,圖2),因此,本研究選擇LPAR1 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖2 NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)差異基因的篩選Fig.2 Screening differential genes related to NF-κB signaling pathway
2.3 LPAR1 在LPS 刺激RLE-6TN 細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化 WB 和RT-q PCR 結(jié)果顯示,LPS 處理6 h 后,LPAR1 mRNA 和蛋白表達(dá)開始升高,24 h 達(dá)到頂峰,之后逐漸降低(圖3)。各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均高于正常細(xì)胞LPAR1 表達(dá)水平(P< 0.05)?;谏鲜鼋Y(jié)果,我們選擇LPS 刺激細(xì)胞24 h 進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
圖3 各組RLE-6TN 細(xì)胞中LPAR1 的表達(dá)Fig.3 Expression of LPAR1 in each group of RLE-6TN cells
2.4 轉(zhuǎn)染慢病毒抑制LPAR1 的表達(dá) RT-qPCR及WB 結(jié)果顯示,與sh-NC 組相比,sh-LPAR1 組成功低敲了細(xì)胞中LPAR1 的表達(dá)(均P< 0.05)。NC組與sh-NC 組相比LPAR1 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4)。
圖4 低表達(dá)LPAR1 的慢病毒轉(zhuǎn)染Fig.4 Lentiviral transfection with low expression of LPAR1
2.5 低表達(dá)LPAR1 對(duì)LPS 誘導(dǎo)下RLE-6TN 細(xì)胞中TF 表達(dá)的影響 LPS 刺激24 h 后,RLE-6TN 細(xì)胞中TF 的mRNA 和蛋白的表達(dá)水平與NC 組比較顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05);低敲LPAR1 基因后,與sh-NC 組相比TF 的表達(dá)水平顯著降低(P< 0.05),接近正常對(duì)照水平(圖5)。
圖5 各組RLE-6TN 細(xì)胞中TF 的表達(dá)Fig.5 Expression of TF in each group of RLE-6TN cells
2.6 低表達(dá)LPAR1 對(duì)LPS 誘導(dǎo)下RLE-6TN 細(xì)胞中PAI-1 表達(dá)的影響 LPS 刺激在RLE-6TN 細(xì)胞中引起PAI-1mRNA 和蛋白表達(dá)量升高(P< 0.05);低敲LPAR1 基因后,與sh-NC 組相比PAI-1 的表達(dá)水平顯著降低(均P< 0.05),接近正常對(duì)照水平(圖6)。
圖6 各組RLE-6TN 細(xì)胞中PAI-1 的表達(dá)Fig.6 Expression of PAI-1 in each group of RLE-6TN cells
AECⅡ是ARDS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中受損的主要靶細(xì)胞之一,對(duì)ARDS 肺泡促凝和纖溶抑制具有重要作用,因此我們選擇該類細(xì)胞作為本文研究對(duì)象。在課題組前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)以5 μg/mL的LPS 濃度刺激RLE-6TN 細(xì)胞,既未影響細(xì)胞活力,又能明顯刺激TF、PAI-1 的表達(dá)[12]。因此,本實(shí)驗(yàn)仍采用5 μg/mL 的LPS 濃度刺激RLE-6TN 細(xì)胞,模擬革蘭陰性桿菌誘導(dǎo)的ARDS 細(xì)胞損傷模型。
如前所述,肺泡促凝增強(qiáng)和纖溶過(guò)度抑制導(dǎo)致的肺泡內(nèi)大量纖維蛋白沉積是ARDS 重要特征,在探討其發(fā)生機(jī)制中,課題組研究結(jié)果證實(shí),NF-κB 信號(hào)通路參與對(duì)肺泡內(nèi)促凝增強(qiáng)及纖溶抑制的調(diào)節(jié)[14-15],但調(diào)節(jié)機(jī)制不清楚。因此,我們對(duì)LPS 損傷后的RLE-6TN 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 測(cè)序,通過(guò)生物信息學(xué)分析,以NF-κB 為核心,找到上調(diào)且非負(fù)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路的差異基因LPAR1、TIFA,進(jìn)一步通過(guò)RT-q PCR 進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在LPS刺激下RLE-6TN 細(xì)胞中LPAR1 表達(dá)升高,而TIFA的表達(dá)卻減少,因此我們對(duì)LPAR1 基因進(jìn)行研究。通過(guò)LPS 處理RLE-6TN 細(xì)胞6、12、24、48、72 h 后,發(fā)現(xiàn)6 h 后LPAR1 mRNA 和蛋白表達(dá)開始升高,24 h 達(dá)到頂峰,之后逐漸降低,故我們選擇LPS 刺激細(xì)胞24 h 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
觀察LPAR1 對(duì)細(xì)胞中TF 和PAI-1 的調(diào)節(jié)作用是本文核心的研究?jī)?nèi)容。TF 和PAI-1 是引起ARDS 肺泡促凝增強(qiáng)和纖溶過(guò)度抑制的關(guān)鍵因子。TF 促使凝血酶原變成凝血酶,后者使纖維蛋白原變成纖維蛋白增加,同時(shí)PAI-1 抑制纖維蛋白的溶解,兩者共同作用導(dǎo)致肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積增加[23-26]。本研究顯示,LPS 刺激后,RLE-6TN細(xì)胞中TF、PAI-1 表達(dá)明顯升高,與我們前期研究結(jié)果一致[11-13]。在此基礎(chǔ)上,我們通過(guò)shRNA 技術(shù)調(diào)低了LPAR1 基因表達(dá),結(jié)果顯示低表達(dá)LPAR1顯著降低了TF 和PAI-1 的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,提示LPAR1 對(duì)LPS 刺激下TF 和PAI-1 表達(dá)具有調(diào)控作用。本文中,我們?cè)O(shè)置了慢病毒轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組,結(jié)果顯示該組TF 和PAI-1 水平與單純LPS 組相仿,因此可以排除慢病毒本身對(duì)TF 和PAI-1 的影響。
鑒于我們前期已證實(shí)NF-κB 對(duì)TF 和PAI-1 的調(diào)節(jié)作用,結(jié)合本文發(fā)現(xiàn)LPAR1 對(duì)TF 和PAI-1 的影響,因此明確LPAR1 與NF-κB 信號(hào)通路之間的關(guān)系將對(duì)探討ARDS 肺泡促凝增強(qiáng)和纖溶過(guò)度抑制的發(fā)生機(jī)制具有重要作用。既往研究[18-21]表明,LPAR1 對(duì)NF-κB 信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用。本文中,通過(guò)RNA-seq 測(cè)序和GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn),LPAR1 與NF-κB 通路關(guān)系密切。推測(cè)LPAR1通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路對(duì)LPS 刺激下RLE-6TN 細(xì)胞中TF 和PAI-1 表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。但兩者到底通過(guò)怎樣的相互作用方式對(duì)ARDS 肺泡促凝和纖溶抑制進(jìn)行調(diào)節(jié),本課題組將繼續(xù)深入研究。
本實(shí)驗(yàn)存在的不足:(1)由于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與臨床存在一定差異,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)得出的結(jié)果不一定完全符合臨床,因此還需要進(jìn)一步臨床研究證實(shí)。(2)本研究只低表達(dá)了LPAR1 基因,可進(jìn)一步過(guò)表達(dá)LPAR1 進(jìn)行驗(yàn)證。(3)LPAR1 基因是否通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路來(lái)影響LPS 刺激下RLE-6TN 細(xì)胞中TF 和PAI-1 表達(dá)和分泌,需進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述,LPAR1 基因?qū)PS 刺激下RLE-6TN 細(xì)胞TF和PAI-1 的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。該基因有望成為糾正ARDS 肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積的的新靶標(biāo)。
【Author contributions】LIU Ying performed the experiments and wrote the article.CHEN Xianjun,XIAO Chuan,YUAN Jia and LI Qing performed the experiments.LI Lu and YANG Jinfeng collected data.SHEN Feng designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.