BMI-1抑制劑PTC-596對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響

李玉玲 楊建林 崔芝 王靜 呂亞豐 曹春雨

三峽大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （湖北宜昌 443002）

乳腺癌是全世界女性癌癥相關(guān)第二大死亡原因，也是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］。目前手術(shù)切除、放化療、激素治療和靶向治療是最常見(jiàn)的乳腺癌臨床治療手段，雖然疾病治愈率有所提高，但晚期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者5 年生存期仍不足30%［2-3］，且手術(shù)和長(zhǎng)期放、化療的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。因此，迫切需要尋找更加安全高效的靶向藥物用于治療乳腺癌。

原癌基因BMI-1（B-cell-specificmoloney murine leukemia virus insection site 1，BMI-1）是在小鼠淋巴瘤中被鑒定的原癌基因，屬于多梳基因家族（polycombgroup genes，PcG）成員之一，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖與分化［4］。已證實(shí)高表達(dá)BMI-1 不但與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤形成有關(guān)，而且與腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)，也是惡性腫瘤預(yù)后不良的病理指征［5-7］。因此BMI-1 成為癌癥治療有效新靶點(diǎn)［8-9］。目前研究［10］表明BMI-1 在乳腺癌組織中高表達(dá)，可作為乳腺癌治療的關(guān)鍵靶向因素。PTC-596 是新近發(fā)現(xiàn)的特異性BMI-1 抑制劑，可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)白血病、膠質(zhì)瘤和淋巴瘤等發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［11-14］。但PTC-596 作為BMI-1抑制劑對(duì)乳腺癌治療作用的研究目前尚未有報(bào)道，本研究探索PTC-596 對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的殺傷作用及其可能的機(jī)制，以期為PTC-596 作為臨床抗腫瘤新藥和乳腺癌新型靶向藥物治療的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海），由腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。PTC-596（荷蘭Specs 生物特殊化合物公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美國(guó)Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)BI 公司）、青霉素/鏈霉素雙抗（天津?yàn)笊镉邢挢?zé)任公司）；RIPA蛋白裂解液（武漢Servicebio 公司）；BIM-1 抗體、Bax 抗體、Bcl-2抗體、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抗體、Cyclin B1 抗體、Cyclin D抗體、P21 抗體、β-actin 抗體（武漢三鷹Proteintech公司）；ECL 超敏顯影液（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、FITC-Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒（南京Vazyme 公司）；ROS 活性氧檢測(cè)試劑盒、JC-1 檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物公司）。Western blot 電泳儀、電泳及轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；TE2000-S 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；FACSVerse 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；ChemiScope mini 化學(xué)發(fā)光成像顯影儀（上海勤翔公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、PTC-596 藥物配置 用含10% 胎牛血清的DMED 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)MCF-7 細(xì)胞，待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。

PTC-596 干粉溶解于DMSO，配制終濃度為20 mmol/L 的藥物母液，-20 ℃低溫儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)中用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.3 CCK8法檢測(cè)PTC-596對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7 細(xì)胞懸液接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（1.0 × 103個(gè)細(xì)胞/孔）繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，設(shè)無(wú)培養(yǎng)細(xì)胞的空孔為空白組，無(wú)PTC-596 的DMEM（含等量藥物溶劑DMSO）培養(yǎng)為陰性對(duì)照組，和換終濃度分別為12.5、25、50、100、200 nmol/L PTC-596 的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入CCK8試劑孵育1 h 后，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度OD值。計(jì)算PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：［1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.4 細(xì)胞分組 以1.3 步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，PTC-596 處理48 h 后，對(duì)MCF-7 細(xì)胞的IC50值為（49.33 ± 7.02）nmol/L。后續(xù)研究分3 組，均培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以不含PTC-596 的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液（含等量藥物溶劑DMSO）培養(yǎng)組為陰性對(duì)照組，以分別含25、50 nmol/L 濃度PTC-596 的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)組為低、高藥物濃度實(shí)驗(yàn)組。

1.5 PI 單染/流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PTC-596 對(duì)MCF-7細(xì)胞周期影響 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MCF-7細(xì)胞，室溫1 000 r/min 離心3 min 獲得細(xì)胞沉淀，細(xì)胞用75%乙醇（1 × PBS配制）重懸后4 ℃固定過(guò)夜。PBS 洗滌細(xì)胞后，用含有0.1% TritonX-100、50 μg/L Rnase 和10 μg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）的PBS 染液于37 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.6 PI/FITC-Annexin V 雙染/流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡影響 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MCF-7 細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，樣品細(xì)胞經(jīng)FITC-Annexin V 和PI 避光染色15 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)量，以PI-/FITCAnnexin V+和PI+/FITC-Annexin V+為細(xì)胞凋亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 DCFH-DA 探針/流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平影響 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MCF-7 細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入1 mL DCFH-DA 探針工作液于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 重復(fù)洗滌細(xì)胞3 次，室溫1 000 r/min 離心5 min 收集沉淀細(xì)胞，PBS 重懸細(xì)胞樣品后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF 熒光強(qiáng)度。DCFH-DA 為無(wú)熒光的小分子探針，可被細(xì)胞中的酯酶水解和活性氧氧化生成具有熒光的DCF，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量可依據(jù)DCF 熒光強(qiáng)度體現(xiàn)。

1.8 JC-1探針/流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PTC-596對(duì)MCF-7 細(xì)胞線粒體膜電位影響 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MCF-7 細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入JC-1染色工作液于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用預(yù)冷的JC-1 染色緩沖液重復(fù)洗滌細(xì)胞3 次，4 ℃1 000 r/min 離心5 min 收集沉淀細(xì)胞，JC-1 染色緩沖液重懸后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅、綠熒光強(qiáng)度。JC-1 是用于檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，細(xì)胞線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 在線粒體基質(zhì)中聚集形成聚合物，發(fā)出紅色熒光；當(dāng)細(xì)胞線粒體膜電位降低，JC-1 呈單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。線粒體去極化狀態(tài)可依據(jù)紅、綠熒光強(qiáng)度判斷。

1.9 Western blot 檢測(cè)PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞BIM-1 蛋白、周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MCF-7 細(xì)胞，加入RIPA 裂解液混勻后置于冰上30 min 裂解細(xì)胞，經(jīng)過(guò)4 ℃、12 000 r/min 離心15 min 后，取上清用BCA 法測(cè)定其總蛋白濃度，分別將蛋白量為50 μg/樣的上清液與上樣緩沖液混合，100 ℃水浴加熱10 min。所得各組樣品蛋白依次經(jīng)過(guò)SDS-PAGE 電泳分離，PVDF 膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂牛奶室溫封閉，目的蛋白抗體4 ℃孵育過(guò)夜，和對(duì)應(yīng)二抗室溫結(jié)合2 h 后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并記錄結(jié)果，灰度分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 22.0、Image-J 等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較采用t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC-596抑制MCF-7細(xì)胞增殖 CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示PTC-596 具有高效抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的作用（表1），且抑制效果隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。計(jì)算PTC-596 處理MCF-7 細(xì)胞48 h 的IC50值為（49.33 ± 7.02）nmol/L。以此為依據(jù)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究以PTC-596 終濃度分別為25、50 nmol/L 處理48 h 的MCF-7 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以0 nmol/L PTC-596處理的細(xì)胞為對(duì)照組進(jìn)行。

表1 PTC-596 抑制MCF-7 細(xì)胞增殖Tab.1 SI-4650 inhibited proliferation of SGC-7901 cells ±s，%

表1 PTC-596 抑制MCF-7 細(xì)胞增殖Tab.1 SI-4650 inhibited proliferation of SGC-7901 cells ±s，%

注：與對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

時(shí)間PTC-596 100 nmol/L 47.74 ± 4.04**77.11 ± 3.68**97.61 ± 1.59**0 nmol/L 0.00 ± 1.86 0.00 ± 2.95 0.00 ± 2.84 12.5 nmol/L 8.24 ± 3.72 24.57 ± 3.19**33.11 ± 3.21**24 h 48 h 72 h 25 nmol/L 22.84 ± 3.17**32.22 ± 3.63**47.97 ± 3.00**50 nmol/L 34.88 ± 2.63**55.22 ± 4.27**69.54 ± 2.18**

2.2 PTC-596 誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞發(fā)生G2/M 期周期阻滯 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7 細(xì)胞周期結(jié)果顯示，PTC-596 處理后，MCF-7 細(xì)胞G2/M 期細(xì)胞比例可高達(dá)83.31%，G0/G1期和S 期細(xì)胞比例從51.56%和32.92%同步減少至0.19%和15.5%。Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，PTC-596 處理組細(xì)胞中Cyclin B1 與p21 表達(dá)從0.22、0.15上調(diào)至0.53和0.33，Cyclin D1表達(dá)從0.9 顯著減少至0.64。與對(duì)照組相比，以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。提示PTC-596 可能通過(guò)干擾周期蛋白表達(dá)，抑制MCF-7 細(xì)胞分裂，將MCF-7 細(xì)胞阻滯在G2/M 期（表2，圖1 ）。

圖1 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞周期和周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of on cell cycle and the expressions of cell cycle related proteins in MCF-7 cells

表2 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞周期的影響Tab.2 Effect of PTC-596 on cell cycle of MCF-7 cells±s

表2 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞周期的影響Tab.2 Effect of PTC-596 on cell cycle of MCF-7 cells±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

PTC-596 0 nmol/L 25 nmol/L 50 nmol/L Cyclin B1/β-actin 0.22 ± 0.02 0.33 ± 0.02**0.53 ± 0.01**G0/G1（%）51.56 ± 2.52 53.21 ± 0.69 0.19 ± 3.28**S（%）32.92 ± 2.48 23.61 ± 2.05**15.50 ± 1.45**G2/M（%）15.42 ± 1.55 23.18 ± 1.56**83.31 ± 1.18**Cyclin D1/β-actin 0.90 ± 0.01 0.87 ± 0.05*0.64 ± 0.06**P21 /β-actin 0.15 ± 0.01 0.17 ± 0.01*0.33 ± 0.01**

表3 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧、凋亡比例及凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.3 Effects of PTC-596 on mitochondrial function and apoptosis of MCF-7 cells±s

表3 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧、凋亡比例及凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.3 Effects of PTC-596 on mitochondrial function and apoptosis of MCF-7 cells±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

PTC-596 0 nmol/L 25 nmol/L 50 nmol/L Apoptosis Ratio （%）2.04 ± 1.02 10.56 ± 1.97**26.74 ± 3.52**MMP（590 nm/530 nm）1.21 ± 0.21 0.73 ± 0.11**0.34 ± 0.17**ROS Concentration（480 nm）996 ± 257 1560 ± 191**2652 ± 266**Bcl-2/β-actin 0.48 ± 0.02 0.17 ± 0.01**0.12 ± 0.01**c-PARP/β-actin 0.09 ± 0.02 0.15 ± 0.01**0.34 ± 0.04**Bax/β-actin 0.30 ± 0.04 0.31 ± 0.01*0.55 ± 0.02**

2.3 PTC-596抑制MCF-7細(xì)胞BIM-1的表達(dá) 25、50 nmol/L PTC-596處理MCF-7細(xì)胞48 h后，Western blot 法檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞BMI-1 蛋白表達(dá)的抑制作用。與對(duì)照組相比，PTC-596 處理有效抑制MCF-7細(xì)胞中BMI-1 蛋白表達(dá)，呈濃度依賴性（圖2）。提示PTC-596 高效抑制MCF-7 細(xì)胞中BMI-1 表達(dá)。

圖2 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞BMI-1 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of on the expressions of BMI-1 in MCF-7 cells

圖3 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of on the apoptosis in human breast cancer MCF-7cells

圖4 PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of on the expressions of apoptosis-related proteins in MCF-7 cells

2.4 PTC-596 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡 為探究PTC-596 高效抑制MCF-7 細(xì)胞增殖的機(jī)制，首先 PI/FITC-Annexin V 雙染/流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，25、50 nmol/L PTC-596 分別處理MCF-7 細(xì)胞48 h 后，F(xiàn)ITC-Annexin V（+）的凋亡細(xì)胞比例從2.04%增加至10.56%和26.74%，提示PTC-596 有效誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步研究凋亡機(jī)制發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中活性氧氧化產(chǎn)生的DCF 熒光強(qiáng)度隨藥物濃度的增加逐漸增高；單體JC-1的綠色熒光強(qiáng)度也隨藥物濃度的增加逐漸升高，紅色熒光強(qiáng)度（聚合JC-I）/綠色熒光強(qiáng)度（單體JC-1）的比值隨之逐漸減小，提示PTC-596 處理導(dǎo)致MCF-7 細(xì)胞活性氧增加，線粒體膜電位下降。Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)顯示，實(shí)驗(yàn)組中凋亡降解蛋白c-PARP 和促凋亡蛋白Bax 相對(duì)表達(dá)分別從0.09 和0.30 增加至0.34 和0.55，凋亡抑制蛋白Bcl-2 相對(duì)表達(dá)從0.48 減少為0.12。以上結(jié)果與對(duì)照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。提示PTC-596 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與內(nèi)源性線粒體依賴性的細(xì)胞凋亡相關(guān)。

3 討論

乳腺癌因高發(fā)病率、易耐藥和易轉(zhuǎn)移性成為世界女性癌癥相關(guān)第二大死亡原因。尋找新型高效安全的靶向藥物對(duì)于晚期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床治療是亟待解決的重要問(wèn)題。研究表明，人乳腺癌組織中BMI-1 表達(dá)顯著增加，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，敲除BMI-1 可有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化，減少腫瘤干細(xì)胞，增加化療藥物敏感性，提示高表達(dá)的BMI-1 作為癌基因在乳腺癌發(fā)展過(guò)程中起促進(jìn)作用，靶向BMI-1 可作為乳腺癌抗腫瘤藥物研發(fā)新靶點(diǎn)［15-17］。PTC-596 是新近發(fā)現(xiàn)的靶向抑制BMI-1 的小分子化合物，已證實(shí)PTC-596 對(duì)高表達(dá)BMI-1 的套細(xì)胞淋巴瘤、急性髓系白血病干細(xì)胞、平滑肌肉瘤、胰腺導(dǎo)管腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤有高效抑制作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生非P53 依賴的線粒體途徑細(xì)胞凋亡和有絲分裂阻滯等密切相關(guān)［18-21］。但目前尚未見(jiàn)PTC-596 對(duì)乳腺癌治療作用的研究報(bào)道，本研究評(píng)估了PTC-596 抗人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞增殖能力及可能的相關(guān)機(jī)制。

結(jié)果顯示，MCF-7 細(xì)胞對(duì)PTC-596 高度敏感，nmol/L 級(jí)別濃度便可有效抑制BMI-1 表達(dá)和細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間和濃度依賴性，提示PTC-596 作為廣譜抗腫瘤藥物，具備抗MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的藥理學(xué)活性。進(jìn)一步探究了PTC-596 抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，在細(xì)胞增殖過(guò)程中，正常細(xì)胞周期進(jìn)程至關(guān)重要，周期蛋白通過(guò)結(jié)合并激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用［22-23］。如：CyclinD1/CDK4/6 驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期開(kāi)始、Cyclin B1/CDK1 啟動(dòng)有絲分裂進(jìn)行、周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21 等共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，保證細(xì)胞周期進(jìn)程有序進(jìn)行［24］。BMI-1 廣泛參與細(xì)胞增值和分化過(guò)程，對(duì)細(xì)胞周期蛋白功能發(fā)揮起重要調(diào)控作用，在乳腺癌的發(fā)展過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂增殖［17］。本研究顯示，利用PTC-596 靶向性抑制MCF-7 細(xì)胞中BMI-1 蛋白表達(dá)后，MCF-7 細(xì)胞增殖抑制，同時(shí)出現(xiàn)周期蛋白CyclinD1 表達(dá)下降、Cyclin B1 和P21 表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂停滯而被顯著性阻滯在G2/M 細(xì)胞周期的現(xiàn)象。長(zhǎng)時(shí)間的有絲分裂停滯可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，PTC-596 處理MCF-7 細(xì)胞后，細(xì)胞中活性氧增加，可能引起線粒體受損膜通透性增加，從而表現(xiàn)出線粒體膜電位下降。同時(shí)促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增高，抑制凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)減少，過(guò)量的Bax 形成寡聚物定位于線粒體膜，促使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，促使線粒體膜電位進(jìn)一步下降，釋放凋亡效應(yīng)因子，激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化的Caspase 3 剪切PARP 蛋白，引起c-PARP 增多，最終表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果提示，PTC-596 具有抗人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的藥理學(xué)活性，其機(jī)制可能與抑制BMI-1 蛋白表達(dá)，干擾細(xì)胞正常周期進(jìn)程與誘導(dǎo)線粒體途徑的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡相關(guān)。此結(jié)果與以往學(xué)者對(duì)PTC-596 抗淋巴瘤、膠質(zhì)瘤等機(jī)制相一致［25-26］，提示PTC-596 通過(guò)靶向抑制乳腺癌細(xì)胞BMI-1 表達(dá)發(fā)揮其抗腫瘤的活性。

綜上所述，本研究顯示PTC-596 可靶向性抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中BMI-1 表達(dá)，發(fā)揮高效殺傷MCF-7 細(xì)胞的抗腫瘤活性，其機(jī)制可能與干擾細(xì)胞周期，阻滯細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡相關(guān)。為BMI-1 作為人乳腺癌治療的有效新靶點(diǎn)和PTC-596 抗乳腺癌臨床藥物使用提供了有效的理論依據(jù)。但本研究尚存在不足，僅在體外細(xì)胞水平探究了PTC-596 的抗乳腺癌細(xì)胞藥理學(xué)活性，PTC-596 對(duì)MCF-7 細(xì)胞殺傷機(jī)制也未完全闡明，還需進(jìn)一步探索。因此后續(xù)研究將首先通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PTC-596 抗乳腺癌治療的作用及相關(guān)機(jī)制。

【Author contributions】LI Yuling and YANG Jianlin performed the experiments and wrote the article.CUI Zhi and WANG Jing performed the experiments.LV Yafeng and CAO Chunyu revised the article.YANG Jianlin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.