黃韌帶中成纖維細胞生長因子1、血管內(nèi)皮生長因子表達與腰椎管狹窄患者腰椎減壓術后再狹窄的關系

陳耀鑫 黎松波 方冠軍 葉國標 劉先銀

南方醫(yī)科大學附屬東莞醫(yī)院骨科（廣東東莞 523000）

腰椎管狹窄（LSS）是一種與年齡相關的脊柱退行性疾病［1-2］，經(jīng)皮椎間孔鏡手術與顯微內(nèi)鏡手術能完整保留腰椎生理結構且創(chuàng)傷小，在LSS 治療方面有顯著優(yōu)勢［3］。但椎管減壓術后不可避免發(fā)生再狹窄、LSS 復發(fā)和鄰近節(jié)段疾?。?］，術后再狹窄增加再次翻修手術概率，尋找再狹窄的因素和標志物有助于手術治療策略調(diào)整以及術后預防。研究顯示黃韌帶受變性和軸向壓迫影響發(fā)生纖維化、肥厚和骨化是引起LSS 的主要原因，椎間盤軟骨中蛋白多糖過多引起的炎癥反應在黃韌帶纖維化等一系列病理改變中發(fā)揮關鍵作用［5］。成纖維細胞生長因子1（FGF-1）可通過抑制轉化生長因子（TGF）-β1 信號通路恢復上皮-間質轉化，抑制成纖維細胞膠原蛋白產(chǎn)生和向肌成纖維細胞分化，緩解纖維化進程［6］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種有效的血管生成因子，在炎癥反應中VEGF 作為單核細胞的強效趨化劑，誘導單核細胞浸潤和釋放炎癥細胞因子，增加血管通透性和炎性損傷［7］。然而FGF-1、VEGF 在LSS 的相關報道十分少見，如果能證實FGF-1、VEGF 與LSS的關系可能為臨床治療提供新的靶點，同時有助于臨床預防，完善治療方案。鑒于此，本研究擬檢測手術切除的黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達，分析其與LSS 病情以及腰椎減壓術后再狹窄的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月至2022 年1 月在南方醫(yī)科大學附屬東莞醫(yī)院骨科收治的138 例行腰椎減壓術治療的LSS 患者（LSS 組），男85 例，女53 例，年齡49 ～ 63 歲，平均（54.89 ± 7.42）歲，手術部位：L3-427 例，L4-594 例，L5-S117 例。納入標準：（1）腰椎CT、MRI 片顯示椎管容積明顯減小，經(jīng)臨床診斷為LSS；（2）椎間盤鏡下腰椎減壓術和內(nèi)固定融合治療；（3）本地常駐居民，能配合隨訪者。排除標準：（1）腰椎嚴重不穩(wěn)或存在多節(jié)段病變；（2）血管跛行、脊柱翻修手術、假性關節(jié)病、先天性脊柱畸形；（3）腰椎創(chuàng)傷、腫瘤、感染。采用絕對跛行距離（ACD）進行椎管狹窄程度分級［8］，根據(jù)椎管狹窄程度分級將LSS 患者分為輕度組（1-2 級，ACD ≤ 200 m，41 例）、中度組（3-4 級，ACD 201 ～ 400 m，67例）和重度組（5-6級，ACD ＞ 400 m，30 例）［8］。另選擇同期我院骨科收治的138 例行腰椎手術治療的非LSS 患者為對照組，男89 例，女49 例，年齡50 ～ 65 歲，平均（55.10 ± 7.19）歲，手術部位：L3-428例，L4-593例，L5-S117例。兩組性別、年齡、手術部位比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。本研究已經(jīng)獲得南方醫(yī)科大學附屬東莞醫(yī)院倫理委員會批準，患者及其家屬均知情同意簽署同意書。

1.2 黃韌帶中FGF-1、VEGF表達檢測 采用實時定量聚合酶鏈式反應（qPCR）法檢測黃韌帶中FGF-1、VEGF 表達：取手術切除的黃韌帶，Trizol 法（美國Thermo Fisher公司）提取組織總RNA，取1 mg總RNA，使用cDNA Synthesis kit（日本TaKaRa 公司）將其反向轉錄成cDNA。取2 μL cDNA 樣品加入qRT-PCR 體系，MyiQ2 雙色實時PCR 檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）進行qPCR 反應。以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算FGF-1、VEGF 相對表達量。

1.3 免疫組織化學法黃韌帶中FGF-1、VEGF 蛋白表達檢測 取黃韌帶組織石蠟包埋切片，經(jīng)40 ℃溫水浸泡5 min，37 ℃恒溫箱烘干，無水乙醇梯度脫蠟。抗原修復和血清封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗，37 ℃溫箱孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，37 ℃溫箱孵育30 min。光學顯微鏡下觀察，以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對照，細胞質黃染或棕染為陽性。

1.4 術后隨訪 所有患者出院后均定期接受電話隨訪和門診復查腰椎MRI，隨訪時間截止2022年12 月，統(tǒng)計術后再狹窄的發(fā)生情況，術后再狹窄指原發(fā)病灶再次發(fā)生狹窄。收集患者性別、年齡、體質量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、基礎疾病、LSS病程、臨床癥狀、LSS 側別、手術部位、手術時間、術后第6 個月以及術后1 年的Oswestry 殘疾指數(shù)（ODI）［9］和腰痛和下肢痛視覺模擬量表（VAS）評分［10］、減壓不徹底（術后MRI 復查提示腰椎存在突出物殘留）、鄰近節(jié)段病變、術后并發(fā)癥。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.00 錄入和分析數(shù)據(jù)，連續(xù)性變量均符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用單因素方差分析（兩兩對比采用LSD-t檢驗）或獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。多因素logistic 回歸分析LSS 患者腰椎減壓術后再狹窄的危險因素。檢驗水準α = 0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LSS 組和對照組黃韌帶組織中FGF-1、VEGF表達比較 免疫組化檢測結果顯示LSS 組黃韌帶組織中FGF-1 蛋白陽性表達率為20.29%（28/138），低于對照組的56.52%（78/138）（χ2= 38.291，P＜ 0.001），VEGF 蛋白陽性表達率為68.12%（94/138），高于對照組的23.91%（33/138）（χ2= 54.272，P＜ 0.001）。qPCR 檢測結果顯示LSS 組黃韌帶組織中FGF-1 表達低于對照組（P＜ 0.001），VEGF 表達高于對照組（P＜ 0.001）。見表1。

表1 LSS 組和對照組黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達比較Tab.1 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS group and control group±s

表1 LSS 組和對照組黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達比較Tab.1 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS group and control group±s

組別LSS組對照組t值P值例數(shù)138 138 FGF-1 2.03 ± 0.42 5.39 ± 1.57-24.287＜ 0.001 VEGF 7.02 ± 1.95 4.18 ± 1.27 14.336＜ 0.001

2.2 不同椎管狹窄程度LSS 患者黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達比較 重度組黃韌帶組織中FGF-1 表達低于中度組和低度組（P＜ 0.05），且中度組低于低度組（P＜ 0.05），重度組黃韌帶組織中VEGF 表達高于中度組和低度組（P＜ 0.05），且中度組高于低度組（P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同椎管狹窄程度LSS 患者黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達比較Tab.2 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS patients with different degree of spinal stenosis ±s

表2 不同椎管狹窄程度LSS 患者黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達比較Tab.2 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS patients with different degree of spinal stenosis ±s

注：與輕度組比較，aP ＜ 0.05；與中度組比較，bP ＜ 0.05

組別輕度組中度組重度組F值P值VEGF 6.22 ± 0.16 7.02 ± 1.21a 8.11 ± 0.36ab 41.189＜ 0.001例數(shù)41 67 30 FGF-1 2.20 ± 0.21 2.05 ± 0.36a 1.75 ± 0.13ab 22.257＜ 0.001

2.3 LSS 患者腰椎減壓術后再狹窄的因素分析 中位隨訪23 個月，失訪2 例，發(fā)生再狹窄48 例。再狹窄組年齡大于無再狹窄組（P＜ 0.001），男性、吸煙史、糖尿病、LSS 椎管重度狹窄、減壓不徹底、鄰近節(jié)段病變比例高于無再狹窄組（P＜ 0.05，P＜ 0.001），LSS 病程長于無再狹窄組（P＜ 0.001），術后6 個月ODI 評分、術后1 年ODI 評分、術后6 個月腰痛VAS 評分、術后1 年腰痛VAS 評分、VEGF表達高于無再狹窄組（P＜ 0.001），F(xiàn)GF-1 表達低于無再狹窄組（P＜ 0.001），兩組其他資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表3。

表3 影響LSS 患者腰椎減壓術后再狹窄的因素分析Tab.3 Analysis of factors affecting restenosis after lumbar decompression in LSS patients±s

表3 影響LSS 患者腰椎減壓術后再狹窄的因素分析Tab.3 Analysis of factors affecting restenosis after lumbar decompression in LSS patients±s

項目t/χ2值P值年齡（歲）性別［例（%）］男女體質量指數(shù)（kg/m2）吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］基礎疾病［例（%）］高血壓糖尿病高脂血癥LSS病程（個月）臨床癥狀［例（%）］腰痛下肢痛間歇性跛行下肢肌力減退LSS側別［例（%）］單側雙側LSS椎管狹窄程度分級［例（%）］輕中度重度手術部位［例（%）］再狹窄組（n = 48）58.32 ± 6.02無再狹窄組（n = 88）53.02 ± 5.09 5.433 4.407＜ 0.001 0.036 35（72.92）13（27.08）23.12 ± 0.69 30（62.50）21（43.75）48（54.55）40（45.45）23.05 ± 0.51 36（40.91）30（34.09）0.673 5.797 1.236 0.502 0.016 0.266 23（47.92）30（62.50）19（39.58）10.21 ± 2.03 32（36.36）29（32.95）26（29.55）7.12 ± 1.69 1.721 11.038 1.434 9.480 0.190 0.001 0.235＜ 0.001 42（87.50）40（83.33）21（43.75）10（20.83）80（90.91）79（89.77）33（37.50）16（18.18）0.391 1.178 0.507 0.141 1.288 0.532 0.278 0.477 0.707 0.256 31（64.58）17（35.42）65（73.86）23（26.14）20.301＜ 0.001 27（56.25）21（43.75）79（89.77）9（10.23）0.213 0.899 L3-4 L4-5 L5-S1術后6個月ODI評分（分）術后1年ODI評分（分）術后6個月腰痛VAS 評分（分）術后1年腰痛VAS 評分（分）術后6個月下肢痛VAS 評分（分）術后1年下肢痛VAS 評分（分）減壓不徹底［例（%）］鄰近節(jié)段病變［例（%）］術后并發(fā)癥［例（%）］切口感染腦脊液漏FGF-1 VEGF 10（20.83）32（66.67）6（12.50）29.35 ± 6.09 17.21 ± 2.02 3.02 ± 0.95 2.05 ± 0.47 2.11 ± 0.69 1.67 ± 0.42 12（25.00）11（22.92）16（18.18）62（70.45）10（11.36）15.21 ± 3.02 11.32 ± 2.65 2.11 ± 0.69 1.25 ± 0.32 2.05 ± 0.43 1.60 ± 0.41 9（10.23）8（9.09）18.112 13.411 6.412 11.751 0.624 0.943 5.191 4.940＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 0.534 0.347 0.023 0.026 4（8.33）2（4.17）1.85 ± 0.26 8.10 ± 0.33 6（6.82）1（1.14）2.17 ± 0.36 6.59 ± 0.37 0.150 0.291-5.430 23.607 0.699 0.590＜ 0.001＜ 0.001

2.4 影響LSS 患者腰椎減壓術后再狹窄的logistic回歸分析 多因素logistic 回歸方程，向后逐步法排除無關變量，最終LSS 椎管重度狹窄、減壓不徹底、高表達VEGF 是LSS 患者腰椎減壓術后再狹窄危險因素（P＜ 0.05，P＜ 0.001），F(xiàn)GF-1 是保護因素（P＜ 0.05）。見表4。

表4 影響LSS 患者腰椎減壓術后再狹窄的多因素logistic 回歸方程Tab.4 Multivariate Logistic regression equation affecting restenosis of lumbar spine after decompression in LSS patients

3 討論

本研究首次證實LSS黃韌帶組織中FGF-1表達下調(diào)，F(xiàn)GF-1 蛋白陽性表達率降低，VEGF 表達明顯上調(diào)，VEGF 蛋白陽性表達率升高，隨著椎管狹窄程度增加FGF-1表達降低，VEGF表達升高，回歸分析結果證實高表達VEGF是LSS患者腰椎減壓術后再狹窄危險因素，F(xiàn)GF-1是保護因素，提示FGF-1表達缺失、VEGF 過表達可能促使黃韌帶肥厚，與LSS腰椎椎管狹窄程度加重以及術后再狹窄有關。

椎管減壓術后因減壓不足、術前腰椎不穩(wěn)定、鄰近節(jié)段腰椎退變等因素導致再狹窄和LSS 復發(fā)［11］。研究顯示［12］LSS患者椎管減壓融合術后病灶復發(fā)率達48.8%。再次手術率為（11.22 ± 4.25）%［13］。若LSS 復發(fā)再次接受手術治療術后疼痛和腰椎功能改善程度明顯差于首次手術［14］。黃韌帶細胞及其周圍組織分泌的多種細胞因子和生長因子在黃韌帶纖維化激活中發(fā)揮不可替代的作用［15］。FGF-1具有抗炎和抗纖維化作用，通過促進TGF-β 受體1降解，減弱TGF-β1 下游Smad 信號通路，抑制肌成纖維細胞分化，減弱肝臟［16］和肺［7］的纖維化。FGF-1 還可抑制核因子-κB 和c-Jun N 端激酶信號通路抑制炎癥反應，降低炎性損傷［17］。本研究發(fā)現(xiàn)FGF-1 表達缺失與LSS 腰椎椎管狹窄程度加重以及術后再狹窄有關，推測可能的機制為：機械拉伸作用下黃韌帶組織中白細胞介素（IL）-6 表達促使黃韌帶組織炎癥，誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉變，導致黃韌帶纖維化和肥大［18］，而FGF-1 可下調(diào)IL-6、IL-8、環(huán)氧化酶2/前列腺素E2的表達，限制機械力誘導的炎癥反應，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉變［19］，緩解纖維化進程。

本研究發(fā)現(xiàn)VEGF 過表達可能促使黃韌帶肥厚，VEGF 可能是腰椎管狹窄癥的發(fā)病機制之一。HUR 等［20］報道也顯示LSS 患者外周血VEGF 水平較非LSS 對照組顯著增高，且與黃韌帶厚度呈正相關，LAKEMEIER 等［21］研究也顯示黃韌帶組織中VEGF 表達增高與MRI 測量的椎間盤黃韌帶橫截斷面積增大有關。分析原因為機械應激和炎癥反應刺激下，VEGF 表達上調(diào)，介導血管新生增加和黃韌帶肥大和纖維化，進而導致腰椎椎管狹窄［20］。VEGF 及其受體VEGFR-1 和VEGFR-2 在椎間盤細胞產(chǎn)生的IL-1、腫瘤壞死因子-α 誘導下表達上調(diào)，有助于LSS 機械應激引起的肥大黃韌帶中血管生成［22］，進而加劇椎管狹窄程度。

本研究局限性在于樣本例數(shù)偏少，可能存在統(tǒng)計學偏倚，其次為單中心研究，可能樣本不具有普遍性，難以直接證實FGF-1、VEGF 與椎間管狹窄程度的關系，仍需擴大樣本例數(shù)，開展大樣本、多中心臨床研究以及基礎研究加以證實。

綜上所述，檢測黃韌帶組織中FGF-1、VEGF表達有助于了解黃韌帶病變情況，評估術后再狹窄風險。FGF-1、VEGF 有望作為LSS 治療的潛在靶點。

【Author contributions】CHEN Yaoxin： Design a research plan，implement the research process，and write a paper.LI Songbo，LIU Xianyin： Propose research ideas，analyze experimental data，and review papers； YE Guobiao，F(xiàn)ANG Guanjun： Implementing the research process，collecting and organizing data，and revising papers； Conduct statistical analysis.