高良姜素促進(jìn)骨質(zhì)疏松模型大鼠骨折愈合的機(jī)制研究Δ

吳永鐵，申雄成[遵義市第一人民醫(yī)院（遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）骨科二病區(qū)，貴州 遵義 563000]

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的常見老年疾病，因其易導(dǎo)致骨脆性增加和骨折的發(fā)生，所以O(shè)P患者的致殘率較高[1]。目前臨床上用來(lái)治療OP 的藥物多以雌激素類藥物為主，但其會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不同程度的副作用[2]。因此，積極開發(fā)新的安全有效、副作用小的抗OP 天然活性成分顯得尤為重要。高良姜素（galangin，Gal）是一種天然的類黃酮化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[3]。Gal可以減緩軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，改善骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在候選藥物[4]。據(jù)報(bào)道，Gal 可誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63 和U-2OS 細(xì)胞的成骨分化[5]。也有報(bào)道稱，Gal可以通過抑制絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞形成，從而有效抑制OP 的發(fā)展[6]。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導(dǎo)的血管生成在骨折愈合中發(fā)揮重要作用。研究表明，HIF-1α/VEGF信號(hào)通路被激活后，HIF-1α活性增強(qiáng)，VEGF表達(dá)升高，可促進(jìn)血管生成，預(yù)防骨質(zhì)流失，最終增強(qiáng)骨折愈合[7—8]。但Gal 是否能通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF 信號(hào)通路促進(jìn)OP 模型大鼠骨折愈合尚不清楚。因此，本研究基于HIF-1α/VEGF信號(hào)通路探討Gal對(duì)OP模型大鼠骨折愈合的影響及可能的作用機(jī)制，以期為臨床治療OP 提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HBS-ScanX 型多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、μCT-100型微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-computed tomography，micro-CT）設(shè)備（丹東奧龍射線儀器集團(tuán)有限公司）、CX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、EPS-300型電泳儀（上海天能科技有限公司）、DW-86L348型超低溫冰箱（青島澳柯瑪股份有限公司）、BSA124S/BSA224S 型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 主要藥品與試劑

Gal對(duì)照品（批號(hào)LA1806，純度≥98%）購(gòu)自北京康瑞納生物科技有限公司；PX-478（HIF-1α/VEGF 信號(hào)通路抑制劑，批號(hào)M00231-CVW）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原交聯(lián)C末端肽（C-terminal telopeptides of type Ⅰ collagen，CTX-Ⅰ）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為E-EL-R0243c 、E-EL-R1456c、E-EL-R0002c）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；蛋白提取試劑盒（批號(hào)YT8951）購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；兔源堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、HIF-1α、VEGF、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一 抗（批 號(hào) 分 別 為ab83259、ab179483、ab214424、ab222783、ab9485）以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（批號(hào)ab6721）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF 級(jí)健康雌性SD 大鼠，共72只，8～10 周齡，體重180～200 g，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（黔）2018-0001。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22 ℃，濕度為55%～60%，12 h 光暗循環(huán)，飼養(yǎng)期間自由攝食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為倫審（2022）-2-08號(hào)。

2 方法

2.1 動(dòng)物建模、分組與給藥

取72 只大鼠分為造模組（n＝60）和假手術(shù)（Sham）組（n＝12）。造模組大鼠采用雙側(cè)卵巢切除手術(shù)構(gòu)建OP大鼠模型，具體操作如下：對(duì)造模組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，卵巢切除后縫合傷口。12 周后利用小動(dòng)物micro-CT 檢測(cè)造模大鼠的腰椎骨密度（bone mineral density，BMD），當(dāng)造模組大鼠BMD與Sham組相比顯著降低時(shí)，即表明OP大鼠造模成功。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，鋼鋸橫向切斷股骨中段，并用克氏針在髓腔內(nèi)固定，縫合切口，以構(gòu)建骨折模型，具體操作參考文獻(xiàn)[9]。Sham組大鼠僅在卵巢周圍結(jié)扎并切除相當(dāng)大小的脂肪組織。將造模成功的60 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成模型（Model）組和Gal低、中、高劑量組以及抑制劑組（HIF-1α/VEGF 信號(hào)通路抑制劑PX-478），每組12 只。Gal 低、中、高劑量組腹腔注射2.5、5、10 mg/kg 的Gal[6]，抑制劑組腹腔注射10 mg/kg 的Gal 和100 mg/kg 的PX-478[10]，Sham 組和Model 組腹腔注射等量生理鹽水；每天1次，連續(xù)90 d。

2.2 大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)分析

各組取6 只大鼠麻醉處死，取出兩側(cè)股骨，漂洗干凈，進(jìn)行micro-CT。使用VGStudio Max 2.2 軟件定量分析，獲得BMD、骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

2.3 大鼠股骨生物力學(xué)檢測(cè)

將“2.2”項(xiàng)下大鼠左側(cè)股骨水平放在跨度為20 mm的測(cè)試儀器的2 個(gè)支撐點(diǎn)上，以10 mm/min 的速率下壓探頭，至股骨中段斷裂，利用儀器自帶軟件分析得到骨生物力學(xué)指標(biāo)最大負(fù)載。

2.4 大鼠骨組織損傷及新生血管情況檢測(cè)

采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察骨組織損傷及新生血管情況。取“2.2”項(xiàng)下大鼠的右側(cè)股骨骨折處骨痂組織，經(jīng)多聚甲醛固定、乙二胺四乙酸脫鈣、梯度乙醇脫水、包埋切片（厚度為5 μm）、脫蠟和水化后進(jìn)行HE 染色，最后在顯微鏡下觀察大鼠骨組織損傷并分析新生血管數(shù)量和面積。

2.5 大鼠股骨中PECAM-1表達(dá)情況檢測(cè)

采用免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠股骨中PECAM-1表達(dá)。取“2.2”項(xiàng)下大鼠左側(cè)股骨，經(jīng)固定、脫鈣、包埋切片（5 μm）、磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后加入PECAM-1 一抗，4 ℃避光孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，室溫下避光孵育1 h，經(jīng)PBS 洗滌、DAPI 避光復(fù)染5 min、封片后，采用熒光顯微鏡觀察并拍攝照片。采用Image J軟件計(jì)算PECAM-1的平均熒光強(qiáng)度。

2.6 大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2含量測(cè)定

采用ELISA 法進(jìn)行檢測(cè)。取每組剩余的6 只大鼠的腹主動(dòng)脈血，以3 000 r/min離心15 min，取上層血清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2的含量。

2.7 大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。麻醉處死“2.6”項(xiàng)下取血后的大鼠，提取其骨痂組織中的總蛋白，通過BCA法測(cè)定總蛋白濃度。將蛋白高溫變性，取120 μg變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓120 V，電泳時(shí)間60 min），轉(zhuǎn)膜（電流250 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60 min），以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入ALP（稀釋比例1∶1 000）、HIF-1α（稀釋比例1∶2 000）、VEGF（稀釋比例1∶1 000）、GAPDH（稀釋比例1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1∶2 000），室溫孵育90 min；洗膜后，采用ECL 發(fā)光顯影。以Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 Gal對(duì)大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal低、中、高劑量組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal 高劑量組比較，抑制劑組大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 各組大鼠股骨Micro-CT結(jié)果

表1 各組大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)的比較（±s，n＝6）

表1 各組大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)的比較（±s，n＝6）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

BMD/（mg/cm3）252.38±24.65 156.31±14.87a 174.08±15.49b 204.31±18.36bc 235.62±19.72bcd 185.93±16.54e Tb.Th/μm 57.96±4.98 43.28±3.51a 46.73±4.68b 51.48±4.73bc 55.93±4.21bcd 46.85±3.94e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組BV/TV/%46.58±3.91 31.74±3.17a 34.56±3.58b 38.94±3.84bc 43.16±3.76bcd 35.89±3.29e Tb.N/（1/mm）3.98±0.75 2.25±0.53a 2.76±0.49b 3.29±0.57bc 3.76±0.61bcd 2.85±0.48e

3.2 Gal對(duì)大鼠股骨生物力學(xué)的影響

與Sham 組[（49.48±3.76） N]比較，Model 組大鼠股骨最大負(fù)載[（23.68±2.59） N]顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal 低、中、高劑量組大鼠股骨最大負(fù)載[分別為（27.36±2.84）、（32.54±3.17）、（37.83±3.69） N]均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal 高劑量組比較，抑制劑組大鼠股骨最大負(fù)載[（28.46±2.75） N]顯著降低（P＜0.05）。

3.3 Gal對(duì)大鼠骨組織病理?yè)p傷的影響

Sham組大鼠骨組織中骨小梁數(shù)量多、較粗、致密分布；與Sham 組比較，Model 組大鼠骨組織中骨小梁數(shù)量減少、變薄、間隙增大、結(jié)構(gòu)較亂和疏松，新生血管數(shù)量和血管面積均顯著減少/減小（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal 低、中、高劑量組大鼠骨組織中骨小梁數(shù)量和厚度明顯改善、間距減小、結(jié)構(gòu)更密集、排列整齊，新生血管數(shù)量和血管面積均顯著增多/增大（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal高劑量組比較，抑制劑組大鼠骨組織中骨小梁數(shù)量減少、變細(xì)、間距增大、結(jié)構(gòu)較為疏松，新生血管數(shù)量和血管面積均顯著減少/減?。≒＜0.05）。結(jié)果見圖2和表2。

圖2 各組大鼠骨組織的HE染色顯微圖

表2 各組大鼠新生血管數(shù)量、血管面積和PECAM-1表達(dá)的比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠新生血管數(shù)量、血管面積和PECAM-1表達(dá)的比較（±s，n＝6）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

血管面積/μm2 6 987.42±418.71 2 346.58±276.39a 2 965.90±293.46b 3 817.94±323.18bc 5 352.64±358.76bcd 2 649.38±287.41e PECAM-1平均熒光強(qiáng)度21.36±1.65 3.21±0.46a 7.58±0.62b 12.96±1.28bc 19.21±1.57bcd 5.23±0.64e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組新生血管數(shù)量/個(gè)19.04±1.37 7.68±0.98a 9.84±1.02b 12.79±1.13bc 15.94±1.25bcd 10.43±1.10e

3.4 Gal對(duì)大鼠股骨中PECAM-1表達(dá)的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠股骨中PECAM-1 平均熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal低、中、高劑量組大鼠股骨中PECAM-1平均熒光強(qiáng)度均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal高劑量組比較，抑制劑組大鼠股骨中PECAM-1 平均熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表2。

圖3 各組大鼠股骨中PECAM-1表達(dá)的免疫熒光圖

3.5 Gal 對(duì)大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2 含量的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠血清中OCN、BMP-2含量均顯著降低（P＜0.05），CTX-Ⅰ含量顯著升高（P＜0.05）；與Model組比較，Gal低、中、高劑量組大鼠血清中OCN、BMP-2 含量均顯著升高（P＜0.05），CTX-Ⅰ含量均顯著降低（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal 高劑量組比較，抑制劑組大鼠血清中OCN、BMP-2含量均顯著降低（P＜0.05），CTX-Ⅰ含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2含量的比較（±s，n＝6，ng/mL）

表3 各組大鼠血清中OCN、CTX-Ⅰ、BMP-2含量的比較（±s，n＝6，ng/mL）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

BMP-2 15.64±2.68 5.23±1.27a 7.11±1.45b 9.86±1.64bc 12.34±1.98bcd 8.23±1.47e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組OCN 19.14±3.85 8.43±1.63a 10.45±2.07b 13.56±2.31bc 15.87±2.68bcd 11.54±2.37e CTX-Ⅰ27.58±3.21 42.83±4.87a 39.14±4.52b 35.21±3.65bc 31.45±3.43bcd 40.56±4.37e

3.6 Gal 對(duì)大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)的影響

與Sham 組比較，Model 組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Gal 低、中、高劑量組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），且具有明顯的劑量依賴性；與Gal高劑量組比較，抑制劑組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表4。

圖4 各組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 各組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠骨痂組織中ALP、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝6）

a：與Sham組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Gal低劑量組比較，P＜0.05；d：與Gal中劑量組比較，P＜0.05；e：與Gal高劑量組比較，P＜0.05。

VEGF/GAPDH 1.67±0.18 0.29±0.03a 0.60±0.07b 0.94±0.08bc 1.42±0.13bcd 0.37±0.04e組別Sham組Model組Gal低劑量組Gal中劑量組Gal高劑量組抑制劑組ALP/GAPDH 1.86±0.21 0.31±0.02a 0.67±0.07b 1.15±0.10bc 1.65±0.15bcd 0.72±0.09e HIF-1α/GAPDH 1.47±0.12 0.36±0.04a 0.69±0.08b 1.08±0.10bc 1.35±0.12bcd 0.53±0.05e

4 討論

OP是全身性代謝性骨病，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率在逐漸升高，尤其在絕經(jīng)后的女性中表現(xiàn)得更加明顯；OP 與骨痂形成、骨生長(zhǎng)減少、骨密度降低、生物力學(xué)強(qiáng)度降低以及骨折愈合過程中細(xì)胞分化延遲有關(guān)[1—2]。因此，積極探索安全有效的促進(jìn)骨折愈合的藥物對(duì)臨床治療OP具有重要意義。本研究采用雙側(cè)卵巢切除手術(shù)構(gòu)建OP 大鼠模型，對(duì)其進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Model 組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均降低，股骨顯微結(jié)構(gòu)顯著受損，最大負(fù)載顯著下降，生物力學(xué)強(qiáng)度降低，與前人研究結(jié)果一致[9]，提示OP模型大鼠構(gòu)建成功。

黃酮類化合物作為一大類天然化合物，普遍存在于食物和植物中，并且可通過調(diào)節(jié)不同途徑來(lái)影響OP。例如蘆丁通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路，抑制絕經(jīng)后的OP[11]；槲皮素通過G 蛋白偶聯(lián)受體C族6成員A/AMP活化蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝來(lái)減輕小鼠睪丸切除術(shù)后的OP[12]。Gal 是一種天然黃酮類化合物，也是高良姜的主要活性成分，因其對(duì)骨骼相關(guān)疾病顯示出良好的藥理活性而備受關(guān)注。Gal通過減弱NFκB受體激活蛋白配體活性，誘導(dǎo)Jun激酶和NF-κB途徑的激活，進(jìn)而防止破骨細(xì)胞前體和膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型小鼠的骨破壞[13]。Gal可上調(diào)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞中早期成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物（即ALP、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 蛋白、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix）以及晚期成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物（Ⅰ型膠原α1鏈蛋白、骨橋蛋白和OCN）的mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[14]。Gal通過激活富含脯氨酸/精氨酸的亮氨酸末端重復(fù)蛋白，在體內(nèi)外顯著改善骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[4]。Li 等[6]研究還表明，Gal 可通過調(diào)節(jié)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和NF-κB 途徑，抑制破骨形成來(lái)抑制OP。但目前Gal 對(duì)OP 模型大鼠骨折愈合的影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，Gal 可減輕OP 模型大鼠股骨顯微結(jié)構(gòu)損傷，提高骨密度，增加最大負(fù)載，改善骨生物力學(xué)性能，升高血清中OCN 和BMP-2 含量，上調(diào)ALP 蛋白表達(dá)，并降低CTX-Ⅰ含量。ALP可在一定程度上反映細(xì)胞礦化及成骨分化的能力[14]。OCN是骨中最豐富的非膠原蛋白，也是成骨分化過程中晚期階段的標(biāo)志性物質(zhì)，在成骨細(xì)胞中特異性表達(dá)，維持骨重建、吸收和礦化[15]。BMP-2 參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，是軟骨和骨形成的主要誘導(dǎo)因子[15]。CTX-Ⅰ是骨Ⅰ型膠原的降解產(chǎn)物，可作為骨吸收的標(biāo)志物[15]。這提示，Gal可能是通過調(diào)節(jié)骨代謝，抑制去卵巢OP模型大鼠骨流失，促進(jìn)骨折愈合，從而發(fā)揮抗大鼠OP的作用。

骨是一種高度血管化的組織，其廣泛的血管和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，可為骨的形成和發(fā)育提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)，血管生成在OP過程中起著至關(guān)重要的作用[16]。骨微環(huán)境中的血管生成是骨骼生長(zhǎng)發(fā)育、骨折后修復(fù)和維持骨骼健康所必需的，OP 或骨質(zhì)減少患者的血液供應(yīng)量相對(duì)低于骨量正常的人，表明骨血液供應(yīng)與骨礦物質(zhì)密度高度相關(guān)[17]。因此，激活骨微環(huán)境中的血管生成可能是預(yù)防OP的重要策略。HIF1-α信號(hào)通路的激活增加了骨血管的形成，并參與了骨重塑；成骨細(xì)胞中HIF1-α基因的敲除導(dǎo)致骨血管化和成骨減少；成骨細(xì)胞中HIF1-α信號(hào)通路的激活不僅可以抑制雌激素缺乏引起的骨質(zhì)流失，還可以促進(jìn)骨形成和血管生成[18—19]。VEGF是HIF1-α的下游基因，成骨細(xì)胞分化過程中VEGF 的表達(dá)增加，可促進(jìn)血管生成、骨形成和重塑[18—19]。PECAM-1廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，主要參與血管形成等生理活動(dòng)，可作為評(píng)估血管形成的標(biāo)記分子[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在OP模型大鼠中PECAM-1、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)降低，OP 模型大鼠的血管數(shù)量和血管面積也顯著減少/減??；Gal 可促進(jìn)PECAM-1、HIF-1α 和VEGF 蛋白表達(dá)，增加血管數(shù)量和血管面積。而使用HIF1-α/VEGF 信號(hào)通路抑制劑后，大鼠血管數(shù)量和血管面積減少，減弱了Gal對(duì)OP模型大鼠的骨折愈合促進(jìn)作用。這提示，Gal可通過HIF1-α/VEGF 信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝，改善OP 模型大鼠骨密度，促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，Gal 可調(diào)節(jié)骨代謝，改善OP 模型大鼠骨密度，促進(jìn)骨折愈合；其作用機(jī)制可能與激活HIF1-α/VEGF 信號(hào)通路，促進(jìn)血管生成有關(guān)。然而本研究尚存在不足之處，僅驗(yàn)證了Gal對(duì)HIF1-α/VEGF信號(hào)通路的作用，未對(duì)其他靶點(diǎn)、途徑進(jìn)行驗(yàn)證，后續(xù)研究將會(huì)進(jìn)一步明確Gal在OP中的作用機(jī)制。