BMI-1抑制劑PTC-596對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、周期和凋亡的影響

李玉玲 楊建林 崔芝 王靜 呂亞豐 曹春雨

三峽大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室 （湖北宜昌 443002）

乳腺癌是全世界女性癌癥相關(guān)第二大死亡原因，也是女性最常見的惡性腫瘤［1］。目前手術(shù)切除、放化療、激素治療和靶向治療是最常見的乳腺癌臨床治療手段，雖然疾病治愈率有所提高，但晚期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者5 年生存期仍不足30%［2-3］，且手術(shù)和長期放、化療的不良反應(yīng)嚴重影響患者生存質(zhì)量。因此，迫切需要尋找更加安全高效的靶向藥物用于治療乳腺癌。

原癌基因BMI-1（B-cell-specificmoloney murine leukemia virus insection site 1，BMI-1）是在小鼠淋巴瘤中被鑒定的原癌基因，屬于多梳基因家族（polycombgroup genes，PcG）成員之一，廣泛參與調(diào)控細胞增殖與分化［4］。已證實高表達BMI-1 不但與細胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤形成有關(guān)，而且與腫瘤細胞侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)，也是惡性腫瘤預(yù)后不良的病理指征［5-7］。因此BMI-1 成為癌癥治療有效新靶點［8-9］。目前研究［10］表明BMI-1 在乳腺癌組織中高表達，可作為乳腺癌治療的關(guān)鍵靶向因素。PTC-596 是新近發(fā)現(xiàn)的特異性BMI-1 抑制劑，可通過誘導(dǎo)細胞凋亡對白血病、膠質(zhì)瘤和淋巴瘤等發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［11-14］。但PTC-596 作為BMI-1抑制劑對乳腺癌治療作用的研究目前尚未有報道，本研究探索PTC-596 對人乳腺癌MCF-7 細胞的殺傷作用及其可能的機制，以期為PTC-596 作為臨床抗腫瘤新藥和乳腺癌新型靶向藥物治療的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7 細胞購于中國科學(xué)院細胞庫（上海），由腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室培養(yǎng)保存。PTC-596（荷蘭Specs 生物特殊化合物公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，美國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國BI 公司）、青霉素/鏈霉素雙抗（天津灝洋生物有限責(zé)任公司）；RIPA蛋白裂解液（武漢Servicebio 公司）；BIM-1 抗體、Bax 抗體、Bcl-2抗體、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抗體、Cyclin B1 抗體、Cyclin D抗體、P21 抗體、β-actin 抗體（武漢三鷹Proteintech公司）；ECL 超敏顯影液（美國Thermo Scientific 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、FITC-Annexin V 凋亡檢測試劑盒（南京Vazyme 公司）；ROS 活性氧檢測試劑盒、JC-1 檢測試劑盒（上海碧云天生物公司）。Western blot 電泳儀、電泳及轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-Rad公司）；TE2000-S 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；FACSVerse 流式細胞儀（美國BD 公司）；全波長酶標儀（美國Thermo 公司）；ChemiScope mini 化學(xué)發(fā)光成像顯影儀（上海勤翔公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)、PTC-596 藥物配置 用含10% 胎牛血清的DMED 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)MCF-7 細胞，待對數(shù)生長期時接種于細胞培養(yǎng)板。

PTC-596 干粉溶解于DMSO，配制終濃度為20 mmol/L 的藥物母液，-20 ℃低溫儲存。實驗中用DMEM 細胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.3 CCK8法檢測PTC-596對MCF-7細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期MCF-7 細胞懸液接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中（1.0 × 103個細胞/孔）繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，設(shè)無培養(yǎng)細胞的空孔為空白組，無PTC-596 的DMEM（含等量藥物溶劑DMSO）培養(yǎng)為陰性對照組，和換終濃度分別為12.5、25、50、100、200 nmol/L PTC-596 的DMEM 細胞培養(yǎng)液的實驗組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，按照試劑盒說明書操作，加入CCK8試劑孵育1 h 后，酶標儀檢測每孔450 nm 波長下的吸光度OD值。計算PTC-596 對MCF-7 細胞的生長抑制率：［1-（實驗組OD值-空白組OD值）/（陰性對照組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.4 細胞分組 以1.3 步驟實驗結(jié)果為依據(jù)，PTC-596 處理48 h 后，對MCF-7 細胞的IC50值為（49.33 ± 7.02）nmol/L。后續(xù)研究分3 組，均培養(yǎng)48 h 后進行實驗，以不含PTC-596 的DMEM 細胞培養(yǎng)液（含等量藥物溶劑DMSO）培養(yǎng)組為陰性對照組，以分別含25、50 nmol/L 濃度PTC-596 的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)組為低、高藥物濃度實驗組。

1.5 PI 單染/流式細胞術(shù)檢測PTC-596 對MCF-7細胞周期影響 分別收集實驗組和對照組MCF-7細胞，室溫1 000 r/min 離心3 min 獲得細胞沉淀，細胞用75%乙醇（1 × PBS配制）重懸后4 ℃固定過夜。PBS 洗滌細胞后，用含有0.1% TritonX-100、50 μg/L Rnase 和10 μg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）的PBS 染液于37 ℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.6 PI/FITC-Annexin V 雙染/流式細胞術(shù)檢測PTC-596 對MCF-7 細胞凋亡影響 分別收集實驗組和對照組MCF-7 細胞，按照試劑盒說明書操作，樣品細胞經(jīng)FITC-Annexin V 和PI 避光染色15 min后，流式細胞儀檢測凋亡細胞數(shù)量，以PI-/FITCAnnexin V+和PI+/FITC-Annexin V+為細胞凋亡判斷標準。

1.7 DCFH-DA 探針/流式細胞術(shù)檢測PTC-596 對MCF-7 細胞內(nèi)活性氧水平影響 分別收集實驗組和對照組MCF-7 細胞，按照試劑盒說明書操作，加入1 mL DCFH-DA 探針工作液于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液DMEM 重復(fù)洗滌細胞3 次，室溫1 000 r/min 離心5 min 收集沉淀細胞，PBS 重懸細胞樣品后，流式細胞儀檢測DCF 熒光強度。DCFH-DA 為無熒光的小分子探針，可被細胞中的酯酶水解和活性氧氧化生成具有熒光的DCF，細胞內(nèi)活性氧含量可依據(jù)DCF 熒光強度體現(xiàn)。

1.8 JC-1探針/流式細胞術(shù)檢測PTC-596對MCF-7 細胞線粒體膜電位影響 分別收集實驗組和對照組MCF-7 細胞，按照試劑盒說明書操作，加入JC-1染色工作液于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用預(yù)冷的JC-1 染色緩沖液重復(fù)洗滌細胞3 次，4 ℃1 000 r/min 離心5 min 收集沉淀細胞，JC-1 染色緩沖液重懸后，流式細胞儀檢測紅、綠熒光強度。JC-1 是用于檢測線粒體膜電位的熒光探針，細胞線粒體膜電位較高時，JC-1 在線粒體基質(zhì)中聚集形成聚合物，發(fā)出紅色熒光；當(dāng)細胞線粒體膜電位降低，JC-1 呈單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。線粒體去極化狀態(tài)可依據(jù)紅、綠熒光強度判斷。

1.9 Western blot 檢測PTC-596 對MCF-7 細胞BIM-1 蛋白、周期和凋亡相關(guān)蛋白表達影響 分別收集實驗組和對照組MCF-7 細胞，加入RIPA 裂解液混勻后置于冰上30 min 裂解細胞，經(jīng)過4 ℃、12 000 r/min 離心15 min 后，取上清用BCA 法測定其總蛋白濃度，分別將蛋白量為50 μg/樣的上清液與上樣緩沖液混合，100 ℃水浴加熱10 min。所得各組樣品蛋白依次經(jīng)過SDS-PAGE 電泳分離，PVDF 膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂牛奶室溫封閉，目的蛋白抗體4 ℃孵育過夜，和對應(yīng)二抗室溫結(jié)合2 h 后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并記錄結(jié)果，灰度分析目的蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 22.0、Image-J 等軟件對實驗數(shù)據(jù)處理分析，實驗數(shù)據(jù)用（±s）表示，實驗數(shù)據(jù)兩組間統(tǒng)計學(xué)差異比較采用t檢驗，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC-596抑制MCF-7細胞增殖 CCK8法檢測結(jié)果顯示PTC-596 具有高效抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖的作用（表1），且抑制效果隨藥物濃度增加和作用時間延長逐漸增強。計算PTC-596 處理MCF-7 細胞48 h 的IC50值為（49.33 ± 7.02）nmol/L。以此為依據(jù)，后續(xù)實驗研究以PTC-596 終濃度分別為25、50 nmol/L 處理48 h 的MCF-7 細胞為實驗組，以0 nmol/L PTC-596處理的細胞為對照組進行。

表1 PTC-596 抑制MCF-7 細胞增殖Tab.1 SI-4650 inhibited proliferation of SGC-7901 cells ±s，%

表1 PTC-596 抑制MCF-7 細胞增殖Tab.1 SI-4650 inhibited proliferation of SGC-7901 cells ±s，%

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

時間PTC-596 100 nmol/L 47.74 ± 4.04**77.11 ± 3.68**97.61 ± 1.59**0 nmol/L 0.00 ± 1.86 0.00 ± 2.95 0.00 ± 2.84 12.5 nmol/L 8.24 ± 3.72 24.57 ± 3.19**33.11 ± 3.21**24 h 48 h 72 h 25 nmol/L 22.84 ± 3.17**32.22 ± 3.63**47.97 ± 3.00**50 nmol/L 34.88 ± 2.63**55.22 ± 4.27**69.54 ± 2.18**

2.2 PTC-596 誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細胞發(fā)生G2/M 期周期阻滯 流式細胞術(shù)檢測MCF-7 細胞周期結(jié)果顯示，PTC-596 處理后，MCF-7 細胞G2/M 期細胞比例可高達83.31%，G0/G1期和S 期細胞比例從51.56%和32.92%同步減少至0.19%和15.5%。Western blot 法檢測細胞周期相關(guān)蛋白表達結(jié)果顯示，PTC-596 處理組細胞中Cyclin B1 與p21 表達從0.22、0.15上調(diào)至0.53和0.33，Cyclin D1表達從0.9 顯著減少至0.64。與對照組相比，以上結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。提示PTC-596 可能通過干擾周期蛋白表達，抑制MCF-7 細胞分裂，將MCF-7 細胞阻滯在G2/M 期（表2，圖1 ）。

圖1 PTC-596 對MCF-7 細胞周期和周期相關(guān)蛋白表達的影響Fig.1 Effects of on cell cycle and the expressions of cell cycle related proteins in MCF-7 cells

表2 PTC-596 對MCF-7 細胞周期的影響Tab.2 Effect of PTC-596 on cell cycle of MCF-7 cells±s

表2 PTC-596 對MCF-7 細胞周期的影響Tab.2 Effect of PTC-596 on cell cycle of MCF-7 cells±s

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

PTC-596 0 nmol/L 25 nmol/L 50 nmol/L Cyclin B1/β-actin 0.22 ± 0.02 0.33 ± 0.02**0.53 ± 0.01**G0/G1（%）51.56 ± 2.52 53.21 ± 0.69 0.19 ± 3.28**S（%）32.92 ± 2.48 23.61 ± 2.05**15.50 ± 1.45**G2/M（%）15.42 ± 1.55 23.18 ± 1.56**83.31 ± 1.18**Cyclin D1/β-actin 0.90 ± 0.01 0.87 ± 0.05*0.64 ± 0.06**P21 /β-actin 0.15 ± 0.01 0.17 ± 0.01*0.33 ± 0.01**

表3 PTC-596 對MCF-7 細胞線粒體膜電位、活性氧、凋亡比例及凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.3 Effects of PTC-596 on mitochondrial function and apoptosis of MCF-7 cells±s

表3 PTC-596 對MCF-7 細胞線粒體膜電位、活性氧、凋亡比例及凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.3 Effects of PTC-596 on mitochondrial function and apoptosis of MCF-7 cells±s

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

PTC-596 0 nmol/L 25 nmol/L 50 nmol/L Apoptosis Ratio （%）2.04 ± 1.02 10.56 ± 1.97**26.74 ± 3.52**MMP（590 nm/530 nm）1.21 ± 0.21 0.73 ± 0.11**0.34 ± 0.17**ROS Concentration（480 nm）996 ± 257 1560 ± 191**2652 ± 266**Bcl-2/β-actin 0.48 ± 0.02 0.17 ± 0.01**0.12 ± 0.01**c-PARP/β-actin 0.09 ± 0.02 0.15 ± 0.01**0.34 ± 0.04**Bax/β-actin 0.30 ± 0.04 0.31 ± 0.01*0.55 ± 0.02**

2.3 PTC-596抑制MCF-7細胞BIM-1的表達 25、50 nmol/L PTC-596處理MCF-7細胞48 h后，Western blot 法檢測對腫瘤細胞BMI-1 蛋白表達的抑制作用。與對照組相比，PTC-596 處理有效抑制MCF-7細胞中BMI-1 蛋白表達，呈濃度依賴性（圖2）。提示PTC-596 高效抑制MCF-7 細胞中BMI-1 表達。

圖2 PTC-596 對MCF-7 細胞BMI-1 蛋白表達的影響Fig.2 Effects of on the expressions of BMI-1 in MCF-7 cells

圖3 PTC-596 對MCF-7 細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of on the apoptosis in human breast cancer MCF-7cells

圖4 PTC-596 對MCF-7 細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effects of on the expressions of apoptosis-related proteins in MCF-7 cells

2.4 PTC-596 誘導(dǎo)MCF-7 細胞發(fā)生凋亡 為探究PTC-596 高效抑制MCF-7 細胞增殖的機制，首先 PI/FITC-Annexin V 雙染/流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，25、50 nmol/L PTC-596 分別處理MCF-7 細胞48 h 后，F(xiàn)ITC-Annexin V（+）的凋亡細胞比例從2.04%增加至10.56%和26.74%，提示PTC-596 有效誘導(dǎo)MCF-7 細胞發(fā)生凋亡。進一步研究凋亡機制發(fā)現(xiàn)，實驗組細胞中活性氧氧化產(chǎn)生的DCF 熒光強度隨藥物濃度的增加逐漸增高；單體JC-1的綠色熒光強度也隨藥物濃度的增加逐漸升高，紅色熒光強度（聚合JC-I）/綠色熒光強度（單體JC-1）的比值隨之逐漸減小，提示PTC-596 處理導(dǎo)致MCF-7 細胞活性氧增加，線粒體膜電位下降。Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白表達顯示，實驗組中凋亡降解蛋白c-PARP 和促凋亡蛋白Bax 相對表達分別從0.09 和0.30 增加至0.34 和0.55，凋亡抑制蛋白Bcl-2 相對表達從0.48 減少為0.12。以上結(jié)果與對照組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。提示PTC-596 誘導(dǎo)MCF-7 細胞凋亡，其機制可能與內(nèi)源性線粒體依賴性的細胞凋亡相關(guān)。

3 討論

乳腺癌因高發(fā)病率、易耐藥和易轉(zhuǎn)移性成為世界女性癌癥相關(guān)第二大死亡原因。尋找新型高效安全的靶向藥物對于晚期和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床治療是亟待解決的重要問題。研究表明，人乳腺癌組織中BMI-1 表達顯著增加，促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，敲除BMI-1 可有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞上皮間質(zhì)化，減少腫瘤干細胞，增加化療藥物敏感性，提示高表達的BMI-1 作為癌基因在乳腺癌發(fā)展過程中起促進作用，靶向BMI-1 可作為乳腺癌抗腫瘤藥物研發(fā)新靶點［15-17］。PTC-596 是新近發(fā)現(xiàn)的靶向抑制BMI-1 的小分子化合物，已證實PTC-596 對高表達BMI-1 的套細胞淋巴瘤、急性髓系白血病干細胞、平滑肌肉瘤、胰腺導(dǎo)管腺癌和膠質(zhì)母細胞瘤等多種惡性腫瘤有高效抑制作用，其機制與誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生非P53 依賴的線粒體途徑細胞凋亡和有絲分裂阻滯等密切相關(guān)［18-21］。但目前尚未見PTC-596 對乳腺癌治療作用的研究報道，本研究評估了PTC-596 抗人乳腺癌MCF-7 細胞增殖能力及可能的相關(guān)機制。

結(jié)果顯示，MCF-7 細胞對PTC-596 高度敏感，nmol/L 級別濃度便可有效抑制BMI-1 表達和細胞增殖，且具有時間和濃度依賴性，提示PTC-596 作為廣譜抗腫瘤藥物，具備抗MCF-7 乳腺癌細胞的藥理學(xué)活性。進一步探究了PTC-596 抑制MCF-7乳腺癌細胞增殖的機制，在細胞增殖過程中，正常細胞周期進程至關(guān)重要，周期蛋白通過結(jié)合并激活細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）發(fā)揮調(diào)控細胞周期的作用［22-23］。如：CyclinD1/CDK4/6 驅(qū)動細胞周期開始、Cyclin B1/CDK1 啟動有絲分裂進行、周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21 等共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，保證細胞周期進程有序進行［24］。BMI-1 廣泛參與細胞增值和分化過程，對細胞周期蛋白功能發(fā)揮起重要調(diào)控作用，在乳腺癌的發(fā)展過程中通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D促進腫瘤細胞分裂增殖［17］。本研究顯示，利用PTC-596 靶向性抑制MCF-7 細胞中BMI-1 蛋白表達后，MCF-7 細胞增殖抑制，同時出現(xiàn)周期蛋白CyclinD1 表達下降、Cyclin B1 和P21 表達增加，導(dǎo)致細胞有絲分裂停滯而被顯著性阻滯在G2/M 細胞周期的現(xiàn)象。長時間的有絲分裂停滯可能導(dǎo)致細胞凋亡，因此本研究進一步檢測了PTC-596 對MCF-7 細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，PTC-596 處理MCF-7 細胞后，細胞中活性氧增加，可能引起線粒體受損膜通透性增加，從而表現(xiàn)出線粒體膜電位下降。同時促凋亡蛋白Bax 表達增高，抑制凋亡蛋白Bcl-2 表達減少，過量的Bax 形成寡聚物定位于線粒體膜，促使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，促使線粒體膜電位進一步下降，釋放凋亡效應(yīng)因子，激活Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，活化的Caspase 3 剪切PARP 蛋白，引起c-PARP 增多，最終表現(xiàn)為凋亡細胞數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果提示，PTC-596 具有抗人乳腺癌MCF-7 細胞的藥理學(xué)活性，其機制可能與抑制BMI-1 蛋白表達，干擾細胞正常周期進程與誘導(dǎo)線粒體途徑的內(nèi)源性細胞凋亡相關(guān)。此結(jié)果與以往學(xué)者對PTC-596 抗淋巴瘤、膠質(zhì)瘤等機制相一致［25-26］，提示PTC-596 通過靶向抑制乳腺癌細胞BMI-1 表達發(fā)揮其抗腫瘤的活性。

綜上所述，本研究顯示PTC-596 可靶向性抑制人乳腺癌MCF-7 細胞中BMI-1 表達，發(fā)揮高效殺傷MCF-7 細胞的抗腫瘤活性，其機制可能與干擾細胞周期，阻滯細胞有絲分裂，誘導(dǎo)線粒體途徑細胞凋亡相關(guān)。為BMI-1 作為人乳腺癌治療的有效新靶點和PTC-596 抗乳腺癌臨床藥物使用提供了有效的理論依據(jù)。但本研究尚存在不足，僅在體外細胞水平探究了PTC-596 的抗乳腺癌細胞藥理學(xué)活性，PTC-596 對MCF-7 細胞殺傷機制也未完全闡明，還需進一步探索。因此后續(xù)研究將首先通過動物體內(nèi)實驗進一步驗證PTC-596 抗乳腺癌治療的作用及相關(guān)機制。

【Author contributions】LI Yuling and YANG Jianlin performed the experiments and wrote the article.CUI Zhi and WANG Jing performed the experiments.LV Yafeng and CAO Chunyu revised the article.YANG Jianlin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.